Объемное образование молочной железы: Карта сайта

Содержание

Узлы в молочной железе (узловые образования в молочной железе)

(рис. 1) . Альтернативно, снижение связывания (и последующее накопление РНК-связывающего белка Gld-1) приводит к тому, что стволовые клетки зародышевой линии подвергаются мейозу [11] (рис. 1). Более того, диффундирующие факторы, такие как обнаруженные в сигнальном пути Wnt, влияют на развитие клеток дистальных кончиков. Потеря функции pop-1 и sys-1 ( C. elegans гомологов Tcf млекопитающих и β -катенина, соответственно) приводит к снижению продукции клеток дистальной верхушки, что способствует мейотическому делению дифференцированными зародышевыми клетками . С.elegans [12]. Подобные события, подчеркивающие важность физического контакта и факторов диффузии тканевого микроокружения в поддержании и регуляции стволовых клеток зародышевой линии, также были хорошо задокументированы у D. melanogaster [9, 13, 14].

3. Структура молочной железы

Молочная железа мыши является надежной моделью для изучения влияния тканевого микроокружения на стволовые клетки/клетки-предшественники. Было обнаружено, что функциональная молочная железа мыши может быть регенерирована всего из одной клетки-предшественника молочной железы [15, 16], в дополнение к регенерации любой части самой железы [17, 18].Эта характеристика ниши не меняется со временем и не зависит от репродуктивного анамнеза [19]. Следовательно, вполне вероятно, что стволовые/прогениторные клетки молочной железы сохраняются в микроокружении молочной железы на протяжении всей жизни.

Молочная железа состоит из двух тканевых компартментов, разделенных базальной мембраной: эпителия, включающего протоки и дольки, и стромы, состоящей из соединительной ткани, образующей жировую ткань молочной железы [20].В нелактирующей взрослой груди строма занимает ту большую часть ткани, где доля фиброзной и жировой ткани меняется с возрастом [21]. Внутри стромы ткань молочной железы состоит из сложной сети долек и молочных протоков, а также жира. Дольки молочной железы, состоящие из групп альвеол (также называемых ацинусами или терминальными протоками), представляют собой железистые структуры сферической формы, которые производят молоко [21]. Внутри альвеол можно обнаружить один слой просветных эпителиальных клеток, окружающих внутренний просвет [22].Рядом с люминальными клетками существует слой миоэпителиальных клеток, ответственных за отложение белков базальной мембраны, а также обеспечивающих сократительные движения во время секреции молока [23, 24]. Во время беременности эпителиальные клетки альвеол подвергаются экстенсивной пролиферации, что приводит к увеличению количества альвеолярных единиц и, следовательно, увеличению размера и количества долек [21]. Молоко, вырабатываемое дольками молочной железы, затем дренируется разветвленной сетью протоков, по которым молоко переносится из долек к соскам во время лактации [25].Протоки, которые дренируют отдельные альвеолы, ведут к постепенно увеличивающимся протокам, которые соединяются с соском [21, 22]. В области соска протоки расширяются, образуя млечные синусы. Затем синусы заканчиваются конусообразными ампулами непосредственно под поверхностью соска [21].

4. Факторы, которые регулируют и поддерживают молочную нишу

Было показано, что весь функциональный эпителиальный отросток молочной железы может состоять из потомства одной клетки [16]. Эти компоненты, клетки-предшественники, базальная мембрана и внеклеточный матрикс, являются основными функциональными единицами тканевого микроокружения.Эти структуры вместе с межклеточными коммуникациями и растворимыми факторами создают функциональную сигнальную нишу, которая направляет клеточную активность через прямой контакт или через паракринную передачу сигналов (Рис. 2). Микроокружение молочной железы представляет собой сложную сеть внутриклеточных коммуникаций между клетками просвета, базальными клетками и стромой [26]. В дополнение к гормонам, необходимым для развития молочных протоков и долек (эстроген и прогестерон), множество других факторов составляют нишу молочной железы, включая физические факторы, такие как межклеточный контакт, и диффузионные факторы, такие как гормоны и цитокины.


5. Клеточные компоненты

Молочная железа и окружающая ее строма состоят из различных типов клеток, составляющих микроокружение молочной железы. Клетки, составляющие нишу молочной железы, включают эпителиальные клетки, адипоциты, фибробласты, эндотелиальные клетки, нервные клетки и лимфоидные клетки. Подсчитано, что эти клетки либо являются поддерживающими клетками, либо играют роль в секретировании растворимых факторов, либо регулируются развитием молочной железы [27-29].Было показано, что макрофаги и, возможно, их сигналы необходимы для развития протоков, а также для поддержки функции стволовых клеток молочной железы (рис. 2) [30, 31]. В отсутствие макрофагов или колониестимулирующего фактора-1 (CSF-1) функция стволовых клеток молочной железы, включая потенциал роста и способность к регенерации, серьезно нарушена [30]. Макрофаги, эозинофилы и их соответствующие цитокины, включая CSF-1 и эотаксин, необходимы для формирования терминальных зачатков. Эти клетки также обнаруживаются вблизи ацинусов молочной железы во время беременности и лактации [32].Ландскронер-Эйгер и др. и Кулдри и др. обнаружили, что адипоциты необходимы для формирования протоков молочных желез в период полового созревания (рис. 2) [33, 34]. Кроме того, было обнаружено, что адипоциты поддерживают альвеолярные зачатки, формирующиеся во время беременности [33]. В отсутствие адипоцитов формируются рудиментарные структуры в молочной железе, но ветвления протоков не происходит [34]. Наконец, было обнаружено, что стромальные фибробласты влияют на морфогенез эпителиальных клеток молочной железы человека (рис. 2) [35].

6. Диффундирующие факторы
6.1. Гормоны и их рецепторы

В молочной железе обычно находятся два основных гормона, которые необходимы для нормального развития молочной железы: эстроген и прогестерон (рис. 2). В период полового созревания развитие протоков обусловлено преимущественно эстрогеном [20]. У зрелых девственниц прогестерон регулирует боковое разветвление протоков, в то время как пролактин, прогестерон, плацентарные лактогены и ErbB4 инициируют формирование альвеолярных зачатков во время беременности [20].Во время лактации пролактин и ErbB4 обычно стимулируют выработку молока [20].

Кроме того, рецепторы гормонов, рецептор эстрогена (ER) и рецептор прогестерона (PR), необходимы для развития молочной железы. В частности, ER- α преимущественно экспрессируется в клетках просвета, но также может быть обнаружен в ядрах эпителиальных клеток протоков (рис. 2) [21]. ER- α обычно не экспрессируется в миоэпителиальных клетках [21]. Большинство ER- α -позитивных клеток являются негативными по Ki-67 во время пременопаузы, что свидетельствует о том, что большинство ER- α -позитивных клеток не подвергаются пролиферации в течение этого времени.Однако с возрастом женщины количество ER- α -позитивных клеток, подвергающихся пролиферации, увеличивается, в конечном итоге достигая плато после менопаузы [21]. Потеря ER- α связана с нарушением ветвления и удлинения протоков молочной железы [36, 37]. Также известно, что второй рецептор эстрогена, ER-β, экспрессируется в молочной железе. ER- β экспрессируется в эпителиальных клетках протоков и долек, а также в миоэпителиальных клетках и клетках стромы.

PR экспрессируется в просветных эпителиальных клетках протоков и долек (рис. 2). Данные показали, что образование как PR-позитивных, так и PR-негативных клеток опосредовано прогестероном [36]. Однако, в отличие от ER- α , PR не зависит от стадии менструации [21]. В модели мышей с мутацией PR -/- (где транскрипция как A, так и B форм PR нарушена) развитие секреторных альвеол нарушено [36, 37].

Рецепторы эстрогена, в частности, опосредованы членом семейства эпидермальных факторов роста амфирегулином (рис. 2) [37, 38].Амфирегулин, гепарин-связывающий, гликозилированный белок, необходим для развития протоков и терминальных зачатков [39]. В молочных железах млекопитающих в период полового созревания амфирегулин экспрессируется в миоэпителиальных клетках, люминальных клетках и колпачковых клетках, расположенных в терминальной концевой почке [39].

6.2. Cytokines

В поддержании клеток-предшественников молочных желез участвуют два основных пути передачи сигналов цитокинов: RANKL и Wnt/ β -catenin. Wnt4, в частности, является ключевым фактором, который опосредует прогестерон и, таким образом, боковое ветвление молочной железы (рис. 2) [40].Кроме того, добавление белка Wnt3A к стволовым клеткам молочных желез в культуре приводит к размножению стволовых клеток в последующих поколениях (рис. 2) [41]. При трансплантации стволовые клетки, обработанные белком Wnt3A, демонстрировали устойчивый рост по сравнению с имплантированными необработанными стволовыми клетками молочной железы [41]. С другой стороны, было показано, что активатор рецептора ядерного фактора- κβ лиганда (RANKL) опосредует пролиферативный ответ эпителия молочной железы мышей на прогестерон во время лактационного морфогенеза молочной железы (рис. 2) [42].Кроме того, Фата и соавт. показали, что молочные железы RANK- и RANKL-дефицитных мышей демонстрируют нормальное развитие желез во время полового созревания, но не формируют лобулоальвеолярные структуры во время беременности [43]. Кроме того, было обнаружено, что RANKL увеличивает пролиферацию дочерних клеток, которые образуются после асимметричного деления стволовых клеток [44, 45].

6.3. Факторы роста

В молочной железе суперсемейство трансформирующего фактора роста β (TGF- β ) играет решающую роль в развитии железы.Три лиганда TGF- β , TGF- β 1, TGF- β 2 и TGF- β 3 передают сигнал через рецепторы TGF- β типа I и II. Фосфорилирование рецепторов приводит к передаче сигналов через один из четырех основных путей: сигнальный путь Smad и PI3-киназу, а также пути TAK1 и RhoA [46]. Изоформы TGF- β , в частности, помогают поддерживать тканевой гомеостаз в концевых зачатках и протоках молочных желез путем ограничения клеточной пролиферации (Рис. 2) [47].Было обнаружено, что отсроченное формирование протоков связано со сверхэкспрессией TGF- β 1 [47]. Кроме того, было замечено увеличение экспрессии TGF- β во время беременности [48]. Наконец, было обнаружено, что TGF- β 1, TGF- β 2 и особенно TGF- β 3 увеличивают экспрессию во время инволюции, что указывает на роль в железистом апоптозе [49].

TGF- β также является основным индуктором эпителиально-мезенхимального перехода (ЭМП).Во время ЭМП утрачивается клеточная экспрессия белков, участвующих в адгезии [50]. Одновременно эти клетки теряют все характеристики, относящиеся к эпителиальному фенотипу [50]. С другой стороны, клетки, подвергшиеся EMT, обнаруживают повышенную экспрессию мезенхимальных белков, таких как α-гладкомышечный актин и виментин [50]. В результате эти клетки проявляют повышенную способность к миграции. Клетки, которые обычно подвергаются EMT, включают клетки-предшественники и опухолевые клетки [51, 52]. TGF- β , в частности, является мощным индуктором Snail1, который, в свою очередь, увеличивает экспрессию провоспалительных интерлейкинов, таких как интерлейкин 6 (IL-6) [53].Повышенные уровни в сыворотке IL-6, плейотропного цитокина, коррелируют с поздней стадией опухоли молочной железы, метастазированием и плохим прогнозом [54]. Было показано, что клетки метастатического рака молочной железы MCF7 конститутивно экспрессируют IL-6, что связано с повышенной экспрессией Snail1 и Twist1 и проявляют фенотип EMT [55].

Другие индукторы развития молочной железы, влияющие на микроокружение молочной железы, включают преобразователь сигнала и активатор транскрипции-5a (STAT5a), STAT5b и семейство факторов роста эпидермального фактора роста (EGF) и их рецепторы.И STAT5a, и STAT5b передают сигнал через рецептор пролактина, чтобы контролировать пролиферацию и дифференцировку молочной железы (рис. 2) [20]. Было обнаружено, что инактивация STAT 5a приводит к нарушению лактации, хотя пролиферация и расширение альвеолярного компартмента происходили практически нормально [20]. Кроме того, семейство факторов роста и рецепторов EGF, амфирегулин и трансформирующий фактор роста- α [26] экспрессируются во время постнатального развития молочной железы.Амфирегулин, как упоминалось ранее, необходим для развития протоков и образования концевых зачатков [38]. Экспрессия трансформирующего фактора роста- α была обнаружена в пролиферирующей шапке клеток концевых зачатков (рис. 2) [56]. EGF необходим для пролиферации и дифференцировки клеток молочной железы (рис. 2) [56]. Многие рецепторы семейства EGF, рецептор EGF, erbB1, erbB2, erbB3 и erbB4, экспрессируются либо у девственных самок, либо во время беременности, либо во время лактации [26].

Другим важным сигналом в микроокружении молочной железы является производный от стромы фактор инсулиноподобного фактора роста (IGF). IGF является важным фактором роста молочной железы, регулирующим гормональный контроль роста протоков (рис. 2) [57]. Было обнаружено, что у мышей с нулевым IGF-1 снижен рост протоков и образование концевых зачатков, что свидетельствует о том, что IGF-1 необходим для ветвления протоков и продукции концевых зачатков в развивающихся молочных железах [58]. Кроме того, было обнаружено, что ИФР-1, а также ИФР-2 регулируют экспрессию эстрогена, прогестерона, пролактина и гормона роста в молочной железе (рис. 2) [57].IGF-1 и эстроген действуют как митогены в развитии нормальной молочной железы. Повышенная экспрессия IGF-1 и эстрогена приводит к увеличению пролиферации эпителиальных клеток молочной железы [59]. Кроме того, было обнаружено, что IGF-1 осуществляет контроль факторов роста как аутокринный, паракринный и эндокринный регуляторный сигнал [57]. И IGF-1, и IGF-2 экспрессируются в концевых зачатках и строме молочной железы. IGF-1 опосредует альвеолярное отпочкование и пролиферацию во время беременности [60]. Повышенные уровни циркулирующего ИФР-1 приводят к ускоренному росту молочных желез [57].Таким образом, ИФР-1 является необходимым фактором для развития молочной железы.

7.
β 1 Интегрин как ключевой регулятор регенерации и развития молочной железы

Микроокружение молочной железы также может влиять на поведение эпителиальных клеток, изменяя состав внеклеточного матрикса. В частности, внеклеточный матрикс влияет на сигнальные пути интегринов, которые, как было показано, играют основную роль во время клеточного роста и дифференцировки.

Интегрины представляют собой тип рецептора, который обеспечивает взаимодействие с внеклеточным матриксом [61].Кроме того, интегрины участвуют в подвижности клеток и в определении клеточной формы. Интегрины представляют собой трансмембранные гетеродимеры, состоящие из двух нековалентно связанных субъединиц гликопротеина α и β . После связывания со своим лигандом интегрины активируют внутриклеточные сигнальные пути, такие как MAP-киназный путь [61]. В частности, гетеродимеры интегрина β 1 важны для различных клеточных функций, включая развитие кожи, волос, нервов и хондроцитов [62–64].Кроме того, интегрин β 1 участвует в пролиферации, выживании и дифференцировке эпителиальных клеток молочных желез [65, 66]. Недавние сообщения показали, что удаление гена интегрина β 1 приводит к замедлению роста молочной железы и изменению развития лобулоальвеол и паттерна ветвления протоков [67]. Более того, было обнаружено, что интегрин β 1 играет критическую роль в альвеолярном развитии железистого эпителия и необходим для дифференцировки эпителиальных клеток молочных желез [68].Таким образом, эти данные свидетельствуют о том, что интегрин β 1 является ключевым регулятором активности стволовых/прогениторных клеток молочных желез.

Для дальнейшего изучения того, требуется ли интегрин β 1 для поддержания стволовых клеток молочной железы, а также для развития альвеол, эпителиальные/прогениторные клетки молочной железы выделяли из мышей Itg β 1 fx/fx , CreER δ и обрабатывали 4-ОН-тамоксифеном (Bussard, неопубликованные данные). Добавление тамоксифена приведет к диссоциации CreER δ от Hsp90, что позволит CreER δ переместиться в ядро, а также разрезать и удалить ген интегрина β 1 floxed β 1 (рис. 3).Это событие происходит в эпителиальных/прогениторных клетках молочной железы, а также в любой клетке, содержащей комплекс CreER δ /Hsp90 в эпителии молочной железы, и позволяет определить важность гена в развитии молочной железы. В имплантатах первого поколения рост желез отсутствовал в 89% молочных желез, лишенных эпителия молочной железы, которые были имплантированы Itg β 1 fx/fx , эпителиальные клетки молочной железы CreER, обработанные 4-OH-тамоксифеном (таблица 1) (Бассард, неопубликованные данные).Эти результаты позволяют предположить, что интегрин β 1 необходим для поддержания стволовых клеток молочной железы и развития молочной железы. В имплантатах второго поколения железистый рост присутствовал в ~ 60% наростов (таблица 2) (Bussard, неопубликованные данные). Мышей, которым имплантировали клетки эпителия молочной железы Itg β 1 fx/fx , CreER, обработанные 4-OH-тамоксифеном, дополнительно скрещивали для изучения роли интегрина β 1 в развитии молочной железы во время беременности.Подобно имплантатам второго поколения, железистый рост присутствовал в ~ 60% наростов (таблица 2) (Bussard, неопубликованные данные). Эти данные в сочетании с аналогичными результатами, полученными для ранее описанных небеременных имплантатов второго поколения, позволяют предположить, что удаление интегрина β 1 в эпителии приводит к снижению эффективности роста. Необходима дополнительная работа, чтобы полностью выяснить роль интегрина β 1 в развитии молочной железы.


№инокулированных клеток Необработанные (контроль) лечение тамоксифеном

91 831
50000 91 831 2/4 1/4
100000 91 831 1/2 0/4
500000 1/1 0/1

Итого 4/7 1/9


Состояние четности Необработанные (контроль) получавшие тамоксифен

небеременных 9/12 7/12
Беременные 13 /16 10/18

8.Контроль микросреды молочной железы клеток-предшественников

Какие факторы микроокружения молочной железы, в частности, влияют на судьбу клеток-предшественников/эпителиальных клеток? Скорее всего, существует комбинация межклеточных, клеточно-растворимых факторов и межклеточных взаимодействий с внеклеточным матриксом, которые имеют место как для поддержания, так и для дифференцировки клеток-предшественников [69, 70]. Чтобы решить этот технически сложный вопрос, Labarge et al. недавно разработали интересную технологию, использующую микрочипы белков микроокружения для идентификации комбинаций белков молочной железы и молекул из внеклеточного матрикса, которые влияли на судьбы клеток-предшественников молочной железы [71].Сообщалось, что jagged1 поддерживает пул клеток-предшественников [71]. Кроме того, было обнаружено, что laminin1 поддерживает клетки-предшественники молочной железы в состоянии покоя [71]. Для дифференцировки в миоэпителиальные клетки исследователи обнаружили, что экспрессия Р-кадгерина в микроокружении молочной железы ведет к дифференцировке клеток-предшественников в базальные клетки [71]. С другой стороны, было обнаружено, что межклеточный контакт, или экспрессия E-cadherin, способствует дифференцировке клеток-предшественников в эпителиальные клетки просвета [71].Т.о., эти результаты указывают на то, что экспрессия специфических белков в тканевом микроокружении может обеспечивать судьбу клеток-предшественников.

9. Notch, амфирегулин или сигнальные пути Hedgehog могут опосредовать клеточную судьбу стволовых клеток/клеток-предшественников

Недавние исследования показали, что такие факторы, как Notch, амфирегулин или сигнальные пути Hedgehog, ответственны за развитие желез разветвленное жировое тело молочной железы. Амфирегулин, как обсуждалось ранее, является членом семейства эпидермальных факторов роста и регулирует морфогенез молочной железы посредством паракринной активации рецептора эпидермального фактора роста [72].В экспериментах, проведенных Booth et al., экспрессия амфирегулина была подавлена ​​в линии бессмертных эпителиальных клеток молочной железы с характеристиками стволовых клеток с помощью siRNAs [72]. Данные показали, что амфирегулин не только контролирует удлинение протоков, но также опосредует самообновление клеток-предшественников [72]. Сообщалось, что в дополнение к амфирегулину Notch регулирует судьбу стволовых/прогениторных клеток молочных желез. При исследовании в культуре маммосфер было обнаружено, что синтетический пептид, полученный из домена Delta-Serrate-LAG 2 (DSL), который консервативен во всех лигандах Notch, способствует самообновлению стволовых клеток, а также регулируемой асимметричной клетке-предшественнику. подразделение [73].Было обнаружено, что на более поздних стадиях развития молочной железы тот же пептид DSL способствует развитию миоэпителиальных клеток [73]. Пептид DSL не влияет на полностью дифференцированные эпителиальные клетки молочных желез, что указывает на то, что эффекты пептида, полученного из Notch, ограничены ранними клетками-предшественниками молочных желез [73].

Наконец, в дополнение к амфирегулину и Notch было обнаружено, что члены сигнального пути Hedgehog и Bmi-1 регулируют самообновление стволовых клеток молочной железы.Было обнаружено, что передача сигналов Hedgehog, которая включает гены PTCh2, Gli1 , Gli2 и Bmi-1, , увеличивает количество инициирующих маммосферу клеток, а также увеличивает размер маммосферы [74]. При дальнейшем исследовании было обнаружено, что более высокие концентрации этих генов были экспрессированы в клетках-предшественниках молочных желез, тогда как их концентрации были снижены в более дифференцированных клетках [74]. Более того, было обнаружено, что белки Sonic Hedgehog и Indian Hedgehog экспрессируются в более дифференцированном эпителии молочной железы [75, 76], тогда как экспрессия Desert Hedgehog выше в концевых зачатках по сравнению со стромой молочной железы [77].Кроме того, было обнаружено, что белок Gli2 экспрессируется в строме, окружающей протоки молочной железы, а также в концевых зачатках [78]. Gli3, с другой стороны, расположен в более дифференцированном эпителии и строме молочной железы [79]. Белки семейства Hedgehog регулируют несколько фаз развития молочной железы, включая развитие протоков и лактацию [80]. Эти результаты указывают на то, что в дополнение к амфирегулину и Notch члены сигнального пути Hedgehog играют роль в регуляции и самообновлении клеток-предшественников молочных желез.

В качестве прямого примера микроокружения, контролирующего клетки-предшественники, наша лаборатория недавно продемонстрировала, что микроокружение молочной железы мыши может перенаправлять клетки взрослых мышей немаммарного происхождения на расширение и дифференцировку в эпителиальные клетки молочной железы во время регенерации желез in vivo [81 , 82]. Было обнаружено, что как взрослые тестикулярные клетки, так и добросовестные нейральные стволовые клетки могут быть перепрограммированы молочной железой мыши, чтобы они вели себя как эпителиальные клетки молочной железы [81, 82].Для взрослых клеток яичка смесь 10% сперматогоний типов A и B, 28% клеток Сертоли и 62% дифференцирующихся сперматоцитов, выделенных из семенных канатиков взрослых самцов мышей WAP-Cre/Rosa26R, имплантировали с эпителиальными клетками самок молочной железы в свободная от эпителия жировая подушка трехнедельных самок бестимусных голых мышей. Шесть-восемь недель спустя мышей спаривали, доводили до полного срока беременности и впоследствии подвергали эвтаназии. Собирали железы и исследовали на наличие маркеров клеток молочной железы казеина (молоко) и кератина 5 (маркер миоэпителиальных клеток), которые были обнаружены среди потомства инокулированных мужских клеток [81].Кроме того, флуоресцентная гибридизация in situ показала, что как мужские (сперматогенные, Y-хромосома), так и женские (молочные железы, двойная X-хромосома) клетки соседствуют друг с другом и присутствуют в одном и том же ацинусе [81]. Эти результаты наблюдались как в первом, так и во втором поколении трансплантатов, и показали, что мужские клетки-предшественники способствовали формированию функциональной женской молочной железы. Аналогичный подход был применен для изучения того, может ли микроокружение молочной железы перепрограммировать эмбриональные и взрослые нейральные стволовые клетки, выделенные и размноженные в селективной среде для нейральных стволовых клеток, в качестве добросовестных нейральных стволовых клеток.По сравнению с клетками яичка, было замечено, что нейральные стволовые клетки WAP-Cre/Rosa26 R также могут быть перенаправлены на экспрессию маркера эпителиальных клеток молочной железы казеина (молоко) [82]. Эти результаты, в дополнение к результатам, обсуждаемым Bussard et al. [83], демонстрируют, что поведение стволовых клеток/клеток-предшественников зависит от микроокружения, в котором они находятся, указывая на доминирование тканеспецифичной ниши над судьбой клеток-предшественников.

10. Микроокружение и рак

Появляется все больше данных, свидетельствующих о том, что тканевое микроокружение также может регулировать злокачественный фенотип опухолей.Начиная с 1975 г. Mintz и Illmensee вводили клетки эмбриональной карциномы либо подкожно мышам, либо в бластоцисты, которые впоследствии имплантировали псевдобеременным хозяевам [84]. Тератокарциномы образуются у мышей, которым непосредственно инокулировали клетки эмбриональной карциномы. Однако, когда клетки эмбриональной карциномы инокулировали в бластоцисты и имплантировали беременным хозяевам, были получены «нормальные» химерные мыши без развития опухоли [84]. Кроме того, онкогенный вирус, вирус саркомы Рауса, вызывает агрессивные опухоли при введении непосредственно в крылья цыплят [85].Однако, когда куриные эмбрионы были инфицированы in ovo меченым pp 60src (нерецепторная протеинтирозинкиназа, которая опосредует активность вируса саркомы Рауса), опухоли не образовывались, хотя вирус экспрессировался в большинстве клеток инфицированных эмбрионов. [86]. При выращивании в культуре клетки этих эмбрионов образовывали опухоли [86]. Эти исследования показывают, что «нормальное» тканевое микроокружение доминирует над опухолевым образованием. Совсем недавно Фельшер продемонстрировал, что добросовестные онкогены являются туморогенными только в определенных клеточных линиях [87].Фельшер обнаружил, что для того, чтобы стать туморогенным, онкоген должен находиться в среде, благоприятной для развития опухоли [87]. Таким образом, если бы условия не благоприятствовали онкогенезу, опухоль не росла бы. В другом исследовании Hochedlinger et al. использовали ядерную трансплантацию для введения ядер злокачественных раковых клеток в энуклеированные ооциты, которые впоследствии использовали для получения химерных мышей [88]. Несмотря на то, что мыши имели предрасположенность к онкогенному фенотипу, большинство их тканей были нормальными; регулируется «нормальным», неопухолевым микроокружением энуклеированного ооцита [88].

Дополнительно установлено, что тканевая микросреда играет ключевую роль в развитии рака и метастазировании. При исследовании экспрессии генов во время опухолевой прогрессии в молочной железе было обнаружено, что обширные изменения экспрессии генов происходят в опухолеассоциированной строме, включая повышение экспрессии MMP2, MMP11 и MMP14 при переходе от преинвазивного к инвазивному фенотипу [89]. ]. Кроме того, клетки рака молочной железы с метастазами в кости используют нативные костные клетки, такие как остеобласты, для увеличения выработки ими воспалительных цитокинов IL-6, MCP-1, VEGF, MIP-2 (человеческий IL-8) и KC (человеческий GRO-). α ) [90].Эти результаты предполагают, что (1) микроокружение опухоли играет роль в онкогенезе до инвазии опухолевых клеток в строму и что (2) раковые клетки кооптируют нормальные клетки микроокружения, чтобы облегчить колонизацию раковых клеток. Таким образом, клеточное микроокружение больше не может рассматриваться как невинный наблюдатель прогрессии опухоли.

Несколько недавних исследований, в частности, непосредственно изучали взаимодействие раковых клеток с микроокружением. В одном эксперименте Booth et al.исследовали, могут ли клетки, трансформированные канцерогенным вирусом опухоли молочной железы мыши (MMTV-) neu, направляться микроокружением нормальной молочной железы мыши для участия в развитии функциональной молочной железы [91]. Чтобы изучить этот вопрос, клетки MMTV-neu были собраны из опухолей WAP-Cre/Rosa26R/MMTV-neu, смешаны с первичными эпителиальными клетками молочной железы дикого типа и впоследствии инокулированы в лишенные эпителия жировые подушечки самок бестимусных голых мышей. [91]. Было обнаружено, что при смешивании с эпителиальными клетками молочной железы дикого типа из первичных культур эпителиальных клеток молочной железы эпителиальное потомство, полученное от MMTV-neu-трансформированных клеток, участвует в нормальном развитии молочной железы [91].В другом эксперименте Bussard et al. показали, что клетки эмбриональной карциномы человека могут быть перенаправлены от их туморогенного фенотипа к дифференцировке в функциональных добросовестных человеческих эпителиальных клеток молочной железы посредством взаимодействия с микроокружением молочной железы мыши in vivo [83]. Когда клетки эмбриональной карциномы человека инокулировали с эпителиальными клетками молочной железы мыши в лишенный эпителия жировой слой самок бестимусных голых мышей, перенаправленные клетки эмбриональной карциномы человека способствовали формированию нормальной молочной железы, экспрессировали специфичные для человека кератины, а также секретировали специфические для человека молочные белки у кормящих хозяев [83].Когда клетки эмбриональной карциномы человека были инокулированы отдельно (без эпителиальных клеток молочной железы) в лишенный эпителия жировой слой самок бестимусных голых мышей, опухоли образовывались как в отростках первого, так и во втором поколении [83]. Совсем недавно было продемонстрировано, что при смешивании с нормальными эпителиальными клетками молочной железы мыши клетки рака молочной железы с метастазами, неметастатическими и подавленными метастазами в кости человека экспрессировали маркеры нормальных эпителиальных клеток молочной железы человека в первом и втором поколениях трансплантата (Bussard, неопубликовано). .Таким образом, эти результаты в целом не только свидетельствуют о том, что раковые клетки могут реагировать на «нормальные» сигналы развития, но также в определенных ситуациях доказывают доминирование «нормального» микроокружения над развитием опухоли.

11. Выводы и соображения на будущее

Данные показали, что сигналы от тканевого микроокружения влияют на судьбу клеток-предшественников. Для изучения сигналов тканевого микроокружения на клетках-предшественниках молочная железа служила надежной модельной системой.Было обнаружено, что ниша молочной железы (микроокружение) играет ключевую роль в развитии желез и направлении судьбы эпителиальных клеток. Кроме того, недавно было показано, что микроокружение молочной железы также может перенаправлять соматические клетки из других тканей (взрослые яички, добросовестные нейральные стволовые клетки и клетки эмбриональной карциномы человека), чтобы они вели себя и функционировали как эпителиальные клетки молочной железы. Эти результаты показывают, что ненативные соматические клетки взаимодействуют с сигналами от молочной железы мыши и реагируют на них и способны быть направленными на дифференцировку в клетки, которые проявляют различные фенотипы эпителиальных клеток молочной железы.Эти наблюдения демонстрируют доминирование тканевой ниши над судьбой клетки-предшественника/рака. Хотя конкретные молекулярные механизмы этих явлений еще предстоит определить, эти данные добавляют провокационную информацию к пониманию клеточной пластичности. Понимание механизмов, связанных с клеточным перепрограммированием, создаст новые терапевтические возможности для лечения заболеваний, а также продлит время выживания и улучшит качество жизни пациентов с изнурительными заболеваниями.

Однако остается много вопросов.Почему это событие интеграции происходит только тогда, когда количество нормальных, нативных эпителиальных клеток превышает количество ненативных клеток? Каковы механизмы, по которым происходят эти события? Может ли перепрограммирование клеток-предшественников происходить в органах помимо молочной железы? Существуют ли ограничения на тип/количество клеток, которые можно перепрограммировать? Ответы на эти и другие вопросы помогут в расшифровке сложной передачи сигналов, происходящей между тканевым микроокружением и клетками-предшественниками.Выявление специфических комбинаций межклеточных взаимодействий и межклеточных взаимодействий с внеклеточным матриксом, таких как продемонстрированные LaBarge et al. кажутся хорошим началом и дают представление о механизмах, с помощью которых происходит клеточное перепрограммирование нишей [71]. Вполне вероятно, что множество взаимодействующих факторов и путей необходимо для перенаправления клеточной судьбы in vivo . Тем не менее, понимание сложности этих взаимодействий не только поможет расшифровать молекулярные тонкости молочной железы, но также поможет понять биологию стволовых клеток и неопластическую трансформацию в целом.

XBP1 регулирует биосинтетическую способность молочной железы во время лактации, контролируя расширение эпителия и формирование эндоплазматического ретикулума | Эндокринология

Аннотация

Клетки, составляющие секреторный компартмент молочной железы, развили высокую способность секретировать не только белки, но также триглицериды и углеводы. Эту особенность иллюстрирует мышь, которая может секретировать молочные белки, триглицериды и лактозу почти в два раза больше собственного веса за короткую 20-дневную лактацию.Координация синтеза и экспорта продуктов в др. секреторных клетках частично регулируется транскрипционным фактором X-box связывающим белком 1 (XBP1). Чтобы оценить роль XBP1 в эпителиальных клетках молочной железы (MEC), мы исследовали самок мышей Flox XBP1, лишенных (дикий тип; WT) или экспрессирующих рекомбиназу Cre под контролем промотора β-лактоглобулина овцы (ΔXBP1 MEC ). Беременные самки ΔXBP1 MEC имели морфологически нормальное развитие молочных желез и рождали такое же количество детенышей, как и мыши WT.Однако к 3-му дню лактации (L3)3 их пометы страдали дефицитом прибавки в весе, который возрастал до 80% к L14. У самок ΔXBP1 MEC были лишь незначительные изменения в составе молока (-21% белка, +24% триглицеридов) и в экспрессии ассоциированных генов в изолированных MEC. К L5 железы WT были полностью заняты расширенными альвеолами, тогда как железы ΔXBP1 MEC содержали меньшее количество, в основном незаполненных альвеол и сохраняли заметную популяцию адипоцитов. Меньший размер эпителиального компартмента в железах ΔXBP1 MEC объясняется меньшей пролиферацией MEC и повышенным апоптозом.Наконец, ленты эндоплазматического ретикулума были менее многочисленны у ΔXBP1 MEC на 18-й день беременности и не увеличивались в количестве к L5. В совокупности эти результаты показывают, что XBP1 необходим для расширения популяции MEC во время лактации и его способности развивать сложный компартмент эндоплазматического ретикулума.

Лактация представляет собой одну из наиболее метаболически сложных фаз жизни для многих видов млекопитающих. В течение 20 дней молочная железа мыши может синтезировать и секретировать более 30 г триглицеридов, 12 г белков и 5 г лактозы (1, 2).Синтез молока происходит в альвеолярных структурах, состоящих из одного слоя эпителиальных клеток молочной железы (MEC), окружающих полость, где секретируется молоко (1, 3). Чтобы стать полностью функциональными, МЭК приобретают ряд клеточных характеристик на поздних сроках беременности. Эта дифференциация управляется пролактином и другими лактогенными гормонами и включает развитие сложной системы эндоплазматического ретикулума (ЭР) (1, 3, 4). ER необходим не только для синтеза секретируемых белков, но также является местом сборки жирных кислот в триглицериды и фосфолипиды (5, 6).

Факторы, регулирующие развитие и функцию ER в секреторном эпителии молочной железы, остаются в значительной степени неизвестными. Три линии доказательств предполагают, что фактор транскрипции X-box-связывающий белок 1 (XBP1) может быть важен. Во-первых, XBP1 способствует биогенезу ER, о чем свидетельствует увеличение размера компартмента ER после принудительной сверхэкспрессии XBP1 в фибробластах (7, 8). Более того, удаление XBP1 в др. секреторных клетках уменьшало как численность ER, так и секрецию белка (9, 10).Во-вторых, XBP1 является компонентом высококонсервативного сигнального каскада, ответственного за восстановление гомеостаза, когда ER сталкивается с различными стрессами, включая повышенный синтез и секрецию белка (11, 12). В частности, нарушение гомеостаза ER приводит к активации трансмембранного сенсора стресса ER, требующего инозитола, фермента 1α (13, 14). Активированный IRE1α специфически отщепляет внутренний сегмент из 26 пар оснований от транскриптов XBP1 с последующим сдвигом рамки считывания, приводящим к продукции транскрипционно активной изоформы XBP1.Наконец, передача сигналов XBP1 также считается положительным регулятором как липогенеза, так и секреции ЛПОНП в гепатоцитах (15, 16). Эти наблюдения могут относиться к молочной железе, поскольку она является преобладающей липогенной тканью во время лактации (2, 17).

Соответственно, нашей целью было оценить роль XBP1 в поддержании биосинтетической активности молочной железы во время лактации. Для этого мы изучили последствия MEC-специфичной делеции гена XBP1 у самок мышей Floxed XBP1, несущих ген рекомбиназы Cre под контролем промотора β-лактоглобулина овцы.Удаление XBP1 не влияло на развитие молочной железы во время беременности, но серьезно нарушало последующую лактацию. Этот дефект объясняется неспособностью популяции MEC расширяться и развивать соответствующий компартмент ER во время лактации.

Материалы и методы

Животные

Все эксперименты на животных проводились в соответствии с принятыми стандартами гуманного ухода за животными, изложенными в Этических рекомендациях.Процедуры были одобрены Корнеллским комитетом по уходу и использованию животных. Мыши C57BL/6 с сайтами loxP по обе стороны от экзона 2 в гене XBP1 (XBP1 f/f ) были получены от Dr Laurie Glimcher (15). Мыши смешанного происхождения, экспрессирующие копию рекомбиназы Cre под контролем промотора β-лактоглобулина овцы (BLG-Cre), были получены от Dr Robert Weiss (18–20). Экспериментальные животные были получены путем скрещивания самок XBP1 f/f с самцами XBP1 f/f , несущими 1 копию трансгена BLG-Cre.Однопометники, оставленные для исследований, были либо XBP1 f/f (обозначены как дикий тип; WT), либо XBP1 f/f , несущими трансген BLG-Cre (обозначен ΔXBP1 MEC ). Пометы были отняты от груди и генотипированы в возрасте 3 недель.

Все животные содержались в среде с постоянной температурой окружающей среды (22°C) и световым периодом (включение света с 6 до 18 часов). На протяжении всего эксперимента мышей кормили ab libitum стандартным кормом для грызунов, содержащим 5% жира и 19% белка (Harlan Tekland 7912).Все терминальные процедуры включали эвтаназию путем удушения CO 2 .

Измерение роста щенков и анализ компонентов молока

реципрокных скрещивания (самки WT × самцы ΔXBP1 MEC ; самки ΔXBP1 MEC × самцы WT) были проведены в возрасте 10 недель (n = 6–11 самок на генотип). Роды считались 0-м днем ​​лактации (L0), а размеры помета были стандартизированы до 9 детенышей на L1. Стандартизация помета не включала умерщвление каких-либо детенышей из исследуемых пометов, и любые добавленные щенки происходили из пометов, рожденных в один и тот же день, но не использованных в этом исследовании.Каждый помет ежедневно взвешивали от L1 до L14. Самок доили на L14 после внутрибрюшинной инъекции окситоцина (21, 22). Молоко разбавляли 1:1 PBS, обрабатывали ультразвуком и замораживали до анализа. Молочную лактозу определяли с помощью набора для колориметрического анализа галактозы и лактозы (Sigma-Aldrich). Содержание белка в молоке измеряли с помощью анализа Бредфорда с использованием восстановленного сухого молока в качестве стандарта. Отдельные молочные белки визуализировали путем разделения фиксированного объема разбавленного молока (10 мкл) на восстанавливающем 13% SDS-полиакриламидном геле с последующим окрашиванием кумасси синим (23).Определение содержания жира в молоке и профиля жирных кислот включало экстракцию гексаном: изопропанолом, метилирование жирных кислот в метанольном серном растворе, кислоту с последующим трансметилированием в гидроксиде натрия и газовую хроматографию, как недавно описано (22). Энергетическая ценность молока оценивалась с использованием значений теплоты сгорания 9,25, 3,95 и 5,65 ккал/г для жира, лактозы и белка (24).

Изоляция МЭК

Самок мышей

WT и ΔXBP1 MEC спаривали и ежедневно оценивали на наличие копулятивной пробки (день беременности обозначен как 0 [P0]).Подгруппы самок были подвергнуты эвтаназии на P14, P18, L0 и L5 (n = 5–8 самок для каждого генотипа и стадии молочной железы). МЭК выделяли, как недавно описано (25, 26). Вкратце, обе четвертые молочные железы очищали от лимфатических узлов, измельчали ​​и переваривали в 5 мл буфера для переваривания (DMEM, содержащего 1 мг/мл трипсина, 2 мг/мл коллагеназы А, 50 мМ фторида натрия и 1 мМ ортованадата натрия). ) на водяной бане со встряхиванием (37°С, 200 об/мин). Через 30 минут реакцию переваривания гасили 1 мл эмбриональной бычьей сыворотки и доводили до конечного объема 15 мл с помощью PBS.МЭК осаждали центрифугированием (9300 g в течение 10 мин при 4°С) и еще 2 раза промывали в PBS перед замораживанием при -80°С.

Анализ развития молочной железы

Самок мышей

WT и ΔXBP1 MEC подвергали эвтаназии на P14, P18, L1, L5 и L14 (n = 2–3 самки для каждого генотипа и стадии развития). Правую четвертую молочную железу распределяли на предметное стекло для анализа всего препарата (27). Вкратце, расширенные железы фиксировали в течение ночи в растворе Карнуа (60% этанол, 30% хлороформ, 10% уксусная кислота), постфиксировали в 70% этаноле, регидратировали в этаноле с уменьшающейся концентрацией и окрашивали карминовыми квасцами.После окрашивания железы обезвоживали при возрастающей концентрации этанола, очищали в ксилоле в течение ночи и закрепляли Permount. Смонтированные железы фотографировали с помощью камеры AxioCam (Carl Zeiss, Inc), прикрепленной к препаровальному микроскопу. Для гистологического анализа правую третью молочную железу фиксировали в течение ночи в 10% забуференном формалине и постфиксировали в 70% этаноле. Железы заливали в парафин и окрашивали гематоксилином и эозином (H&E). Изображения гистологических срезов были получены с использованием микроскопии яркого света при увеличении ×10 и ×40 с использованием микроскопа Axiovert 40, оснащенного камерой AxioCam (Carl Zeiss, Inc), как описано ранее (27).

Выделение тотальной РНК и анализ экспрессии генов

MEC и ткани лизировали Qiazol (QIAGEN) с последующей очисткой тотальной РНК с использованием колонок RNeasy Mini и обработкой на колонке дезоксирибонуклеазой без рибонуклеазы (QIAGEN). Количество и целостность тотальной РНК определяли с использованием набора RNA Nano Lab Chip и биоанализатора (Agilent). Реакции обратной транскрипции проводили с 1 мкг РНК в общем объеме 10 мкл с помощью набора для обратной транскрипции кДНК большой емкости и ингибитора РНКазы (Applied Biosystems).Экспрессию генов анализировали с помощью количественного ПЦР в реальном времени с использованием Power SYBR Green Mix (Applied Biosystems). ПЦР в реальном времени выполняли в двух экземплярах с общим реакционным объемом 25 мкл, содержащим 500 нМ концентрации каждого праймера и обратно транскрибированной РНК (25 нг, за исключением 2,5 нг для внутреннего стандарта гена β-2 микроглобулина [ B2m ]). Последовательности всех используемых праймеров приведены в дополнительной таблице 1. Данные мРНК анализировали с использованием относительной стандартной кривой, основанной на серийных разведениях объединенной кДНК либо из MEC, либо из интересующей ткани, как указано в подписях к рисункам.Уровни экспрессии неизвестного образца рассчитывали по стандартной кривой и корректировали по экспрессии инвариантного гена B2m .

Иммуногистохимия Ki67 и анализ TUNEL

срезов молочной железы были приготовлены из правой третьей молочной железы, собранной на P18 и L5 (n = 5 для каждого генотипа и стадии развития). Срезы иммуноокрашивали кроличьим моноклональным анти-Ki67 (1:50; Abcam) и контрастно окрашивали 4′,6-диамидино-2-фенилиндола дигидрохлоридом (DAPI) (Vector Laboratories).Анализ TdT-опосредованного мечения dUTP Nick-End (TUNEL) проводили с использованием системы DeadEnd Colorimetric TUNEL (Promega), а срезы контрастно окрашивали DAPI (Vector Laboratories). Для обоих анализов срезы фотографировали с использованием микроскопа Axiovert 40 (Carl Zeiss, Inc), оснащенного камерой AxioCam. Для каждого животного случайным образом брали 8 микрофотографий одинакового размера из несмежных областей, и соответствующий иммунореактивный сигнал оценивали на 400–1000 окрашенных DAPI МЭК.Количество Ki67-позитивных или TUNEL-позитивных клеток делили на количество ядер, окрашенных DAPI, для получения процента пролиферирующих или апоптотических клеток.

Просвечивающая электронная микроскопия (ЭМ)

Правую третью молочную железу вырезали у подмножеств мышей WT и ΔXBP1 MEC на P18 и L5 (n = 2–3 для каждого генотипа и стадии развития). Кубики тканей (1 мм 3 ) погружали в фиксатор Карновского (16% параформальдегид, 50% глутаральдегид и 0.2М фосфатно-натриевый буфер [рН 7,2]; наук об электронной микроскопии). Фиксацию проводили в течение 1 часа на льду, а затем в течение ночи при 4°С. Затем образцы промывали 0,1 М фосфатно-натриевым буфером 3 раза в течение десяти минут. Образцы были помещены в EMbed 812 (Electron Microscopy Sciences), а затем обработаны в 65-нм срезы с помощью системы ультрамикротома Leica Ultracut. Изображения были получены с использованием JEM-1400 TEM. Встраивание, обработка и визуализация выполнялись на платной основе Центром электронной микроскопии и гистологии Медицинского колледжа Вейла Корнелла.

Вестерн-блоттинг

Ткань молочной железы была получена от мышей WT и ΔXBP1 MEC на L5 и гомогенизирована в буфере для радиоиммунопреципитации (RIPA) (10 мМ трис-HCl [pH 7,4], 150 мМ хлорида натрия, 1% Nonidet P-40, 1 мМ фенилметилсульфонил фторид, 1 мМ ЭДТА, 1 мМ фторид натрия, 0,25% дезоксихолат натрия и 10% глицерин), дополненный ингибиторами протеазы и фосфатазы (смесь ингибиторов фосфатазы Halt без ЭДТА; Thermo Scientific).Концентрации белка определяли с использованием анализа белка BCA (Thermo Scientific). Белки разделяли на 7–10% гелях SDS-PAGE в восстанавливающих условиях и переносили на нитроцеллюлозные мембраны (Protran, Schleicher & Schuell Bioscience). Мембраны блокировали в течение 1 часа при комнатной температуре в трис-буферном солевом растворе с добавлением 0,1% Tween 20 и 5% вес./об. обезжиренного сухого молока. Мембраны инкубировали в течение ночи при 4°C в блокирующем растворе, содержащем разведение 1:1000 первичного антитела (IRE1α [Cell Signaling], преобразователь сигнала и активатор транскрипции 3 (STAT3) [Santa Cruz Biotechnology, Inc], pY 705 STAT3 [Передача клеточных сигналов] и β-актин [Передача клеточных сигналов]).Сигналы проявляли с помощью вторичного антикроличьего антитела IRDye 800 в разведении 1:20 000 (LI-COR Biotechnology) и визуализировали с помощью системы инфракрасной визуализации LI-COR Odyssey (таблица 1).

Rabbit, ; поликлональные кролика IgG (H + L)
Целевой пептид/белок . Последовательность антигена (если известна) . Название антитела . Изготовитель, каталожный номер и/или имя лица, предоставившего антитело . Виды, выращенные в; Моноклональный или поликлональный . Используемый разбавитель .
Остатки, окружающие His963 человеческого IRE1α IRE1α Cell Signaling, 14C10 Кролик; моноклональный 1:2000
Остатки, окружающие Tyr705 мышиного Stat3 Phospho-Stat3 (Tyr705) Cell Signaling,
1:1000
Остатки вблизи N-конца белка β-актина человека   β-Актин Cell Signaling, 8457 Rabbit27 918; моноклональные 1:1000
Остатки, картированные на С-конце Stat3 мышиного происхождения Stat3 (C-20) Rabbit Biotechnology, Inc. 9-19482, sc; поликлональные 1: 1000
+
Козье антикроличий вторичного LI-COR Биотехнологии, 926-32211 Козье 1:20 000
91 894 + Rabbit, ; поликлональные кролика IgG (H + L)
Пептид/белковая мишень . Последовательность антигена (если известна) . Название антитела . Изготовитель, каталожный номер и/или имя лица, предоставившего антитело . Виды, выращенные в; Моноклональный или поликлональный . Используемый разбавитель .
Остатки, окружающие His963 человеческого IRE1α IRE1α Cell Signaling, 14C10 Кролик; моноклональный 1:2000
Остатки, окружающие Tyr705 мышиного Stat3 Phospho-Stat3 (Tyr705) Cell Signaling,
1:1000
Остатки вблизи N-конца белка β-актина человека   β-Актин Cell Signaling, 8457 Rabbit27 918; моноклональные 1:1000
Остатки, картированные на С-конце Stat3 мышиного происхождения Stat3 (C-20) Rabbit Biotechnology, Inc. 9-19482, sc; поликлональные 1: 1000
+
Козье антикроличий вторичного LI-COR Биотехнологии, 926-32211 Козье 1:20 000
91 894 + Rabbit, ; поликлональные кролика IgG (H + L)
Пептид/белковая мишень . Последовательность антигена (если известна) . Название антитела . Изготовитель, каталожный номер и/или имя лица, предоставившего антитело . Виды, выращенные в; Моноклональный или поликлональный . Используемый разбавитель .
Остатки, окружающие His963 человеческого IRE1α IRE1α Cell Signaling, 14C10 Кролик; моноклональный 1:2000
Остатки, окружающие Tyr705 мышиного Stat3 Phospho-Stat3 (Tyr705) Cell Signaling,
1:1000
Остатки вблизи N-конца белка β-актина человека   β-Актин Cell Signaling, 8457 Rabbit27 918; моноклональные 1:1000
Остатки, картированные на С-конце Stat3 мышиного происхождения Stat3 (C-20) Rabbit Biotechnology, Inc. 9-19482, sc; поликлональные 1: 1000
+
Козье антикроличий вторичного LI-COR Биотехнологии, 926-32211 Козье 1:20 000
91 894 + Rabbit, ; поликлональные
Пептид/белковая мишень . Последовательность антигена (если известна) . Название антитела . Изготовитель, каталожный номер и/или имя лица, предоставившего антитело . Виды, выращенные в; Моноклональный или поликлональный . Используемый разбавитель .
Остатки, окружающие His963 человеческого IRE1α IRE1α Cell Signaling, 14C10 Кролик; моноклональный 1:2000
Остатки, окружающие Tyr705 мышиного Stat3 Phospho-Stat3 (Tyr705) Cell Signaling,
1:1000
Остатки вблизи N-конца белка β-актина человека   β-Актин Cell Signaling, 8457 Rabbit27 918; моноклональные 1:1000
Остатки, картированные на С-конце Stat3 мышиного происхождения Stat3 (C-20) Rabbit Biotechnology, Inc. 9-19482, sc; поликлональные 1: 1000
Кролик девяносто одна тысяча восемьсот тридцать один IgG (H + L) Козье антикроличий вторичный LI-COR, биотехнологии, 926-32211 Козье 1:20 000

Статистический анализ

Анализы были выполнены с использованием процедуры подбора модели JMP Pro 11.0 статистическое программное обеспечение (Институт SAS). Данные о росте детенышей анализировали с помощью процедуры подгонки модели, включая фиксированное влияние генотипа матери, дня лактации и их взаимодействие. Все другие переменные были проанализированы на стадиях развития (P14, P18 или L5) с помощью модели, учитывающей материнский генотип (WT или ΔXBP1 MEC ). Статистическая значимость и тенденция были установлены на уровне P < 0,05 и P < 0,10 соответственно.

Результаты

Экспрессия XBP1 необходима для нормальной лактации

Мы создали экспериментальных самок мышей, несущих аллели floxed XBP1 в отсутствие или в присутствии 1 копии трансгена BLG-Cre (обозначаемых в последующем тексте соответственно как WT и ΔXBP1 MEC ).Чтобы оценить рекомбинацию именно в эпителиальном компартменте, мы выделили MEC на P14, P18, L0 и L5. Эта изоляция была необходима, чтобы избежать разбавляющего влияния адипоцитов молочной железы, количество которых варьирует не только во время беременности и лактации (1, 28), но также между WT и ΔXBP1 MEC (описано ниже). Выделение прошло успешно, о чем свидетельствует более чем 20-кратное снижение экспрессии специфического для адипоцитов белка перилипина в МЭК по сравнению с интактной тканью молочной железы на всех стадиях беременности и лактации, независимо от генотипа (рис. 1А.Опосредованную BLG-Cre рекомбинацию XBP1 затем измеряли в изолированных MEC с помощью количественного анализа ПЦР в реальном времени с обратным праймером, расположенным в экзоне 2, экзоне, предназначенном для вырезания (15). В МЭК, собранных у мышей ΔXBP1 MEC , экзон 2, содержащий транскрипты XBP1, был снижен до 7%, 4% и 16% от содержания, обнаруженного в МЭК WT на P14, P18 и L5, соответственно ( P < 0,001). ) (Рисунок 1B. Напротив, количество транскриптов, содержащих экзон 2, не различалось на уровне L5 между генотипами в печени и скелетных мышцах (рисунок 1C.Эти результаты показывают, что Cre-опосредованная рекомбинация XBP1 происходит в MEC уже на P14 и не происходит в печени и скелетных мышцах.

Рисунок 1

Влияние рекомбинации, опосредованной BLG-Cre, на количество транскриптов XBP1. Мышей, несущих аллели floxed XBP1 в отсутствие (WT) или в присутствии трансгена β-лактоглобулина (ΔXBP1 MEC ), исследовали либо на P14, P18, либо на L5. A, Обе четвертые молочные железы вырезали у мышей WT и ΔXBP1 MEC на P14, P18 и L5.Часть желез сразу же замораживали (железы интактны), а оставшуюся часть использовали для выделения МЭК. Тотальную РНК выделяли из замороженных интактных желез и МЭК и анализировали с помощью количественной ПЦР в реальном времени на содержание мРНК перилипина. Для каждого генотипа и стадии развития содержание мРНК перилипина соотносится с уровнем интактной железы, при этом каждая полоса представляет собой среднее значение ± стандартная ошибка для 5–11 мышей. ***, P < 0,001. B, MEC были выделены из молочной железы мышей WT и ΔXBP1 MEC на P14, P18 и L5.Обилие мРНК XBP1, содержащей экзон 2, измеряли с помощью количественной ПЦР в реальном времени в изолированных MEC. На каждой стадии развития содержание мРНК XBP1, содержащей экзон 2 (обозначаемое как мРНК XBP1 экзона 2), соотносится с уровнем WT, где каждая полоса представляет среднее ± SE для 5–11 мышей. ***, P < 0,001. C, мРНК XBP1, содержащую экзон 2, измеряли с помощью количественной ПЦР в реальном времени в печени и мышцах, собранных у мышей WT и ΔXBP1 MEC на L5. Для каждой ткани изобилие мРНК XBP1, содержащей экзон 2 (обозначаемое как мРНК XBP1 экзона 2), относится к уровню WT, где каждая полоса представляет среднее значение ± стандартная ошибка для 5 мышей.

Рисунок 1

Влияние рекомбинации, опосредованной BLG-Cre, на количество транскриптов XBP1. Мышей, несущих аллели floxed XBP1 в отсутствие (WT) или в присутствии трансгена β-лактоглобулина (ΔXBP1 MEC ), исследовали либо на P14, P18, либо на L5. A, Обе четвертые молочные железы вырезали у мышей WT и ΔXBP1 MEC на P14, P18 и L5. Часть желез сразу же замораживали (железы интактны), а оставшуюся часть использовали для выделения МЭК. Тотальную РНК выделяли из замороженных интактных желез и МЭК и анализировали с помощью количественной ПЦР в реальном времени на содержание мРНК перилипина.Для каждого генотипа и стадии развития содержание мРНК перилипина соотносится с уровнем интактной железы, при этом каждая полоса представляет собой среднее значение ± стандартная ошибка для 5–11 мышей. ***, P < 0,001. B, MEC были выделены из молочной железы мышей WT и ΔXBP1 MEC на P14, P18 и L5. Обилие мРНК XBP1, содержащей экзон 2, измеряли с помощью количественной ПЦР в реальном времени в изолированных MEC. На каждой стадии развития содержание мРНК XBP1, содержащей экзон 2 (обозначаемое как мРНК XBP1 экзона 2), соотносится с уровнем WT, где каждая полоса представляет среднее ± SE для 5–11 мышей.***, P < 0,001. C, мРНК XBP1, содержащую экзон 2, измеряли с помощью количественной ПЦР в реальном времени в печени и мышцах, собранных у мышей WT и ΔXBP1 MEC на L5. Для каждой ткани изобилие мРНК XBP1, содержащей экзон 2 (обозначаемое как мРНК XBP1 экзона 2), относится к уровню WT, где каждая полоса представляет среднее значение ± стандартная ошибка для 5 мышей.

Затем мы оценили влияние удаления XBP1 в MEC на лактацию путем измерения роста щенков. В этом исследовании любое влияние генотипа детенышей было устранено путем реципрокного спаривания (т. е. самка WT × самец с флоксами, несущий BLG-Cre; мать ΔXBP1 MEC × самец WT).Количество родившихся детенышей не различалось между генотипами (7,8 ± 0,5 против 8,4 ± 0,5 у самок WT и ΔXBP1 MEC ). Размер помета был нормализован до 9 детенышей на самку на L1, чтобы обеспечить одинаковую потребность в лактации у всех самок. Вес щенков был идентичен в L1, но дефицит роста стал очевидным к L3 для детенышей, выкормленных самками ΔXBP1 MEC (рис. 2). Между 1-м и 14-м днем ​​лактации детеныши, выкормленные самками WT, набрали в среднем 4,8 г, тогда как детеныши, выкормленные самками ΔXBP1 MEC , набрали только 1.2 г (генотип × день, P < 0,0001). К 14 дню лактации вес отдельного детеныша в среднем составлял 6,4 г для пометов WT, но только 2,6 г для пометов ΔXBP1 MEC (генотип, P < 0,0001). Эти результаты показывают, что удаление XBP1 в эпителиальном компартменте молочной железы ухудшает лактацию.

Рисунок 2

Влияние удаления XBP1, специфичного для молочной железы, на рост детенышей. Самок, несущих XBP1 дикого типа (WT) или нулевой XBP1 в MEC (ΔXBP1 MEC ), исследовали в период с 1 по 14 день лактации (n = 6–11 самок для каждого генотипа).Пометы были стандартизированы до 9 детенышей и взвешивались каждый день. Каждая кривая представляет собой средний вес отдельных детенышей, выкормленных либо от самок WT, либо от самок ΔXBP1 MEC . Сообщается о значительных эффектах взаимодействия генотип, день и генотип × день.

Рисунок 2

Влияние удаления XBP1, специфичного для молочной железы, на рост щенков. Самок, несущих XBP1 дикого типа (WT) или нулевой XBP1 в MEC (ΔXBP1 MEC ), исследовали в период с 1 по 14 день лактации (n = 6–11 самок для каждого генотипа).Пометы были стандартизированы до 9 детенышей и взвешивались каждый день. Каждая кривая представляет собой средний вес отдельных детенышей, выкормленных либо от самок WT, либо от самок ΔXBP1 MEC . Сообщается о значительных эффектах взаимодействия генотип, день и генотип × день.

Чтобы определить, влияет ли отсутствие XBP1 на состав молока, молоко было собрано у самок обоих генотипов в L14 и проанализировано на основные органические компоненты. Концентрация лактозы и белка в молоке была соответственно на 37% и 21% ниже у ΔXBP1 MEC , чем у самок WT ( P < .001 и P < 0,01 соответственно) (рис. 3А. Анализ молока с помощью SDS-PAGE показал, что более низкое содержание белка объясняется снижением основных специфических белков молока, включая казеины и сывороточный кислый белок (рис. 3В). , Напротив, общее содержание жира в молоке было увеличено на 24% в молоке ΔXBP1 MEC ( P < 0,01) (рис. 3A. Жирные кислоты с 14 атомами углерода или менее синтезируются исключительно в MEC, и их общее содержание может быть используется в качестве показателя липогенеза (17, 22).Газохроматографический анализ молочного жира показал, что содержание жирных кислот с 14 или менее атомами углерода в ΔXBP1 MEC , как правило, ниже, чем в молочном жире WT ( P <0,07) (рис. 3C; см. также дополнительную таблицу 2). Этот дефицит молочного жира ΔXBP1 MEC компенсировался повышенной долей предварительно образованных жирных кислот ( P < 0,07), которые поступают из рациона и запасов жировой ткани. Доля жирных кислот с 16 атомами углерода, которые в равной степени получены из липогенеза МЭК и преформированных источников, не зависела от материнского генотипа.Эти изменения состава молока ΔXBP1 MEC привели к увеличению его калорийности (2,2 ± 0,1 против 2,6 ± 0,1 ккал/г для WT и ΔXBP1 MEC , P < 0,05).

Рисунок 3

Влияние удаления XBP1, специфичного для молочной железы, на состав молока. Мышей, несущих XBP1 дикого типа (WT) или нулевой XBP1 в MEC (ΔXBP1 MEC ), исследовали на 14-й день лактации. А. Молоко собирали у самок WT или ΔXBP1 MEC и анализировали на содержание лактозы, белка и жира.Столбцы представляют собой среднее значение ± стандартная ошибка указанного компонента молока (n = 5–8 самок на генотип). **, P < 0,01; ***, P < 0,001. B, молоко (10 мкл разведения 1:1 с PBS) анализировали с помощью SDS-PAGE и окрашивания кумасси синим (n = 5 на генотип). Для каждого генотипа показаны две репрезентативные выборки. Положения маркеров молекулярной массы показаны слева, тогда как идентификация белков молока указана справа (Лф, лактоферрин, СА, сывороточный альбумин, α-КСН, α-казеин, β-КСН, β-казеин, γ- CSN, γ-казеин; ϵ-CSN, ϵ-казеин; WAP, сывороточный кислый белок).C. Профиль жирных кислот молока анализировали с помощью газовой хроматографии (n = 7–8 самок для каждого генотипа). Жирные кислоты были сгруппированы по категориям, отражающим их длину цепи и происхождение (<16 атомов углерода [C ≤ 14], молочное происхождение; ровно 16 атомов углерода [C = 16], молочное и немаммарное происхождение; >16 атомов углерода [C ≥ 18], немаммарное происхождение ). Каждая категория была выражена в процентах от общего количества присутствующих жирных кислот. Процентное содержание общих жирных кислот показано для категории жирных кислот, где каждая полоса представляет собой среднее значение ± стандартная ошибка.#, P < 0,07.

Рисунок 3

Влияние удаления XBP1, специфичного для молочной железы, на состав молока. Мышей, несущих XBP1 дикого типа (WT) или нулевой XBP1 в MEC (ΔXBP1 MEC ), исследовали на 14-й день лактации. А. Молоко собирали у самок WT или ΔXBP1 MEC и анализировали на содержание лактозы, белка и жира. Столбцы представляют собой среднее значение ± стандартная ошибка указанного компонента молока (n = 5–8 самок на генотип). **, P < 0,01; ***, P < .001. B. Молоко (10 мкл разведения 1:1 с PBS) анализировали с помощью SDS-PAGE и окрашивания кумасси синим (n = 5 на генотип). Для каждого генотипа показаны две репрезентативные выборки. Положения маркеров молекулярной массы показаны слева, тогда как идентификация белков молока указана справа (Лф, лактоферрин, СА, сывороточный альбумин, α-КСН, α-казеин, β-КСН, β-казеин, γ- CSN, γ-казеин; ϵ-CSN, ϵ-казеин; WAP, сывороточный кислый белок). C. Профиль жирных кислот молока анализировали с помощью газовой хроматографии (n = 7–8 самок для каждого генотипа).Жирные кислоты были сгруппированы по категориям, отражающим их длину цепи и происхождение (<16 атомов углерода [C ≤ 14], молочное происхождение; ровно 16 атомов углерода [C = 16], молочное и немаммарное происхождение; >16 атомов углерода [C ≥ 18], немаммарное происхождение ). Каждая категория была выражена в процентах от общего количества присутствующих жирных кислот. Процентное содержание общих жирных кислот показано для категории жирных кислот, где каждая полоса представляет собой среднее значение ± стандартная ошибка. #, P < 0,07.

Затем мы спросили, влияют ли изменения в экспрессии гена MEC на влияние XBP1 на состав молока.В соответствии со сниженным содержанием белка в молоке ΔXBP1 MEC экспрессия специфичных для молочной железы белков сывороточного кислого белка ( Wap ) и β-казеина ( Csn2 ) была ниже у ΔXBP1 MEC , чем у WT MEC ( P <0,05 и P <0,09) (Фигура 4A. Абляция XBP1 не влияла на экспрессию липогенных генов синтазы жирных кислот ( Fasn ), стеароил-кофермента А-десатуразы 1 ( Scd1 ), и диацилглицерол-О-ацилтрансфераза 1 ( Dgat1 ) (рис. 4В, но повышенная экспрессия 3 генов, участвующих в образовании и секреции липидных капель в молоко (бутирофилин [ Btn1a1 ], ксантиндегидрогеназа [ Xdh ] и фактор фрагментации ДНК, вызывающий гибель клеток [ Cidea ]) ( P < .05) (Рисунок 4C. Наконец, абляция XBP1 не изменяет экспрессию фермента, ограничивающего скорость, ответственного за синтез галактозы (UDP-галактозо-4-эпимераза [ Gale ]), и не оказывает последовательного влияния на экспрессию 2 генов, кодирующих фермент лактозосинтаза (α-лактальбумин [ Lalba ] и UDP-Gal:βGlcNAc β1,4-галактозилтрансфераза [ B4galt1 ]) (рис. 4D. Эти изменения в экспрессии генов согласуются с реципрокными изменениями, наблюдаемыми в белках и жирах). содержание молока ΔXBP1 MEC , но не объясняет более низкое содержание лактозы.В целом, отсутствие значительного одностороннего снижения компонентов молока и экспрессии ассоциированных генов не согласуется с абсолютным требованием XBP1 для дифференцировки секреторного эпителия.

Рисунок 4

Влияние специфического для молочной железы удаления XBP1 на экспрессию генов, участвующих в синтезе органических компонентов молока. МЭК выделяли на 5-й день лактации из молочной железы мышей, несущих XBP1 дикого типа (WT) или нулевой XBP1 в МЭК (ΔXBP1 MEC ).Тотальную РНК выделяли и анализировали с помощью количественной ПЦР в реальном времени на экспрессию генов, участвующих в (A) синтезе молочных белков (сывороточный кислый белок [ Wap ] и β-казеин [ Csn2 ]), (B) синтезе липиды молока [синтаза жирных кислот ( Fasn ), стеароил-коэнзим А-десатураза 1 ( Scd1 ), диацилглицерол-О-ацилтрансфераза 1 ( Dgat1 )], (C) образование липидных капель (бутирофилин [], Btn1a1 ксантиндегидрогеназа [ Xdh ] и индуцирующий гибель клеток фактор фрагментации ДНК [ Cidea ]), (D) синтез лактозы (UDP галактозо-4-эпимераза [ Gale ], α-лактальбумин [ Lalba ] и UDP -Gal: βGlcNAc β1,4-галактозилтрансфераза [ B4galt1 ]).Для каждого гена экспрессия указанной мРНК соотносится с уровнем WT, где каждая полоса представляет собой среднее значение ± стандартная ошибка для 5–8 самок. *, P < 0,05; #, P < 0,09.

Рисунок 4

Влияние удаления XBP1, характерного для молочной железы, на экспрессию генов, участвующих в синтезе органических компонентов молока. МЭК выделяли на 5-й день лактации из молочной железы мышей, несущих XBP1 дикого типа (WT) или нулевой XBP1 в МЭК (ΔXBP1 MEC ). Тотальную РНК выделяли и анализировали с помощью количественной ПЦР в реальном времени на экспрессию генов, участвующих в (A) синтезе молочных белков (сывороточный кислый белок [ Wap ] и β-казеин [ Csn2 ]), (B) синтезе липиды молока [синтаза жирных кислот ( Fasn ), стеароил-коэнзим А-десатураза 1 ( Scd1 ), диацилглицерол-О-ацилтрансфераза 1 ( Dgat1 )], (C) образование липидных капель (бутирофилин [], Btn1a1 ксантиндегидрогеназа [ Xdh ] и индуцирующий гибель клеток фактор фрагментации ДНК [ Cidea ]), (D) синтез лактозы (UDP галактозо-4-эпимераза [ Gale ], α-лактальбумин [ Lalba ] и UDP -Gal: βGlcNAc β1,4-галактозилтрансфераза [ B4galt1 ]).Для каждого гена экспрессия указанной мРНК соотносится с уровнем WT, где каждая полоса представляет собой среднее значение ± стандартная ошибка для 5–8 самок. *, P < 0,05; #, P < 0,09.

Абляция XBP1 нарушает расширение альвеол во время лактации

80-процентный дефицит прироста у пометов, выкормленных самками ΔXBP1 MEC , нельзя объяснить исключительно изменением состава молока на 20–30 %. Соответственно, мы спросили, изменилось ли развитие молочных желез из-за отсутствия XBP1 в MEC.Молочные железы были собраны у самок мышей WT и ΔXBP1 MEC на P14, P18, L1, L5 и L14 и проанализированы с помощью полного препарата и окрашивания H&E (рис. 5). На P14, P18 и L1 мыши WT и ΔXBP1 MEC имели одинаковую степень ветвления протоков и плотность альвеол (рис. 5A, а также аналогичную долю желез, занимаемых компартментами эпителиальной и жировой ткани (рис. 5B). Молочные железы, собранные из двух генотипов не отличались на П18 по морфологическим показателям дифференцировки эпителия (размер и накопление липидных капель, расширение просвета альвеол), но явные различия возникали к Л5 (рис. 5Б.В железах WT альвеолярные структуры были полностью расширены и полностью вытеснили компартмент адипоцитов. Напротив, железы ΔXBP1 MEC имели меньшее количество и плохо расширенные альвеолы ​​и сохраняли заметный компартмент адипоцитов. Эти морфологические различия оставались очевидными у ΔXBP1 MEC на уровне L14 с добавлением того, что многие альвеолы ​​молочных желез были полностью коллапсированы. В целом, эти результаты свидетельствуют о том, что неадекватное расширение отделения MEC после родов является основной причиной недостаточной лактационной способности самок ΔXBP1 MEC .

Рисунок 5

Влияние специфичной для молочной железы абляции XBP1 на развитие молочной железы. Мышей, несущих XBP1 дикого типа (WT) или нулевой XBP1 в MEC (ΔXBP1 MEC ), убивали на P14 или P18 или на L1, L5 или L14 (n = 2–3 самки для каждого генотипа и стадии развития). Четвертая молочная железа была взята для анализа. A, железы анализировали по всей процедуре монтирования и фотографировали при малом увеличении (все изображения) и при большем увеличении (нижний правый угол для L5 и L14).На каждой стадии развития для каждого генотипа показана одна репрезентативная фотография. B, срезы молочной железы, окрашенные гематоксилином и эозином, были сфотографированы с увеличением × 10 (все изображения) и увеличением × 40 (нижний правый угол). На P18 и L5 альвеолярные структуры показаны красными стрелками, а адипоциты показаны черными стрелками. На каждой стадии развития для каждого генотипа показана одна репрезентативная фотография.

Рисунок 5

Влияние специфичной для молочной железы абляции XBP1 на развитие молочной железы.Мышей, несущих XBP1 дикого типа (WT) или нулевой XBP1 в MEC (ΔXBP1 MEC ), убивали на P14 или P18 или на L1, L5 или L14 (n = 2–3 самки для каждого генотипа и стадии развития). Четвертая молочная железа была взята для анализа. A, железы анализировали по всей процедуре монтирования и фотографировали при малом увеличении (все изображения) и при большем увеличении (нижний правый угол для L5 и L14). На каждой стадии развития для каждого генотипа показана одна репрезентативная фотография. B, срезы молочной железы, окрашенные гематоксилином и эозином, были сфотографированы с увеличением × 10 (все изображения) и увеличением × 40 (нижний правый угол).На P18 и L5 альвеолярные структуры показаны красными стрелками, а адипоциты показаны черными стрелками. На каждой стадии развития для каждого генотипа показана одна репрезентативная фотография.

Чтобы понять, почему эпителиальный компартмент не может расширяться во время лактации у ΔXBP1 MEC , индексы пролиферации и апоптоза измеряли на P18, когда не наблюдалось морфологических различий, и на L5, когда дефицит эпителия становился очевидным. Никаких различий в индексе пролиферации Ki67 на P18 не наблюдалось.Однако к L5 у самок ΔXBP1 MEC наблюдалось снижение пролиферации эпителиальных клеток на 71% по сравнению с мышами дикого типа ( P <0,01) (рис. 6А. Что касается апоптоза, то он был выше у самок ΔXBP1 MEC , чем у самок дикого типа. как на P18, так и на L5 ( P <0,01 или меньше) (рис. 6B. В совокупности эти данные показывают, что дефицит эпителия лактирующих самок ΔXBP1 MEC объясняется реципрокными изменениями в пролиферации и апоптозе.

Рисунок 6.

Влияние специфичной для молочной железы абляции XBP1 на пролиферацию и апоптоз MEC.Мышей, несущих XBP1 дикого типа (WT) или нулевой XBP1 в MEC (ΔXBP1 MEC ), убивали на P18 или L5. Берут третью молочную железу и подвергают иммуногистохимии. A, репрезентативная микрофотография, использованная для количественного определения иммунореактивности Ki67 (красный) и окрашенных DAPI ядер (синий). Окрашенные DAPI эпителиальные клетки, положительные по сигналу Ki67, подсчитывали, как описано в разделе «Материалы и методы». Процент DAPI-окрашенных эпителиальных клеток, положительных на Ki67, показан для каждой стадии развития справа, где каждая полоса представляет среднее значение ± стандартная ошибка для 5 мышей.**, P < 0,01. B, репрезентативная микрофотография, использованная для количественной оценки сигнала TUNEL (зеленый) и ядер, окрашенных DAPI (синий). Окрашенные DAPI эпителиальные клетки, положительные по сигналу TUNEL, подсчитывали, как описано в разделе «Материалы и методы». Процент DAPI-окрашенных эпителиальных клеток, положительных для TUNEL, показан справа для каждой стадии развития, где каждая полоса представляет среднее значение ± стандартная ошибка для 5 мышей. ** P < 0,01; ***, P < 0,001.

Рисунок 6.

Влияние специфичной для молочной железы абляции XBP1 на пролиферацию и апоптоз MEC.Мышей, несущих XBP1 дикого типа (WT) или нулевой XBP1 в MEC (ΔXBP1 MEC ), убивали на P18 или L5. Берут третью молочную железу и подвергают иммуногистохимии. A, репрезентативная микрофотография, использованная для количественного определения иммунореактивности Ki67 (красный) и окрашенных DAPI ядер (синий). Окрашенные DAPI эпителиальные клетки, положительные по сигналу Ki67, подсчитывали, как описано в разделе «Материалы и методы». Процент DAPI-окрашенных эпителиальных клеток, положительных на Ki67, показан для каждой стадии развития справа, где каждая полоса представляет среднее значение ± стандартная ошибка для 5 мышей.**, P < 0,01. B, репрезентативная микрофотография, использованная для количественной оценки сигнала TUNEL (зеленый) и ядер, окрашенных DAPI (синий). Окрашенные DAPI эпителиальные клетки, положительные по сигналу TUNEL, подсчитывали, как описано в разделе «Материалы и методы». Процент DAPI-окрашенных эпителиальных клеток, положительных для TUNEL, показан справа для каждой стадии развития, где каждая полоса представляет среднее значение ± стандартная ошибка для 5 мышей. ** P < 0,01; ***, P < 0,001.

Абляция XBP1 снижает численность ER и индуцирует маркеры стресса ER во время лактации

Окончательная дифференцировка эпителия молочных желез происходит на поздних сроках беременности и включает развитие обширного компартмента ER (1, 3).В других секреторных клетках отсутствие XBP1 вызывало уменьшение размера и активности ER-компартмента (9, 10, 29). Соответственно, мы исследовали клеточную морфологию MEC с использованием трансмиссионной ЭМ (рис. 7). Компартмент ER был легко виден в WT MEC на P18 и значительно увеличивался в изобилии на L5 (рис. 7, A и B), что согласуется с ключевой ролью, которую играет компартмент ER в секреторной активации (2). Напротив, ленты ER были менее распространены в ΔXBP1 MEC на P18 и полностью не увеличивались в количестве и сложности на L5.Примечательно, что единственные структуры ЭР, видимые на уровне L5, были сломаны и укорочены (рис. 7В). Неспособность развить адекватную сеть ЭР, вероятно, представляет собой второй основной фактор, объясняющий недостаточность лактации у самок ΔXBP1 MEC .

Рисунок 7

Влияние специфичной для молочной железы абляции XBP1 на морфологию ER. Мышей, несущих XBP1 дикого типа (WT) или нулевой XBP1 в MEC (ΔXBP1 MEC ), убивали на P18 или на L5. A, Третья молочная железа была собрана и проанализирована с помощью ЭМ передачи (n = 2–3 самки на генотип и стадию развития).Показаны репрезентативные изображения. Ядро (N) и липидная капля (LD) помечены. Области, заключенные в белые прямоугольники, были выбраны для большего увеличения. B, показаны изображения выбранных областей с большим увеличением. Структуры ЭР обозначены стрелками, а митохондрии (М) помечены.

Рисунок 7

Влияние специфичной для молочной железы абляции XBP1 на морфологию ER. Мышей, несущих XBP1 дикого типа (WT) или нулевой XBP1 в MEC (ΔXBP1 MEC ), убивали на P18 или на L5. A, Третья молочная железа была собрана и проанализирована с помощью ЭМ передачи (n = 2–3 самки на генотип и стадию развития).Показаны репрезентативные изображения. Ядро (N) и липидная капля (LD) помечены. Области, заключенные в белые прямоугольники, были выбраны для большего увеличения. B, показаны изображения выбранных областей с большим увеличением. Структуры ЭР обозначены стрелками, а митохондрии (М) помечены.

Наконец, мы оценили, вызывает ли отсутствие передачи сигналов XBP1 реакцию на стресс ER в эпителиальном компартменте на уровне L5. Белок IRE1α, едва заметный в железах WT, индуцировался в железах ΔXBP1 MEC (фиг. 8A.Мы также оценили количество транскриптов гена XBP1, мишени гомолога синдрома Вольфрама 1 ( Wfs1 ), гомолога DnaJ (Hsp40), подсемейства B, члена 11 (Dnajb11) , и энхансера деградации ER, маннозидазы α-подобной 1 ( Edem1 ). ). Только количество транскриптов Edem1 было значительно снижено в MEC, собранных из ΔXBP1 MEC , по сравнению с MEC дикого типа ( P <0,01) (рис. 8B. Затем мы оценили экспрессию конечных точек, связанных с апоптозом, развивающимся при стрессе ER ( ДНК-индуцируемый транскрипт 3 [ Ddit3 ] мРНК) и при инволюции молочной железы (pY 705 STAT3).Содержание мРНК Ddit3 было увеличено более чем в 6 раз в ΔXBP1 MEC MEC ( P < 0,001) (рис. 8C. Отсутствие XBP1 не изменило содержание STAT3, но привело к увеличению содержания pY на 47%). 705 STAT3, активированный, фосфорилированный по тирозину STAT3 ( P < 0,001) (рис. 8D. Индукция этих апоптотических сигналов в ΔXBP1 MEC MEC не была связана со снижением экспрессии полноразмерного пролактина рецептор (Фигура 8E.Эти данные свидетельствуют о том, что как Ddit3 , так и STAT3-зависимые механизмы играют роль в усилении апоптоза MEC у лактирующих мышей ΔXBP1 MEC .

Рисунок 8

Влияние специфичной для молочной железы аблации XBP1 на маркеры стрессовой реакции ER. Мышей, несущих XBP1 дикого типа (WT) или нулевой XBP1 в MEC (ΔXBP1 MEC ), исследовали на L5. A, общие клеточные экстракты были приготовлены из пятой молочной железы и проанализированы вестерн-иммуноблоттингом с использованием антител, специфичных для IRE1α и актина.B, MEC выделяли из четвертой молочной железы, и общую РНК анализировали с помощью количественной ПЦР в реальном времени на экспрессию генов, отвечающих за XBP1 (гомолог синдрома Вольфрама 1 [ Wfs1 ], гомолог DnaJ Hsp40 [ Dnajb11 ], ER усилитель деградации, подобный маннозидазе α 1 [ Edem1 ]). Экспрессия каждого гена соотносится с уровнем WT, где каждая полоса представляет собой среднее значение ± стандартная ошибка для 5–8 мышей. **, P < 0,01. C. Экспрессию транскрипта 3, индуцируемого повреждением ДНК ( Ddit3 ), анализировали с помощью количественной ПЦР в реальном времени.Экспрессия указана относительно мРНК WT, где каждая полоса представляет среднее значение ± стандартная ошибка для 5–8 самок на генотип. ***, P < 0,001. D. Белковые экстракты молочной железы анализировали с помощью вестерн-иммуноблотинга с использованием антител, специфичных для pY 705 STAT3 и общего STAT3. Общий STAT3 нормализовали по сигналу актина, тогда как pY 705 STAT3 нормализовали по общему сигналу STAT3. Все образцы анализировали на одном и том же блоте, по 2 репрезентативных образца для каждого генотипа. Содержание каждого белка соотносится с уровнем WT, при этом каждая полоса представляет собой среднее значение ± стандартная ошибка для 5 мышей.***, P < 0,001. E, MEC выделяли из четвертой молочной железы, и общую РНК анализировали с помощью количественной ПЦР в реальном времени на экспрессию полноразмерного рецептора пролактина ( Prlr ). Выражение относится к уровню WT, где каждая полоса представляет собой среднее значение ± стандартная ошибка для 5–8 мышей.

Рисунок 8

Влияние специфичной для молочной железы абляции XBP1 на маркеры стрессовой реакции ER. Мышей, несущих XBP1 дикого типа (WT) или нулевой XBP1 в MEC (ΔXBP1 MEC ), исследовали на L5.A, общие клеточные экстракты были приготовлены из пятой молочной железы и проанализированы вестерн-иммуноблоттингом с использованием антител, специфичных для IRE1α и актина. B, MEC выделяли из четвертой молочной железы, и общую РНК анализировали с помощью количественной ПЦР в реальном времени на экспрессию генов, отвечающих за XBP1 (гомолог синдрома Вольфрама 1 [ Wfs1 ], гомолог DnaJ Hsp40 [ Dnajb11 ], ER усилитель деградации, подобный маннозидазе α 1 [ Edem1 ]). Экспрессия каждого гена соотносится с уровнем WT, где каждая полоса представляет собой среднее значение ± стандартная ошибка для 5–8 мышей.**, P < 0,01. C. Экспрессию транскрипта 3, индуцируемого повреждением ДНК ( Ddit3 ), анализировали с помощью количественной ПЦР в реальном времени. Экспрессия указана относительно мРНК WT, где каждая полоса представляет среднее значение ± стандартная ошибка для 5–8 самок на генотип. ***, P < 0,001. D. Белковые экстракты молочной железы анализировали с помощью вестерн-иммуноблотинга с использованием антител, специфичных для pY 705 STAT3 и общего STAT3. Общий STAT3 нормализовали по сигналу актина, тогда как pY 705 STAT3 нормализовали по общему сигналу STAT3.Все образцы анализировали на одном и том же блоте, по 2 репрезентативных образца для каждого генотипа. Содержание каждого белка соотносится с уровнем WT, при этом каждая полоса представляет собой среднее значение ± стандартная ошибка для 5 мышей. ***, P < 0,001. E, MEC выделяли из четвертой молочной железы, и общую РНК анализировали с помощью количественной ПЦР в реальном времени на экспрессию полноразмерного рецептора пролактина ( Prlr ). Выражение относится к уровню WT, где каждая полоса представляет собой среднее значение ± стандартная ошибка для 5–8 мышей.

Обсуждение

Во многих секреторных клетках XBP1 является позитивным регулятором секреции белка посредством регуляции биогенеза и функции ER (9, 10, 29). МЭК уникальны среди профессиональных секреторных клеток своей способностью секретировать не только белки, но и большое количество триглицеридов и лактозы (1–3). ER также важен для синтеза этих двух последних компонентов молока, поскольку сборка триглицеридов и образование капель молочного жира происходят в гладком компартменте ER, тогда как лактоза синтезируется в аппарате Гольджи и секретируется со специфическими для молочной железы белками (т.е. α-, β- и γ-казеин, сывороточный кислый белок) (1, 2).До недавнего времени, однако, единственное свидетельство, указывающее на роль XBP1 в лактации, было предоставлено самками с жировой абляцией, которые производят молоко нормального состава, но, тем не менее, не могут поддерживать нормальный рост детенышей (30). Эти наблюдения заставили нас задаться вопросом, повлияет ли удаление XBP1 в MEC на лактацию.

Теперь мы показываем, что отсутствие XBP1 в MEC вызывало 80%-ный дефицит роста щенков к 14-му дню лактации. Сначала мы спросили, способствовали ли изменения в составе молока этому эффекту XBP1.Молоко от самок ΔXBP1 MEC было ниже по содержанию белка и лактозы. Эти эффекты XBP1 согласовывались с изменениями в экспрессии генов молочного белка Wap и Csn2 , но происходили при отсутствии параллельных изменений в экспрессии генов, кодирующих комплекс лактозосинтазы ( Lalba и B4galt1 ) и фермент, ограничивающий скорость синтеза лактозы ( Gale ). Последнее было неожиданным, поскольку мРНК Gale и уровни активности увеличиваются в начале лактации, а недавно было показано, что XBP1 активирует транскрипцию Gale в печени (31, 32).

Предыдущие исследования показали, что XBP1 является позитивным регулятором липогенеза. В частности, удаление XBP1 в печени нарушало синтез липидов и приводило к снижению циркулирующих уровней триглицеридов и холестерина в плазме (15). Этот фенотип объясняется снижением экспрессии ключевых генов, участвующих в печеночном липогенезе, включая Dgat2 , Scd1 и Acaca (15, 33). Наша работа показывает, однако, что XBP1 оказывает незначительное влияние, поскольку количество жирных кислот с 14 или менее атомами углерода, которые синтезируются исключительно в МЭК (17, 22), имеет тенденцию только к снижению, а общее количество липидов молока фактически увеличивается.Отсутствие основных эффектов на липогенез молочных желез de novo также подтверждается отсутствием влияния XBP1 на экспрессию липогенных генов Fasn , Scd1 и Dgat1 .

XBP1 также участвует в сборке и секреции липидов печени. В частности, секреция ЛПОНП зависит от микросомального белка-переносчика триглицеридов (MTP), гетеродимерного белкового комплекса, который включает компонент протеиндисульфидизомеразы (PDI) (34). Специфическая для печени делеция IRE1α, ER-резидентной эндонуклеазы, ответственной за образование транскрипционно активного XBP1, приводила к умеренному накоплению липидов и снижению секреции триглицеридов без изменений в липогенезе de novo.Снижение экспрессии PDI и активности MTP объясняют нарушение сборки богатых липидами ЛПОНП и нарушение секреции триглицеридов печенью. Восстановление экспрессии XBP1 в культивируемых нулевых IRE1α гепатоцитах полностью восстановило секрецию триглицеридов, экспрессию мРНК PDI и активность MTP, что указывает на то, что XBP1 регулирует секрецию печеночных ЛПОНП (16). Сборка и секреция липидов в MEC осуществляется посредством липидных капель, которые образуются в гладком ER и зависят от специфичных для молочных желез белков butyrophilin и xanthine oxidoreductase (35, 36).Недавно было показано, что другой белок, Cidea, стимулирует секрецию липидов молока путем усиления экспрессии ксантиноксидоредуктазы (37). Активация Btn1a1 , Xdh и Cidea в отсутствие XBP1 может способствовать повышению содержания жира в молоке ΔXBP1 MEC .

Небольшое изменение состава молока самок ΔXBP1 MEC было недостаточным для объяснения 80% дефицита роста их пометов. Поэтому мы исследовали, страдали ли самки ΔXBP1 MEC дефектом развития молочных желез.Несмотря на эффективную делецию XBP1 в MEC на P14, наши результаты показывают, что молочные железы самок ΔXBP1 MEC были морфологически неотличимы от желез WT на поздних сроках беременности и в начале лактации. Не было никаких наблюдаемых различий с точки зрения морфогенеза ветвления и формирования альвеолярной структуры на P14, P18 или L1. Более того, капли молочного жира были одинаково видны в МЭК от самок WT и ΔXBP1 MEC на P18. К тому времени, когда дефицит роста детенышей стал очевидным на L5, заметные дефекты были очевидны в молочной железе самок ΔXBP1 MEC .Во-первых, эпителиальный компартмент не смог полностью проникнуть в молочную железу, что привело к сохранению значительного компартмента жировой ткани. Неспособность MEC полностью занять молочную железу на уровне L5 у самок ΔXBP1 MEC была связана со снижением пролиферации MEC. Интересно, что XBP1 способствовал злокачественному фенотипу посредством стимуляции пролиферативных путей в культивируемых клетках люминального рака молочной железы (38, 39). Кроме того, снижение массы β-клеток поджелудочной железы после удаления XBP1 объяснялось снижением пролиферации без изменений апоптоза (40).Однако в случае MEC отсутствие XBP1 оказывало еще большее влияние на апоптоз, вызывая 5,5-кратную стимуляцию L5. Интересно, что стресс ER, возникающий при делеции XBP1 в ацинарных клетках поджелудочной железы и в клетках Панета, связан с индукцией мРНК Ddit3 и апоптозом (9, 41, 42). Ddit3 кодирует CCAAT-энхансер-связывающий гомологичный белок (CHOP), который представляет собой проапоптотический фактор транскрипции, который индуцируется стрессовой активацией ER протеинкиназы РНК-подобной киназы эндоплазматического ретикулума (PERK) (13, 14).Эти наблюдения повышают вероятность того, что повышенная экспрессия Ddit3 способствует усилению апоптоза в MEC, лишенных XBP1. Мы также отмечаем, что абляция XBP1 увеличивала активацию STAT3, которая, как известно, управляет апоптозом в MEC (43). Эти данные позволяют предположить, что CHOP и STAT3 оба участвуют в стимуляции апоптоза и в индукции инволюционно-подобного фенотипа в молочной железе ΔXBP1 MEC (т.е. меньший эпителиальный компартмент в сочетании со значительной популяцией адипоцитов).

Мы также заметили, что многие альвеолярные структуры были плоскими и оставались незаполненными на уровне L5. Наличие большого количества незаполненных альвеол в железах ΔXBP1 MEC предполагает нарушение биосинтетической активности в MEC. Расширение ER является ключевой особенностью лактогенеза при MEC и необходимо для поддержки обильного синтеза молочной лактозы, белков и триглицеридов (1, 2). Сверхэкспрессия XBP1 индуцирует биогенез ER в культивируемых фибробластах (7, 8), тогда как истощение XBP1 приводит к уменьшению содержания ER в ацинарных клетках поджелудочной железы, слюнных железах и В-клетках плазмы (9, 41, 44).В соответствии с этими данными удаление XBP1 в MEC приводило к снижению количества ER на P18 и отсутствию расширения компартмента ER между P18 и L5. Более того, ленты ER полностью отсутствовали на уровне L5, что, вероятно, налагало серьезные ограничения на способность МЭК секретировать компоненты молока.

Совсем недавно Hasegawa et al. сообщили, что самки мышей XBP1 f/f , несущие фермент CRE под контролем промотора мезенхимального специфического глиального фибриллярного белка человека, неожиданно подверглись абляции XBP1 в MEC (45).Подобно самкам ΔXBP1 MEC , которые мы изучали, у этих самок во время лактации наблюдалось уменьшение компартмента эпителиальных клеток и наблюдался существенный дефект лактации. Однако мы отмечаем существенные различия между этими двумя моделями и в интерпретации результатов. Во-первых, они объяснили меньший размер эпителиального компартмента после абляции XBP1 снижением пролиферации, даже несмотря на то, что проапоптотический маркер CHOP был повышен, тогда как мы задействовали как пролиферацию, так и апоптоз. Во-вторых, они сделали вывод о существенном снижении дифференцировки МЭК и качества молока после удаления XBP1 из экспрессии генов (45).Тем не менее, они выполнили все анализы экспрессии генов на общей РНК, выделенной из всей железы на 7-й день лактации, когда компартмент жировой ткани исчез у WT, но остается значительным у самок с абляцией XBP1 (см. Рисунок 5B). работа экспрессии в MEC, свободной от загрязняющих адипоцитов, мы показываем, что абляция XBP1 оказывает в лучшем случае умеренное влияние на состав молока и непостоянные эффекты на экспрессию связанных генов. В-третьих, мы наблюдали почти полное отсутствие сложной сети ER в период лактации при отсутствии XBP1, который в сочетании с меньшим эпителиальным компартментом, вероятно, объясняет неадекватную секрецию молока.Наконец, они предложили модель, согласно которой отсутствие XBP1 приводит к снижению количества мРНК рецептора пролактина с последующей потерей большей части лактогенных эффектов пролактина. Наши результаты не согласуются с этой моделью. Во-первых, мы показываем, что развитие молочных желез происходило нормально между P14 и L1, хотя XBP1 уже был удален на P14. Снижение экспрессии пролактиновых рецепторов в этот период должно приводить к нарушению развития, поскольку действие пролактина у мышей одинаково важно как в последнюю треть беременности, так и в период лактации (1, 46).Действительно, инактивации одного аллеля рецептора пролактина у мышей достаточно, чтобы полностью остановить формирование альвеол и дифференцировку MEC между P14 и лактацией (47). Во-вторых, используя тотальную РНК, выделенную из очищенных MEC, а не всю железу, мы не обнаружили влияния абляции XBP1 на экспрессию полноразмерного рецептора пролактина.

В заключение, наши результаты показывают, что XBP1 необязателен для морфологически нормального развития молочных желез в течение последней трети беременности, но абсолютно необходим для лактации.В отсутствие XBP1 компартмент MEC значительно снижается во время лактации вследствие снижения пролиферации и усиления апоптоза. Более того, MEC не удалось разработать компартмент ER достаточного размера и сложности, чтобы обеспечить обильную секрецию основных органических компонентов молока.

Благодарности

Мы благодарим д-ра Л. Глимчера за предоставление мышей XBP1 с флоксом и д-ра Р. Вайса за предоставление мышей BLG-Cre. Мы также благодарим доктора Дж. М.Ramos-Nieves за помощь во время исследования лактации и Mr R. Cowan за помощь в анализе изображений.

Эта работа была частично поддержана средствами, предоставленными Колледжем сельского хозяйства и естественных наук Корнельского университета.

Раскрытие информации Резюме: Авторам нечего раскрывать.

Сокращения

  • B4galt1

    UPD-Гал: βGlcNAc β1,4-галактозилтрансфераза, полипептид 1

  • Btn1a1

    butyrophilin, подсемейство 1, член A1

  • Cidea

    гибели клеток, индуцирующий ДНК-фактор фрагментации, альфа-субъединица типа эффекторной А

  • DAPI

    4 ‘, 6-диамидино-2-фенилиндол дигидрохлорид

  • Ddit3

    повреждений

    ДНК индуцируемый транскрипт 3

  • DGAT1

    диацилглицерин О-ацилтрансферазы 1

  • Edem1

    деградации ЭР энхансер маннозидаза α-подобный 1

  • ЕМ

  • ER

  • FASN

  • Gale

    галактозы -4-эпимераза, UDP

  •  
  • IRE1α

    инозитол-требующая фермент 1α

  • л

  • Lalba

  • MEC

  • МТР

    микросомального белка триглицерид-передачи

  • Р

  • ППД

    дисульфид

    белка изомеразы

  • scd1

    стеароил-Коэнзим десатуразу 1

  • STAT3

    преобразователь сигнала и активатор транскрипции 3

  • TUNEL

    ТДТ-опосредованной дУТФ ник-конец маркировки

  • ЛОНП

    очень низкой плотности липопротеин

  •  
  • WT

  •  
  • XBP1

  •  
  • Xdh 7 3 Ссылки 1

    Невилл

    МС

    .

    Лактация и ее гормональный контроль

    . В:

    Neill

    JD

    , изд.

    Физиология репродукции Кнобита и Нейла

    .

    том 2

    . 3-е изд.

    Амстердам, Нидерланды

    :

    Elsevier Academic Press

    ;

    2006

    :

    2993

    3054

    .2

    Anderson

    SM

    ,

    Rudolph

    MC

    ,

    McManaman

    JL

    ,

    Neville

    MC

    .

    Ключевые этапы развития молочной железы. Секреторная активация в молочной железе: речь идет не только о синтезе молочного белка!

    Рак молочной железы Res

    .

    2007

    ;

    9

    :

    204

    .3

    Акерс

    RM

    .

    Лактация и молочная железа

    . 1-е изд.

    Ames, IA

    :

    Iowa State Press

    ;

    2002

    .4

    Akers

    RM

    ,

    Bauman

    DE

    ,

    Goodman

    GT

    ,

    Capuco

    AV

    ,

    Tucker

    HA

    .

    Регуляция пролактином цитологической дифференцировки эпителиальных клеток молочных желез у коров в периродовой период

    .

    Эндокринология

    .

    1981

    ;

    109

    :

    31

    40

    .5

    Фагоне

    P

    ,

    Яцковски

    S

    .

    Мембранный синтез фосфолипидов и функция эндоплазматического ретикулума

    .

    J Липидный рез

    .

    2009

    ;

    50

    (

    доп.

    ):

    S311

    S316

    .6

    Fu

    S

    ,

    Watkins

    SM

    ,

    Hotamisligil

    GS

    .

    Роль эндоплазматического ретикулума в липидном гомеостазе печени и передаче сигналов стресса

    .

    Сотовый Метаб

    .

    2012

    ;

    15

    :

    623

    634

    .7

    Sriburi

    R

    ,

    Bommiasamy

    H

    ,

    Buldak

    GL

    , et al. .

    Координированная регуляция биосинтеза фосфолипидов и экспрессии генов секреторного пути в XBP-1(S)-индуцированном биогенезе эндоплазматического ретикулума

    .

    J Биол Хим

    .

    2007

    ;

    282

    :

    7024

    7034

    .8

    Sriburi

    R

    ,

    Jackowski

    S

    ,

    Mori

    K

    ,

    Brewer

    JW

    .

    XBP1: связь между реакцией развернутого белка, биосинтезом липидов и биогенезом эндоплазматического ретикулума

    .

    J Cell Biol

    .

    2004

    ;

    167

    :

    35

    41

    .9

    Lee

    AH

    ,

    Chu

    GC

    ,

    Iwakoshi

    NN

    ,

    Glimcher

    LH

    .

    XBP-1 необходим для биогенеза клеточного секреторного аппарата экзокринных желез

    .

    EMBO J

    .

    2005

    ;

    24

    :

    4368

    4380

    .10

    HUH

    WJ

    ,

    ESEN

    E

    ,

    Geahlen

    JH

    , et al. .

    XBP1 контролирует созревание зимогенных клеток желудка путем индукции MIST1 и расширения шероховатого эндоплазматического ретикулума

    .

    Гастроэнтерология

    .

    2010

    ;

    139

    :

    2038

    2049

    .11

    Hetz

    C

    .

    Реакция развернутого белка: контроль решений клеточной судьбы при стрессе ER и после него

    .

    Nat Rev Mol Cell Biol

    .

    2012

    ;

    13

    :

    89

    102

    .12

    Мур

    КА

    ,

    Холлиен

    Дж

    .

    Реакция развернутого белка в секреторной функции клеток

    .

    Анну Рев Жене

    .

    2012

    ;

    46

    :

    165

    183

    .13

    Уолтер

    P

    ,

    Рон

    D

    .

    Реакция развернутого белка: от пути стресса к гомеостатической регуляции

    .

    Наука

    .

    2011

    ;

    334

    :

    1081

    1086

    .14

    Hetz

    C

    ,

    Martinon

    F

    ,

    Rodriguez

    D

    ,

    Glimcher

    LH

    .

    Реакция развернутого белка: интеграция сигналов стресса через датчик стресса IRE1α

    .

    Физиол Ред.

    .

    2011

    ;

    91

    :

    1219

    1243

    .15

    Lee

    AH

    ,

    SCAPA

    EF

    ,

    Cohen

    DE

    ,

    Glimcher

    LH

    .

    Регуляция липогенеза в печени фактором транскрипции XBP1

    .

    Наука

    .

    2008

    ;

    320

    :

    1492

    1496

    . .

    IRE1α-XBP1s индуцирует экспрессию PDI для повышения активности MTP для сборки ЛПОНП в печени и гомеостаза липидов

    .

    Сотовый Метаб

    .

    2012

    ;

    16

    :

    473

    486

    .17

    Рудольф

    MC

    ,

    Невилл

    MC

    ,

    Андерсон

    SM

    .

    Синтез липидов в период лактации: диета и переход на жирные кислоты

    .

    J Биол. неоплазия молочной железы

    .

    2007

    ;

    12

    :

    269

    281

    .18 Yazinski

    С.А.,

    Уэсткотта

    PM,

    Онг

    К,

    Пинкасова

    J

    ,

    Петерс RM

    ,

    Вайс

    РС

    .

    Двойная инактивация Hus1 и p53 в молочной железе мыши приводит к накоплению поврежденных клеток и нарушению регенерации тканей

    .

    Proc Natl Acad Sci USA

    .

    2009

    ;

    106

    :

    21282

    21287

    . .

    Эффективная BLG-Cre-опосредованная делеция гена в молочной железе

    .

    Трансгенный рез

    .

    1998

    ;

    7

    :

    387

    396

    .20

    Невилл

    MC

    ,

    Webb

    P

    ,

    Ramanathan

    P

    , et al. .

    Рецептор инсулина играет важную роль в секреторной дифференцировке молочной железы

    .

    Am J Physiol Endocrinol Metab

    .

    2013

    ;

    305

    :

    E1103

    E1114

    .21

    DePeters

    EJ

    ,

    Hovey

    RC

    .

    Методы сбора молока у мышей

    .

    J Биол. неоплазия молочной железы

    .

    2009

    ;

    14

    :

    397

    400

    .22

    Harvatine

    KJ

    ,

    Robble

    MM

    ,

    Thorn

    SR

    ,

    Boishlair

    .

    Транс-10, цис-12 CLA в зависимости от дозы ингибирует синтез молочного жира без нарушения лактации у мышей C57BL/6J

    .

    Дж Нутр

    .

    2014

    ;

    144

    :

    1928

    1934

    .23

    Boumahrou

    N

    ,

    Andrei

    S

    ,

    Miranda

    G

    , et al. .

    Пересмотр основной белковой фракции мышиного молока с использованием проверенных протеомных инструментов

    .

    J Физиол Фармакол

    .

    2009

    ;

    60

    (

    Suppl 3

    ):

    113

    118

    .24

    Fiorotto

    ML

    ,

    Burrin

    DG

    ,

    Perez

    M

    ,

    Reeds

    .

    Потребление и использование питательных веществ молока крысятами, вскармливаемыми маленькими, средними или большими пометами

    .

    Am J Physiol

    .

    1991

    ;

    260

    :

    R1104

    R1113

    .25

    Rudolph

    MC

    ,

    Wellberg

    EA

    ,

    Anderson

    SM

    .

    Эпителиальные клетки и органоиды молочных желез, обедненные жировой тканью

    .

    J Биол. неоплазия молочной железы

    .

    2009

    ;

    14

    :

    381

    386

    .26

    Rudolph

    MC

    ,

    Wellberg

    EA

    ,

    Lewis

    AS

    , et al. .

    Белок Spot14, чувствительный к гормонам щитовидной железы, усиливает катализ синтазы жирных кислот в эпителии лактирующих молочных желез

    .

    J Липидный рез

    .

    2014

    ;

    55

    :

    1052

    1065

    .27

    Thorn

    SR

    ,

    Giesy

    SL

    ,

    Myers

    мг

    JR,

    Boisclair

    YR

    .

    Рост протоков молочных желез нарушен у мышей, лишенных лептин-зависимого преобразователя сигналов и активатора передачи сигналов транскрипции 3

    .

    Эндокринология

    .

    2010

    ;

    151

    :

    3985

    3995

    .28

    Ришерт

    мм

    ,

    Schwertfeger

    KL

    ,

    Ryder

    JW

    ,

    Anderson

    .

    Атлас развития молочной железы мыши

    .

    J Биол. неоплазия молочной железы

    .

    2000

    ;

    5

    :

    227

    241

    .29

    Lee

    AH

    ,

    Iwakoshi

    NN

    ,

    Glimcher

    LH

    .

    XBP-1 регулирует подгруппу резидентных шаперонных генов эндоплазматического ретикулума в реакции развернутого белка

    .

    Мол Селл Биол

    .

    2003

    ;

    23

    :

    7448

    7459

    .30

    GREGOR

    MF

    ,

    MICH

    ES

    ,

    Yang

    L

    , et al..

    Роль адипоцита XBP1 в регуляции метаболизма в период лактации

    .

    Представитель ячейки

    .

    2013

    ;

    3

    :

    1430

    1439

    .31

    Deng

    Y

    ,

    Wang

    ZV

    ,

    TAO

    C

    , et al. .

    Ось Xbp1s/GalE связывает стресс ER с постпрандиальным печеночным метаболизмом

    .

    Дж Клин Инвест

    .

    2013

    ;

    123

    :

    455

    468

    .32

    Prestoz

    LL

    ,

    Daude

    N

    ,

    Cournu

    I

    ,

    Shin

    YS

    ,

    Petry

    KG

    .

    Дифференциальная ферментативная активность УДФ-галактозо-4′-эпимеразы (GALE) и экспрессия мРНК в молочной железе крыс во время лактации

    .

    Письмо FEBS

    .

    1998

    ;

    431

    :

    391

    394

    .33

    Ning

    J

    ,

    Hong

    T

    ,

    Ward

    A

    , et al..

    Конститутивная роль сигнального пути IRE1α-XBP1 в инсулин-опосредованной программе липогенеза в печени

    .

    Эндокринология

    .

    2011

    ;

    152

    :

    2247

    2255

    .34

    Сундарам

    М

    ,

    Яо

    Z

    .

    Недавний прогресс в понимании белковых и липидных факторов, влияющих на сборку и секрецию ЛПОНП в печени

    .

    Нутр Метаб (Лондон)

    .

    2010

    ;

    7

    :

    35

    .35

    OGG

    SL

    ,

    Weldon

    AK

    ,

    Dobbie

    L

    ,

    Smith

    AJ

    ,

    Mather

    IH

    .

    Экспрессия бутирофилина (Btn1a1) в лактирующей молочной железе необходима для регулируемой секреции липидных капель молока

    .

    Proc Natl Acad Sci USA

    .

    2004

    ;

    101

    :

    10084

    10089

    .36

    McManaman

    JL

    ,

    Palmer

    CA

    ,

    Wright

    RM

    ,

    Neville

    MC

    .

    Функциональная регуляция экспрессии и локализации ксантиноксидоредуктазы в молочной железе мыши: свидетельство роли в секреции липидов

    .

    J Физиол

    .

    2002

    ;

    545

    :

    567

    579

    .37

    Wang

    W

    ,

    LV

    N

    ,

    Zhang

    S

    , et al. .

    Cidea является важным коактиватором транскрипции, регулирующим секрецию липидов молока молочной железой

    .

    Nat Med

    .

    2012

    ;

    18

    :

    235

    243

    .38

    GOMEZ

    BP

    ,

    RIGGINS

    RB

    ,

    Shajahan

    An

    , et al. .

    X-box-связывающий белок-1 человека придает как независимость от эстрогена, так и устойчивость к антиэстрогенам в клеточных линиях рака молочной железы

    .

    FASEB J

    .

    2007

    ;

    21

    :

    4013

    4027

    .39

    Андрес

    SA

    ,

    Wittliff

    JL

    .

    Взаимосвязь экспрессии ESR1 и XBP1 в карциноме молочной железы человека и стромальных клетках, выделенных микродиссекцией с лазерным захватом, по сравнению с интактной тканью рака молочной железы

    .

    Эндокринный

    .

    2011

    ;

    40

    :

    212

    221

    .40

    Lee

    AH

    ,

    Heidtman

    K

    ,

    Hotamisligil

    GS

    ,

    Glimcher

    LH

    .

    Двойная и противоположная роль ответа развернутого белка, регулируемого IRE1α и XBP1, в процессинге проинсулина и секреции инсулина

    .

    Proc Natl Acad Sci USA

    .

    2011

    ;

    108

    :

    8885

    8890

    .41

    HESS

    DA

    ,

    Humphrey

    SE

    ,

    Ishibashi

    J

    , et al. .

    Обширная регенерация поджелудочной железы после ацинарного разрушения Xbp1 у мышей

    .

    Гастроэнтерология

    .

    2011

    ;

    141

    :

    1463

    1472

    .42

    Kaser

    A

    ,

    Lee

    AH

    ,

    Franke

    A

    , et al..

    XBP1 связывает стресс ER с воспалением кишечника и придает генетический риск воспалительного заболевания кишечника человека

    .

    Сотовый

    .

    2008

    ;

    134

    :

    743

    756

    .43

    Chapman

    RS

    ,

    Lourenco

    PC

    ,

    Tonner

    E

    , et al. .

    Подавление эпителиального апоптоза и замедленная инволюция молочной железы у мышей с условным нокаутом Stat3

    .

    Гены Дев

    .

    1999

    ;

    13

    :

    2604

    2616

    .44

    Todd

    DJ

    ,

    Mcheyzer-Williams

    LJ

    ,

    Kowal

    C

    , et al. .

    XBP1 регулирует поздние события дифференцировки плазматических клеток и не требуется для развития антиген-специфических В-клеток памяти

    .

    J Exp Med

    .

    2009

    ;

    206

    :

    2151

    2159

    .45

    Hasegawa

    D

    ,

    Calvo

    V

    ,

    Avivar-Valderas

    A

    , et al..

    Эпителиальный Xbp1 необходим для клеточной пролиферации и дифференцировки во время развития молочной железы

    .

    Мол Селл Биол

    .

    2015

    ; .

    Действие гормонов на молочную железу

    .

    Колд Спринг Харб Перспект Биол

    .

    2010

    ;

    2

    :

    a003178

    .47

    Allan

    GJ

    ,

    Tonner

    E

    ,

    Barber

    MC и др.,

    MC и др..

    Гормон роста, частично действуя через ось инсулиноподобного фактора роста, восстанавливает активность развития, но не метаболическую активность в молочной железе мышей, экспрессирующих один аллель рецептора пролактина

    .

    Эндокринология

    .

    2002

    ;

    143

    :

    4310

    4319

    .

    Copyright © 2016 Эндокринное общество

    No se encontró la página – Амамантар Астуриас

    En cumplimiento con lo dispuesto en el articulo 22.2 de la Ley 34/2002, de 11 de julio, de Servicios de la Sociedad de la Información y de Comercio Electrónico, le informamos a continuación acerca de nuestra politica de recogida y tratamiento de cookies.

    ¿Qué son las cookies?

    Единый файл cookie является файлом, который используется для загрузки веб-страниц. Файлы cookie разрешены на веб-странице, между другими странами, almacenar y recuperar information sobre los habitos de navegación de un usuario o de su equipo y, dependiendo de la información que contengan y de la forma en que utilice su equipo, pueden utilizarse para reconocer аль усуарио.

    La ley vigente allowe que almacenemos cookies en su dispositivo si estas son estrictamente necesarias para el funcionamiento de esta página. Así, пункт todos лос demás типос де cookie necesitamos су permiso.

    ¿Qué tipos de cookies utilizamos?

    Continuacion informamos a nuestros usuarios que esta página web utiliza tipos diferentes de cookies que pueden ser clasificadas del siguiente modo.

    После завершения:

    Технологические или необходимые файлы cookie: ограничения, необходимые для корректировки функциональности веб-сайта.Periodo de conservación: fin de sesion.

    Cookies estadísticas o análisis: nosayudan comprender cómo Interactive Los Visitantes Con La Página Web Reuniendo y Proporcionando información de forma anónima. Periodo de conservación: fin de sesion.

    Файлы cookie для персонализации: не разрешено записывать информацию о том, что является камбией, или в соответствии с веб-сайтом, в соответствии с настройками пользователя. Период консервации: 24 месяца.

    Según el tiempo que permanecen activadas:

    Cookies de Sesión: aquellas que guardan exclusivamente información del usuario durante el tiempo que dura su visita a nuestra página web.

    Cookies Persistentes: aquellas que retienen información de usuarios que acceden repetidas veces a nuestra página web, recordando las Prerencias seleccionadas.

    Según la entidad que las gestiona:

    Cookies propias: aquellas gestionadas por nuestra página web a la que el usuario accede y solicita su servicio.

    Cookies de terceros: aquellas colocadas por servicios de terceros que aparecen en nuestra página web (через Google или Youtube).

    Деактивация или удаление файлов cookie

    El usuario, en su primer accesso al site web puede configurar y aceptar o rechazar las cookies en el Presente Sitio Web.Posteriormente usted podrá permissionir, bloquear o eliminar las cookies instaladas en su equipo mediante la configuración de las opciones del navegador instalado en su ordenador.

    Продолжение доступа к конфигурации навигационных веб-сайтов для часто используемых файлов cookie, установка или деактивация файлов cookie:

    Cómo eliminar las cookies в Mozilla Firefox

    Cómo eliminar las cookies в Google Chrome

    Cómo eliminar las cookies en Safari

    ¿Qué ocurre si desactivo las cookies?

    Si rechaza o desactiva algunas de las cookies instaladas, puede que el site web no funcione correctamente y no sea posible adapter los contenidos, o apariencia de la navegación, a las Prerencias Personales de Cada Usuario (зона географики, французская хорария).Asimismo, no será posible allowir la interacción de nuestras publicaciones en las redes sociales.

    Защита персональных данных

    Разрешение на использование файлов cookie в веб-сайте, позволяющее получить информацию, которая используется, сус предпочтения или су диспозитиво, разрешение на исправление веб-функции сайта; sin que se recabe information sensible. Por lo general no es posible la identificación directa del usuario por la información almacenada en las cookies, no obstante, puede obtener más información sobre quiénes somos, cómo puede contactarnos y cómo tratamos sus datos personales en nuestra Política de Privacidad.

    Modificaciones de la Política de Cookies

    ASOCIACION DE MUJERES DE APOYO A LA LACTANCIA AMAMANTAR se reserva el derecho a modificar la Presente Política de Cookies, siempre en los términos licensedos por la legislación española vigente y previa comunicación a los interesados, bien mediante cmedio publicación en esta де comunicación о difusión дие себе рассмотреть возможность.

    Si tiene dudas sobre esta politica de cookies, puede contactar con nosotros a través de la siguiente dirección:
    [email protected]сеть /[email protected]

    Más información sobre nuestra politica de cookies

    Смешанная опухоль молочной железы у собак с экстрамедуллярным кроветворением и образованием кости

    Кристина Руотсало  

     

    Лаборатория здоровья животных, Университет Гвельфа, Гвельф, Онтарио.

    Информационный бюллетень АХЛ 2020;24(2):22.

     

    Прямые мазки, полученные из тонкоигольной аспирации 1 см образования, связанного с правой каудальной молочной железой у 9-летней интактной суки смешанной породы, были представлены для цитологического исследования.В остальном собака была клинически здорова.

    Предметные стекла содержали геморрагический фон с ограниченным количеством эпителиальных клеток, присутствующих в небольших сплоченных однородных скоплениях. Также присутствовало ограниченное количество пухлых стромальных клеток, которые иногда обнаруживались погруженными в слегка эозинофильный внеклеточный матрикс. Также был обнаружен более интенсивно окрашивающийся эозинофильный матрикс, связанный с небольшим количеством остеокластов и остеобластов, что наводило на мысль о кости. Были очевидны очаги слегка базофильного материала, соответствующего коллагену.Наиболее заметной особенностью этого образца было наличие многочисленных гемопоэтических предшественников. Идентифицированы все стадии эритроидных и гранулоцитарных предшественников, отмечены редкие мегакариоциты (рис. 1).

    Эти цитологические особенности соответствовали смешанной опухоли молочной железы с признаками экстрамедуллярного кроветворения и костной ткани.

    Как и при всех новообразованиях молочной железы, было рекомендовано иссечение и гистологическое исследование. Гистология подтвердила диагноз смешанной опухоли молочной железы, содержащей хрящ, кость и ограниченное количество гемопоэтических клеток (рис.2). Эпителиальные клетки выглядели однородными и имели трубчатые образования без признаков инвазии в окружающие ткани; таким образом, эта опухоль была охарактеризована как доброкачественная.

    Смешанные опухоли молочной железы составляют до 50-65% опухолей молочной железы собак и содержат эпителиальные, фибробластные, хрящевые, костные и редко гемопоэтические компоненты. Смешанные карциномы молочной железы встречаются редко. Из 384 смешанных опухолей молочной железы, исследованных в одном исследовании, только в 4% наблюдалось как экстрамедуллярное кроветворение всех трех клеточных линий, как отмечено в этом случае, так и наличие кости.Основная причина экстрамедуллярного кроветворения молочной железы (EMH) неизвестна. Несколько предложенных гипотез включают: нарушение костного мозга (например, связанное с лекарственной терапией, миелофиброзом, неоплазией костного мозга), которое стимулирует циркулирующие стволовые клетки находить благоприятную среду и дифференцироваться в гемопоэтические клетки; очаговые поражения тканей, которые могут индуцировать выработку факторов роста или цитокинов, которые активируют стволовые клетки, уже присутствующие в этих опухолях.

    Цитологическое исследование новообразований в цепи молочной железы может использоваться для исключения воспаления или наличия других образований немаммарного происхождения.Однако настоятельно рекомендуется гистологическое исследование всех опухолей молочной железы. Точная диагностическая цитология опухолей молочной железы связана со многими проблемами. Стромальные опухоли молочной железы могут плохо расслаиваться. Гетерогенная природа некоторых опухолей может привести к выборке или эксфолиации только одного типа клеток. Гиперплазия молочных желез, дисплазия, доброкачественные эпителиально-клеточные опухоли и хорошо дифференцированные карциномы образуют континуум морфологических проявлений, что часто затрудняет цитологическую дифференциацию.Воспаление может привести к цитологическим изменениям, имитирующим злокачественные новообразования. Наконец, следует отметить, что наличие тканевой, лимфатической или кровеносной инвазии опухолевыми клетками, которая была идентифицирована как один из наиболее значимых гистологических критериев злокачественности в опухолях молочной железы собак, не может быть оценена с помощью цитологии. АГЛ

     

    Рисунок 1. Цитологические особенности смешанной опухоли молочной железы у собак с признаками гемопоэтических клеток (открытая стрелка), внеклеточного матрикса (звездочка) и остеокластов (стрелка).(Фото: Р. Иган, АХЛ).

    Рис. 2. Гистологические срезы доброкачественной смешанной опухоли молочной железы собаки с дольками молочной железы (стрелка, рис. 2А) и костным мозгом среди трабекулярной кости (звездочка, рис. 2А). Костный мозг (незаштрихованные стрелки, рисунок 2B) среди трабекулярной кости. (Фото: Р. Иган, AHL; Л. Татиерски, Vetpath Canada).

    Ссылки
    1.Аулер П. и др. Миелоидная метаплазия в смешанных опухолях молочной железы собак – возникновение и характеристика. Ветеринар Q 2011:31(4):173-7.
    2. Simon D et al. Диагностическая точность по сравнению с гистопатологией и связь с послеоперационным исходом. Ветклиника

        Патол 2009:38(4):521-528.
    3. Гольдшмидт М., Пена Л., Расотто Р., Заппулли В. Классификация и классификация опухолей молочной железы у собак. Vet Path  
        2011:48(1):117-131.
    4. Grandi F et al. Экстрамедуллярный гемопоэз при доброкачественной смешанной опухоли молочной железы у суки: цитологическая и
    гистопатологическая оценка.

Написать ответ

Ваш адрес email не будет опубликован.