5. Клеточные компоненты

Молочная железа и окружающая ее строма состоят из различных типов клеток, составляющих микроокружение молочной железы. Клетки, составляющие нишу молочной железы, включают эпителиальные клетки, адипоциты, фибробласты, эндотелиальные клетки, нервные клетки и лимфоидные клетки. Подсчитано, что эти клетки либо являются поддерживающими клетками, либо играют роль в секретировании растворимых факторов, либо регулируются развитием молочной железы [27-29].Было показано, что макрофаги и, возможно, их сигналы необходимы для развития протоков, а также для поддержки функции стволовых клеток молочной железы (рис. 2) [30, 31]. В отсутствие макрофагов или колониестимулирующего фактора-1 (CSF-1) функция стволовых клеток молочной железы, включая потенциал роста и способность к регенерации, серьезно нарушена [30]. Макрофаги, эозинофилы и их соответствующие цитокины, включая CSF-1 и эотаксин, необходимы для формирования терминальных зачатков. Эти клетки также обнаруживаются вблизи ацинусов молочной железы во время беременности и лактации [32].Ландскронер-Эйгер и др. и Кулдри и др. обнаружили, что адипоциты необходимы для формирования протоков молочных желез в период полового созревания (рис. 2) [33, 34]. Кроме того, было обнаружено, что адипоциты поддерживают альвеолярные зачатки, формирующиеся во время беременности [33]. В отсутствие адипоцитов формируются рудиментарные структуры в молочной железе, но ветвления протоков не происходит [34]. Наконец, было обнаружено, что стромальные фибробласты влияют на морфогенез эпителиальных клеток молочной железы человека (рис. 2) [35].

6. Диффундирующие факторы

6.1. Гормоны и их рецепторы

В молочной железе обычно находятся два основных гормона, которые необходимы для нормального развития молочной железы: эстроген и прогестерон (рис. 2). В период полового созревания развитие протоков обусловлено преимущественно эстрогеном [20]. У зрелых девственниц прогестерон регулирует боковое разветвление протоков, в то время как пролактин, прогестерон, плацентарные лактогены и ErbB4 инициируют формирование альвеолярных зачатков во время беременности [20].Во время лактации пролактин и ErbB4 обычно стимулируют выработку молока [20].

Кроме того, рецепторы гормонов, рецептор эстрогена (ER) и рецептор прогестерона (PR), необходимы для развития молочной железы. В частности, ER- α преимущественно экспрессируется в клетках просвета, но также может быть обнаружен в ядрах эпителиальных клеток протоков (рис. 2) [21]. ER- α обычно не экспрессируется в миоэпителиальных клетках [21]. Большинство ER- α -позитивных клеток являются негативными по Ki-67 во время пременопаузы, что свидетельствует о том, что большинство ER- α -позитивных клеток не подвергаются пролиферации в течение этого времени.Однако с возрастом женщины количество ER- α -позитивных клеток, подвергающихся пролиферации, увеличивается, в конечном итоге достигая плато после менопаузы [21]. Потеря ER- α связана с нарушением ветвления и удлинения протоков молочной железы [36, 37]. Также известно, что второй рецептор эстрогена, ER-β, экспрессируется в молочной железе. ER- β экспрессируется в эпителиальных клетках протоков и долек, а также в миоэпителиальных клетках и клетках стромы.

PR экспрессируется в просветных эпителиальных клетках протоков и долек (рис. 2). Данные показали, что образование как PR-позитивных, так и PR-негативных клеток опосредовано прогестероном [36]. Однако, в отличие от ER- α , PR не зависит от стадии менструации [21]. В модели мышей с мутацией PR -/- (где транскрипция как A, так и B форм PR нарушена) развитие секреторных альвеол нарушено [36, 37].

Рецепторы эстрогена, в частности, опосредованы членом семейства эпидермальных факторов роста амфирегулином (рис. 2) [37, 38].Амфирегулин, гепарин-связывающий, гликозилированный белок, необходим для развития протоков и терминальных зачатков [39]. В молочных железах млекопитающих в период полового созревания амфирегулин экспрессируется в миоэпителиальных клетках, люминальных клетках и колпачковых клетках, расположенных в терминальной концевой почке [39].

6.2. Cytokines

В поддержании клеток-предшественников молочных желез участвуют два основных пути передачи сигналов цитокинов: RANKL и Wnt/ β -catenin. Wnt4, в частности, является ключевым фактором, который опосредует прогестерон и, таким образом, боковое ветвление молочной железы (рис. 2) [40].Кроме того, добавление белка Wnt3A к стволовым клеткам молочных желез в культуре приводит к размножению стволовых клеток в последующих поколениях (рис. 2) [41]. При трансплантации стволовые клетки, обработанные белком Wnt3A, демонстрировали устойчивый рост по сравнению с имплантированными необработанными стволовыми клетками молочной железы [41]. С другой стороны, было показано, что активатор рецептора ядерного фактора- κβ лиганда (RANKL) опосредует пролиферативный ответ эпителия молочной железы мышей на прогестерон во время лактационного морфогенеза молочной железы (рис. 2) [42].Кроме того, Фата и соавт. показали, что молочные железы RANK- и RANKL-дефицитных мышей демонстрируют нормальное развитие желез во время полового созревания, но не формируют лобулоальвеолярные структуры во время беременности [43]. Кроме того, было обнаружено, что RANKL увеличивает пролиферацию дочерних клеток, которые образуются после асимметричного деления стволовых клеток [44, 45].

6.3. Факторы роста

В молочной железе суперсемейство трансформирующего фактора роста β (TGF- β ) играет решающую роль в развитии железы.Три лиганда TGF- β , TGF- β 1, TGF- β 2 и TGF- β 3 передают сигнал через рецепторы TGF- β типа I и II. Фосфорилирование рецепторов приводит к передаче сигналов через один из четырех основных путей: сигнальный путь Smad и PI3-киназу, а также пути TAK1 и RhoA [46]. Изоформы TGF- β , в частности, помогают поддерживать тканевой гомеостаз в концевых зачатках и протоках молочных желез путем ограничения клеточной пролиферации (Рис. 2) [47].Было обнаружено, что отсроченное формирование протоков связано со сверхэкспрессией TGF- β 1 [47]. Кроме того, было замечено увеличение экспрессии TGF- β во время беременности [48]. Наконец, было обнаружено, что TGF- β 1, TGF- β 2 и особенно TGF- β 3 увеличивают экспрессию во время инволюции, что указывает на роль в железистом апоптозе [49].

TGF- β также является основным индуктором эпителиально-мезенхимального перехода (ЭМП).Во время ЭМП утрачивается клеточная экспрессия белков, участвующих в адгезии [50]. Одновременно эти клетки теряют все характеристики, относящиеся к эпителиальному фенотипу [50]. С другой стороны, клетки, подвергшиеся EMT, обнаруживают повышенную экспрессию мезенхимальных белков, таких как α-гладкомышечный актин и виментин [50]. В результате эти клетки проявляют повышенную способность к миграции. Клетки, которые обычно подвергаются EMT, включают клетки-предшественники и опухолевые клетки [51, 52]. TGF- β , в частности, является мощным индуктором Snail1, который, в свою очередь, увеличивает экспрессию провоспалительных интерлейкинов, таких как интерлейкин 6 (IL-6) [53].Повышенные уровни в сыворотке IL-6, плейотропного цитокина, коррелируют с поздней стадией опухоли молочной железы, метастазированием и плохим прогнозом [54]. Было показано, что клетки метастатического рака молочной железы MCF7 конститутивно экспрессируют IL-6, что связано с повышенной экспрессией Snail1 и Twist1 и проявляют фенотип EMT [55].

Другие индукторы развития молочной железы, влияющие на микроокружение молочной железы, включают преобразователь сигнала и активатор транскрипции-5a (STAT5a), STAT5b и семейство факторов роста эпидермального фактора роста (EGF) и их рецепторы.И STAT5a, и STAT5b передают сигнал через рецептор пролактина, чтобы контролировать пролиферацию и дифференцировку молочной железы (рис. 2) [20]. Было обнаружено, что инактивация STAT 5a приводит к нарушению лактации, хотя пролиферация и расширение альвеолярного компартмента происходили практически нормально [20]. Кроме того, семейство факторов роста и рецепторов EGF, амфирегулин и трансформирующий фактор роста- α [26] экспрессируются во время постнатального развития молочной железы.Амфирегулин, как упоминалось ранее, необходим для развития протоков и образования концевых зачатков [38]. Экспрессия трансформирующего фактора роста- α была обнаружена в пролиферирующей шапке клеток концевых зачатков (рис. 2) [56]. EGF необходим для пролиферации и дифференцировки клеток молочной железы (рис. 2) [56]. Многие рецепторы семейства EGF, рецептор EGF, erbB1, erbB2, erbB3 и erbB4, экспрессируются либо у девственных самок, либо во время беременности, либо во время лактации [26].

Другим важным сигналом в микроокружении молочной железы является производный от стромы фактор инсулиноподобного фактора роста (IGF). IGF является важным фактором роста молочной железы, регулирующим гормональный контроль роста протоков (рис. 2) [57]. Было обнаружено, что у мышей с нулевым IGF-1 снижен рост протоков и образование концевых зачатков, что свидетельствует о том, что IGF-1 необходим для ветвления протоков и продукции концевых зачатков в развивающихся молочных железах [58]. Кроме того, было обнаружено, что ИФР-1, а также ИФР-2 регулируют экспрессию эстрогена, прогестерона, пролактина и гормона роста в молочной железе (рис. 2) [57].IGF-1 и эстроген действуют как митогены в развитии нормальной молочной железы. Повышенная экспрессия IGF-1 и эстрогена приводит к увеличению пролиферации эпителиальных клеток молочной железы [59]. Кроме того, было обнаружено, что IGF-1 осуществляет контроль факторов роста как аутокринный, паракринный и эндокринный регуляторный сигнал [57]. И IGF-1, и IGF-2 экспрессируются в концевых зачатках и строме молочной железы. IGF-1 опосредует альвеолярное отпочкование и пролиферацию во время беременности [60]. Повышенные уровни циркулирующего ИФР-1 приводят к ускоренному росту молочных желез [57].Таким образом, ИФР-1 является необходимым фактором для развития молочной железы.

7.

Микроокружение молочной железы также может влиять на поведение эпителиальных клеток, изменяя состав внеклеточного матрикса. В частности, внеклеточный матрикс влияет на сигнальные пути интегринов, которые, как было показано, играют основную роль во время клеточного роста и дифференцировки.

Интегрины представляют собой тип рецептора, который обеспечивает взаимодействие с внеклеточным матриксом [61].Кроме того, интегрины участвуют в подвижности клеток и в определении клеточной формы. Интегрины представляют собой трансмембранные гетеродимеры, состоящие из двух нековалентно связанных субъединиц гликопротеина α и β . После связывания со своим лигандом интегрины активируют внутриклеточные сигнальные пути, такие как MAP-киназный путь [61]. В частности, гетеродимеры интегрина β 1 важны для различных клеточных функций, включая развитие кожи, волос, нервов и хондроцитов [62–64].Кроме того, интегрин β 1 участвует в пролиферации, выживании и дифференцировке эпителиальных клеток молочных желез [65, 66]. Недавние сообщения показали, что удаление гена интегрина β 1 приводит к замедлению роста молочной железы и изменению развития лобулоальвеол и паттерна ветвления протоков [67]. Более того, было обнаружено, что интегрин β 1 играет критическую роль в альвеолярном развитии железистого эпителия и необходим для дифференцировки эпителиальных клеток молочных желез [68].Таким образом, эти данные свидетельствуют о том, что интегрин β 1 является ключевым регулятором активности стволовых/прогениторных клеток молочных желез.

Для дальнейшего изучения того, требуется ли интегрин β 1 для поддержания стволовых клеток молочной железы, а также для развития альвеол, эпителиальные/прогениторные клетки молочной железы выделяли из мышей Itg β 1 ^fx/fx , CreER δ и обрабатывали 4-ОН-тамоксифеном (Bussard, неопубликованные данные). Добавление тамоксифена приведет к диссоциации CreER δ от Hsp90, что позволит CreER δ переместиться в ядро, а также разрезать и удалить ген интегрина β 1 floxed β 1 (рис. 3).Это событие происходит в эпителиальных/прогениторных клетках молочной железы, а также в любой клетке, содержащей комплекс CreER δ /Hsp90 в эпителии молочной железы, и позволяет определить важность гена в развитии молочной железы. В имплантатах первого поколения рост желез отсутствовал в 89% молочных желез, лишенных эпителия молочной железы, которые были имплантированы Itg β 1 ^fx/fx , эпителиальные клетки молочной железы CreER, обработанные 4-OH-тамоксифеном (таблица 1) (Бассард, неопубликованные данные).Эти результаты позволяют предположить, что интегрин β 1 необходим для поддержания стволовых клеток молочной железы и развития молочной железы. В имплантатах второго поколения железистый рост присутствовал в ~ 60% наростов (таблица 2) (Bussard, неопубликованные данные). Мышей, которым имплантировали клетки эпителия молочной железы Itg β 1 ^fx/fx , CreER, обработанные 4-OH-тамоксифеном, дополнительно скрещивали для изучения роли интегрина β 1 в развитии молочной железы во время беременности.Подобно имплантатам второго поколения, железистый рост присутствовал в ~ 60% наростов (таблица 2) (Bussard, неопубликованные данные). Эти данные в сочетании с аналогичными результатами, полученными для ранее описанных небеременных имплантатов второго поколения, позволяют предположить, что удаление интегрина β 1 в эпителии приводит к снижению эффективности роста. Необходима дополнительная работа, чтобы полностью выяснить роль интегрина β 1 в развитии молочной железы.

8.Контроль микросреды молочной железы клеток-предшественников

Какие факторы микроокружения молочной железы, в частности, влияют на судьбу клеток-предшественников/эпителиальных клеток? Скорее всего, существует комбинация межклеточных, клеточно-растворимых факторов и межклеточных взаимодействий с внеклеточным матриксом, которые имеют место как для поддержания, так и для дифференцировки клеток-предшественников [69, 70]. Чтобы решить этот технически сложный вопрос, Labarge et al. недавно разработали интересную технологию, использующую микрочипы белков микроокружения для идентификации комбинаций белков молочной железы и молекул из внеклеточного матрикса, которые влияли на судьбы клеток-предшественников молочной железы [71].Сообщалось, что jagged1 поддерживает пул клеток-предшественников [71]. Кроме того, было обнаружено, что laminin1 поддерживает клетки-предшественники молочной железы в состоянии покоя [71]. Для дифференцировки в миоэпителиальные клетки исследователи обнаружили, что экспрессия Р-кадгерина в микроокружении молочной железы ведет к дифференцировке клеток-предшественников в базальные клетки [71]. С другой стороны, было обнаружено, что межклеточный контакт, или экспрессия E-cadherin, способствует дифференцировке клеток-предшественников в эпителиальные клетки просвета [71].Т.о., эти результаты указывают на то, что экспрессия специфических белков в тканевом микроокружении может обеспечивать судьбу клеток-предшественников.

9. Notch, амфирегулин или сигнальные пути Hedgehog могут опосредовать клеточную судьбу стволовых клеток/клеток-предшественников

Недавние исследования показали, что такие факторы, как Notch, амфирегулин или сигнальные пути Hedgehog, ответственны за развитие желез разветвленное жировое тело молочной железы. Амфирегулин, как обсуждалось ранее, является членом семейства эпидермальных факторов роста и регулирует морфогенез молочной железы посредством паракринной активации рецептора эпидермального фактора роста [72].В экспериментах, проведенных Booth et al., экспрессия амфирегулина была подавлена ​​в линии бессмертных эпителиальных клеток молочной железы с характеристиками стволовых клеток с помощью siRNAs [72]. Данные показали, что амфирегулин не только контролирует удлинение протоков, но также опосредует самообновление клеток-предшественников [72]. Сообщалось, что в дополнение к амфирегулину Notch регулирует судьбу стволовых/прогениторных клеток молочных желез. При исследовании в культуре маммосфер было обнаружено, что синтетический пептид, полученный из домена Delta-Serrate-LAG 2 (DSL), который консервативен во всех лигандах Notch, способствует самообновлению стволовых клеток, а также регулируемой асимметричной клетке-предшественнику. подразделение [73].Было обнаружено, что на более поздних стадиях развития молочной железы тот же пептид DSL способствует развитию миоэпителиальных клеток [73]. Пептид DSL не влияет на полностью дифференцированные эпителиальные клетки молочных желез, что указывает на то, что эффекты пептида, полученного из Notch, ограничены ранними клетками-предшественниками молочных желез [73].

Наконец, в дополнение к амфирегулину и Notch было обнаружено, что члены сигнального пути Hedgehog и Bmi-1 регулируют самообновление стволовых клеток молочной железы.Было обнаружено, что передача сигналов Hedgehog, которая включает гены PTCh2, Gli1 , Gli2 и Bmi-1, , увеличивает количество инициирующих маммосферу клеток, а также увеличивает размер маммосферы [74]. При дальнейшем исследовании было обнаружено, что более высокие концентрации этих генов были экспрессированы в клетках-предшественниках молочных желез, тогда как их концентрации были снижены в более дифференцированных клетках [74]. Более того, было обнаружено, что белки Sonic Hedgehog и Indian Hedgehog экспрессируются в более дифференцированном эпителии молочной железы [75, 76], тогда как экспрессия Desert Hedgehog выше в концевых зачатках по сравнению со стромой молочной железы [77].Кроме того, было обнаружено, что белок Gli2 экспрессируется в строме, окружающей протоки молочной железы, а также в концевых зачатках [78]. Gli3, с другой стороны, расположен в более дифференцированном эпителии и строме молочной железы [79]. Белки семейства Hedgehog регулируют несколько фаз развития молочной железы, включая развитие протоков и лактацию [80]. Эти результаты указывают на то, что в дополнение к амфирегулину и Notch члены сигнального пути Hedgehog играют роль в регуляции и самообновлении клеток-предшественников молочных желез.

В качестве прямого примера микроокружения, контролирующего клетки-предшественники, наша лаборатория недавно продемонстрировала, что микроокружение молочной железы мыши может перенаправлять клетки взрослых мышей немаммарного происхождения на расширение и дифференцировку в эпителиальные клетки молочной железы во время регенерации желез in vivo [81 , 82]. Было обнаружено, что как взрослые тестикулярные клетки, так и добросовестные нейральные стволовые клетки могут быть перепрограммированы молочной железой мыши, чтобы они вели себя как эпителиальные клетки молочной железы [81, 82].Для взрослых клеток яичка смесь 10% сперматогоний типов A и B, 28% клеток Сертоли и 62% дифференцирующихся сперматоцитов, выделенных из семенных канатиков взрослых самцов мышей WAP-Cre/Rosa26R, имплантировали с эпителиальными клетками самок молочной железы в свободная от эпителия жировая подушка трехнедельных самок бестимусных голых мышей. Шесть-восемь недель спустя мышей спаривали, доводили до полного срока беременности и впоследствии подвергали эвтаназии. Собирали железы и исследовали на наличие маркеров клеток молочной железы казеина (молоко) и кератина 5 (маркер миоэпителиальных клеток), которые были обнаружены среди потомства инокулированных мужских клеток [81].Кроме того, флуоресцентная гибридизация in situ показала, что как мужские (сперматогенные, Y-хромосома), так и женские (молочные железы, двойная X-хромосома) клетки соседствуют друг с другом и присутствуют в одном и том же ацинусе [81]. Эти результаты наблюдались как в первом, так и во втором поколении трансплантатов, и показали, что мужские клетки-предшественники способствовали формированию функциональной женской молочной железы. Аналогичный подход был применен для изучения того, может ли микроокружение молочной железы перепрограммировать эмбриональные и взрослые нейральные стволовые клетки, выделенные и размноженные в селективной среде для нейральных стволовых клеток, в качестве добросовестных нейральных стволовых клеток.По сравнению с клетками яичка, было замечено, что нейральные стволовые клетки WAP-Cre/Rosa26 R также могут быть перенаправлены на экспрессию маркера эпителиальных клеток молочной железы казеина (молоко) [82]. Эти результаты, в дополнение к результатам, обсуждаемым Bussard et al. [83], демонстрируют, что поведение стволовых клеток/клеток-предшественников зависит от микроокружения, в котором они находятся, указывая на доминирование тканеспецифичной ниши над судьбой клеток-предшественников.

10. Микроокружение и рак

Появляется все больше данных, свидетельствующих о том, что тканевое микроокружение также может регулировать злокачественный фенотип опухолей.Начиная с 1975 г. Mintz и Illmensee вводили клетки эмбриональной карциномы либо подкожно мышам, либо в бластоцисты, которые впоследствии имплантировали псевдобеременным хозяевам [84]. Тератокарциномы образуются у мышей, которым непосредственно инокулировали клетки эмбриональной карциномы. Однако, когда клетки эмбриональной карциномы инокулировали в бластоцисты и имплантировали беременным хозяевам, были получены «нормальные» химерные мыши без развития опухоли [84]. Кроме того, онкогенный вирус, вирус саркомы Рауса, вызывает агрессивные опухоли при введении непосредственно в крылья цыплят [85].Однако, когда куриные эмбрионы были инфицированы in ovo меченым pp ^60src (нерецепторная протеинтирозинкиназа, которая опосредует активность вируса саркомы Рауса), опухоли не образовывались, хотя вирус экспрессировался в большинстве клеток инфицированных эмбрионов. [86]. При выращивании в культуре клетки этих эмбрионов образовывали опухоли [86]. Эти исследования показывают, что «нормальное» тканевое микроокружение доминирует над опухолевым образованием. Совсем недавно Фельшер продемонстрировал, что добросовестные онкогены являются туморогенными только в определенных клеточных линиях [87].Фельшер обнаружил, что для того, чтобы стать туморогенным, онкоген должен находиться в среде, благоприятной для развития опухоли [87]. Таким образом, если бы условия не благоприятствовали онкогенезу, опухоль не росла бы. В другом исследовании Hochedlinger et al. использовали ядерную трансплантацию для введения ядер злокачественных раковых клеток в энуклеированные ооциты, которые впоследствии использовали для получения химерных мышей [88]. Несмотря на то, что мыши имели предрасположенность к онкогенному фенотипу, большинство их тканей были нормальными; регулируется «нормальным», неопухолевым микроокружением энуклеированного ооцита [88].

Дополнительно установлено, что тканевая микросреда играет ключевую роль в развитии рака и метастазировании. При исследовании экспрессии генов во время опухолевой прогрессии в молочной железе было обнаружено, что обширные изменения экспрессии генов происходят в опухолеассоциированной строме, включая повышение экспрессии MMP2, MMP11 и MMP14 при переходе от преинвазивного к инвазивному фенотипу [89]. ]. Кроме того, клетки рака молочной железы с метастазами в кости используют нативные костные клетки, такие как остеобласты, для увеличения выработки ими воспалительных цитокинов IL-6, MCP-1, VEGF, MIP-2 (человеческий IL-8) и KC (человеческий GRO-). α ) [90].Эти результаты предполагают, что (1) микроокружение опухоли играет роль в онкогенезе до инвазии опухолевых клеток в строму и что (2) раковые клетки кооптируют нормальные клетки микроокружения, чтобы облегчить колонизацию раковых клеток. Таким образом, клеточное микроокружение больше не может рассматриваться как невинный наблюдатель прогрессии опухоли.

Несколько недавних исследований, в частности, непосредственно изучали взаимодействие раковых клеток с микроокружением. В одном эксперименте Booth et al.исследовали, могут ли клетки, трансформированные канцерогенным вирусом опухоли молочной железы мыши (MMTV-) neu, направляться микроокружением нормальной молочной железы мыши для участия в развитии функциональной молочной железы [91]. Чтобы изучить этот вопрос, клетки MMTV-neu были собраны из опухолей WAP-Cre/Rosa26R/MMTV-neu, смешаны с первичными эпителиальными клетками молочной железы дикого типа и впоследствии инокулированы в лишенные эпителия жировые подушечки самок бестимусных голых мышей. [91]. Было обнаружено, что при смешивании с эпителиальными клетками молочной железы дикого типа из первичных культур эпителиальных клеток молочной железы эпителиальное потомство, полученное от MMTV-neu-трансформированных клеток, участвует в нормальном развитии молочной железы [91].В другом эксперименте Bussard et al. показали, что клетки эмбриональной карциномы человека могут быть перенаправлены от их туморогенного фенотипа к дифференцировке в функциональных добросовестных человеческих эпителиальных клеток молочной железы посредством взаимодействия с микроокружением молочной железы мыши in vivo [83]. Когда клетки эмбриональной карциномы человека инокулировали с эпителиальными клетками молочной железы мыши в лишенный эпителия жировой слой самок бестимусных голых мышей, перенаправленные клетки эмбриональной карциномы человека способствовали формированию нормальной молочной железы, экспрессировали специфичные для человека кератины, а также секретировали специфические для человека молочные белки у кормящих хозяев [83].Когда клетки эмбриональной карциномы человека были инокулированы отдельно (без эпителиальных клеток молочной железы) в лишенный эпителия жировой слой самок бестимусных голых мышей, опухоли образовывались как в отростках первого, так и во втором поколении [83]. Совсем недавно было продемонстрировано, что при смешивании с нормальными эпителиальными клетками молочной железы мыши клетки рака молочной железы с метастазами, неметастатическими и подавленными метастазами в кости человека экспрессировали маркеры нормальных эпителиальных клеток молочной железы человека в первом и втором поколениях трансплантата (Bussard, неопубликовано). .Таким образом, эти результаты в целом не только свидетельствуют о том, что раковые клетки могут реагировать на «нормальные» сигналы развития, но также в определенных ситуациях доказывают доминирование «нормального» микроокружения над развитием опухоли.

11. Выводы и соображения на будущее

Данные показали, что сигналы от тканевого микроокружения влияют на судьбу клеток-предшественников. Для изучения сигналов тканевого микроокружения на клетках-предшественниках молочная железа служила надежной модельной системой.Было обнаружено, что ниша молочной железы (микроокружение) играет ключевую роль в развитии желез и направлении судьбы эпителиальных клеток. Кроме того, недавно было показано, что микроокружение молочной железы также может перенаправлять соматические клетки из других тканей (взрослые яички, добросовестные нейральные стволовые клетки и клетки эмбриональной карциномы человека), чтобы они вели себя и функционировали как эпителиальные клетки молочной железы. Эти результаты показывают, что ненативные соматические клетки взаимодействуют с сигналами от молочной железы мыши и реагируют на них и способны быть направленными на дифференцировку в клетки, которые проявляют различные фенотипы эпителиальных клеток молочной железы.Эти наблюдения демонстрируют доминирование тканевой ниши над судьбой клетки-предшественника/рака. Хотя конкретные молекулярные механизмы этих явлений еще предстоит определить, эти данные добавляют провокационную информацию к пониманию клеточной пластичности. Понимание механизмов, связанных с клеточным перепрограммированием, создаст новые терапевтические возможности для лечения заболеваний, а также продлит время выживания и улучшит качество жизни пациентов с изнурительными заболеваниями.

Однако остается много вопросов.Почему это событие интеграции происходит только тогда, когда количество нормальных, нативных эпителиальных клеток превышает количество ненативных клеток? Каковы механизмы, по которым происходят эти события? Может ли перепрограммирование клеток-предшественников происходить в органах помимо молочной железы? Существуют ли ограничения на тип/количество клеток, которые можно перепрограммировать? Ответы на эти и другие вопросы помогут в расшифровке сложной передачи сигналов, происходящей между тканевым микроокружением и клетками-предшественниками.Выявление специфических комбинаций межклеточных взаимодействий и межклеточных взаимодействий с внеклеточным матриксом, таких как продемонстрированные LaBarge et al. кажутся хорошим началом и дают представление о механизмах, с помощью которых происходит клеточное перепрограммирование нишей [71]. Вполне вероятно, что множество взаимодействующих факторов и путей необходимо для перенаправления клеточной судьбы in vivo . Тем не менее, понимание сложности этих взаимодействий не только поможет расшифровать молекулярные тонкости молочной железы, но также поможет понять биологию стволовых клеток и неопластическую трансформацию в целом.

XBP1 регулирует биосинтетическую способность молочной железы во время лактации, контролируя расширение эпителия и формирование эндоплазматического ретикулума | Эндокринология

Аннотация

Клетки, составляющие секреторный компартмент молочной железы, развили высокую способность секретировать не только белки, но также триглицериды и углеводы. Эту особенность иллюстрирует мышь, которая может секретировать молочные белки, триглицериды и лактозу почти в два раза больше собственного веса за короткую 20-дневную лактацию.Координация синтеза и экспорта продуктов в др. секреторных клетках частично регулируется транскрипционным фактором X-box связывающим белком 1 (XBP1). Чтобы оценить роль XBP1 в эпителиальных клетках молочной железы (MEC), мы исследовали самок мышей Flox XBP1, лишенных (дикий тип; WT) или экспрессирующих рекомбиназу Cre под контролем промотора β-лактоглобулина овцы (ΔXBP1 ^MEC ). Беременные самки ΔXBP1 ^MEC имели морфологически нормальное развитие молочных желез и рождали такое же количество детенышей, как и мыши WT.Однако к 3-му дню лактации (L3)3 их пометы страдали дефицитом прибавки в весе, который возрастал до 80% к L14. У самок ΔXBP1 ^MEC были лишь незначительные изменения в составе молока (-21% белка, +24% триглицеридов) и в экспрессии ассоциированных генов в изолированных MEC. К L5 железы WT были полностью заняты расширенными альвеолами, тогда как железы ΔXBP1 ^MEC содержали меньшее количество, в основном незаполненных альвеол и сохраняли заметную популяцию адипоцитов. Меньший размер эпителиального компартмента в железах ΔXBP1 ^MEC объясняется меньшей пролиферацией MEC и повышенным апоптозом.Наконец, ленты эндоплазматического ретикулума были менее многочисленны у ΔXBP1 ^MEC на 18-й день беременности и не увеличивались в количестве к L5. В совокупности эти результаты показывают, что XBP1 необходим для расширения популяции MEC во время лактации и его способности развивать сложный компартмент эндоплазматического ретикулума.

Лактация представляет собой одну из наиболее метаболически сложных фаз жизни для многих видов млекопитающих. В течение 20 дней молочная железа мыши может синтезировать и секретировать более 30 г триглицеридов, 12 г белков и 5 г лактозы (1, 2).Синтез молока происходит в альвеолярных структурах, состоящих из одного слоя эпителиальных клеток молочной железы (MEC), окружающих полость, где секретируется молоко (1, 3). Чтобы стать полностью функциональными, МЭК приобретают ряд клеточных характеристик на поздних сроках беременности. Эта дифференциация управляется пролактином и другими лактогенными гормонами и включает развитие сложной системы эндоплазматического ретикулума (ЭР) (1, 3, 4). ER необходим не только для синтеза секретируемых белков, но также является местом сборки жирных кислот в триглицериды и фосфолипиды (5, 6).

Факторы, регулирующие развитие и функцию ER в секреторном эпителии молочной железы, остаются в значительной степени неизвестными. Три линии доказательств предполагают, что фактор транскрипции X-box-связывающий белок 1 (XBP1) может быть важен. Во-первых, XBP1 способствует биогенезу ER, о чем свидетельствует увеличение размера компартмента ER после принудительной сверхэкспрессии XBP1 в фибробластах (7, 8). Более того, удаление XBP1 в др. секреторных клетках уменьшало как численность ER, так и секрецию белка (9, 10).Во-вторых, XBP1 является компонентом высококонсервативного сигнального каскада, ответственного за восстановление гомеостаза, когда ER сталкивается с различными стрессами, включая повышенный синтез и секрецию белка (11, 12). В частности, нарушение гомеостаза ER приводит к активации трансмембранного сенсора стресса ER, требующего инозитола, фермента 1α (13, 14). Активированный IRE1α специфически отщепляет внутренний сегмент из 26 пар оснований от транскриптов XBP1 с последующим сдвигом рамки считывания, приводящим к продукции транскрипционно активной изоформы XBP1.Наконец, передача сигналов XBP1 также считается положительным регулятором как липогенеза, так и секреции ЛПОНП в гепатоцитах (15, 16). Эти наблюдения могут относиться к молочной железе, поскольку она является преобладающей липогенной тканью во время лактации (2, 17).

Соответственно, нашей целью было оценить роль XBP1 в поддержании биосинтетической активности молочной железы во время лактации. Для этого мы изучили последствия MEC-специфичной делеции гена XBP1 у самок мышей Floxed XBP1, несущих ген рекомбиназы Cre под контролем промотора β-лактоглобулина овцы.Удаление XBP1 не влияло на развитие молочной железы во время беременности, но серьезно нарушало последующую лактацию. Этот дефект объясняется неспособностью популяции MEC расширяться и развивать соответствующий компартмент ER во время лактации.

Материалы и методы

Животные

Все эксперименты на животных проводились в соответствии с принятыми стандартами гуманного ухода за животными, изложенными в Этических рекомендациях.Процедуры были одобрены Корнеллским комитетом по уходу и использованию животных. Мыши C57BL/6 с сайтами loxP по обе стороны от экзона 2 в гене XBP1 (XBP1 ^f/f ) были получены от Dr Laurie Glimcher (15). Мыши смешанного происхождения, экспрессирующие копию рекомбиназы Cre под контролем промотора β-лактоглобулина овцы (BLG-Cre), были получены от Dr Robert Weiss (18–20). Экспериментальные животные были получены путем скрещивания самок XBP1 ^f/f с самцами XBP1 ^f/f , несущими 1 копию трансгена BLG-Cre.Однопометники, оставленные для исследований, были либо XBP1 ^f/f (обозначены как дикий тип; WT), либо XBP1 ^f/f , несущими трансген BLG-Cre (обозначен ΔXBP1 ^MEC ). Пометы были отняты от груди и генотипированы в возрасте 3 недель.

Все животные содержались в среде с постоянной температурой окружающей среды (22°C) и световым периодом (включение света с 6 до 18 часов). На протяжении всего эксперимента мышей кормили ab libitum стандартным кормом для грызунов, содержащим 5% жира и 19% белка (Harlan Tekland 7912).Все терминальные процедуры включали эвтаназию путем удушения CO ₂ .

Измерение роста щенков и анализ компонентов молока

реципрокных скрещивания (самки WT × самцы ΔXBP1 ^MEC ; самки ΔXBP1 ^MEC × самцы WT) были проведены в возрасте 10 недель (n = 6–11 самок на генотип). Роды считались 0-м днем ​​лактации (L0), а размеры помета были стандартизированы до 9 детенышей на L1. Стандартизация помета не включала умерщвление каких-либо детенышей из исследуемых пометов, и любые добавленные щенки происходили из пометов, рожденных в один и тот же день, но не использованных в этом исследовании.Каждый помет ежедневно взвешивали от L1 до L14. Самок доили на L14 после внутрибрюшинной инъекции окситоцина (21, 22). Молоко разбавляли 1:1 PBS, обрабатывали ультразвуком и замораживали до анализа. Молочную лактозу определяли с помощью набора для колориметрического анализа галактозы и лактозы (Sigma-Aldrich). Содержание белка в молоке измеряли с помощью анализа Бредфорда с использованием восстановленного сухого молока в качестве стандарта. Отдельные молочные белки визуализировали путем разделения фиксированного объема разбавленного молока (10 мкл) на восстанавливающем 13% SDS-полиакриламидном геле с последующим окрашиванием кумасси синим (23).Определение содержания жира в молоке и профиля жирных кислот включало экстракцию гексаном: изопропанолом, метилирование жирных кислот в метанольном серном растворе, кислоту с последующим трансметилированием в гидроксиде натрия и газовую хроматографию, как недавно описано (22). Энергетическая ценность молока оценивалась с использованием значений теплоты сгорания 9,25, 3,95 и 5,65 ккал/г для жира, лактозы и белка (24).

Изоляция МЭК

WT и ΔXBP1 ^MEC спаривали и ежедневно оценивали на наличие копулятивной пробки (день беременности обозначен как 0 [P0]).Подгруппы самок были подвергнуты эвтаназии на P14, P18, L0 и L5 (n = 5–8 самок для каждого генотипа и стадии молочной железы). МЭК выделяли, как недавно описано (25, 26). Вкратце, обе четвертые молочные железы очищали от лимфатических узлов, измельчали ​​и переваривали в 5 мл буфера для переваривания (DMEM, содержащего 1 мг/мл трипсина, 2 мг/мл коллагеназы А, 50 мМ фторида натрия и 1 мМ ортованадата натрия). ) на водяной бане со встряхиванием (37°С, 200 об/мин). Через 30 минут реакцию переваривания гасили 1 мл эмбриональной бычьей сыворотки и доводили до конечного объема 15 мл с помощью PBS.МЭК осаждали центрифугированием (9300 g в течение 10 мин при 4°С) и еще 2 раза промывали в PBS перед замораживанием при -80°С.

Анализ развития молочной железы

WT и ΔXBP1 ^MEC подвергали эвтаназии на P14, P18, L1, L5 и L14 (n = 2–3 самки для каждого генотипа и стадии развития). Правую четвертую молочную железу распределяли на предметное стекло для анализа всего препарата (27). Вкратце, расширенные железы фиксировали в течение ночи в растворе Карнуа (60% этанол, 30% хлороформ, 10% уксусная кислота), постфиксировали в 70% этаноле, регидратировали в этаноле с уменьшающейся концентрацией и окрашивали карминовыми квасцами.После окрашивания железы обезвоживали при возрастающей концентрации этанола, очищали в ксилоле в течение ночи и закрепляли Permount. Смонтированные железы фотографировали с помощью камеры AxioCam (Carl Zeiss, Inc), прикрепленной к препаровальному микроскопу. Для гистологического анализа правую третью молочную железу фиксировали в течение ночи в 10% забуференном формалине и постфиксировали в 70% этаноле. Железы заливали в парафин и окрашивали гематоксилином и эозином (H&E). Изображения гистологических срезов были получены с использованием микроскопии яркого света при увеличении ×10 и ×40 с использованием микроскопа Axiovert 40, оснащенного камерой AxioCam (Carl Zeiss, Inc), как описано ранее (27).

Выделение тотальной РНК и анализ экспрессии генов

MEC и ткани лизировали Qiazol (QIAGEN) с последующей очисткой тотальной РНК с использованием колонок RNeasy Mini и обработкой на колонке дезоксирибонуклеазой без рибонуклеазы (QIAGEN). Количество и целостность тотальной РНК определяли с использованием набора RNA Nano Lab Chip и биоанализатора (Agilent). Реакции обратной транскрипции проводили с 1 мкг РНК в общем объеме 10 мкл с помощью набора для обратной транскрипции кДНК большой емкости и ингибитора РНКазы (Applied Biosystems).Экспрессию генов анализировали с помощью количественного ПЦР в реальном времени с использованием Power SYBR Green Mix (Applied Biosystems). ПЦР в реальном времени выполняли в двух экземплярах с общим реакционным объемом 25 мкл, содержащим 500 нМ концентрации каждого праймера и обратно транскрибированной РНК (25 нг, за исключением 2,5 нг для внутреннего стандарта гена β-2 микроглобулина [ B2m ]). Последовательности всех используемых праймеров приведены в дополнительной таблице 1. Данные мРНК анализировали с использованием относительной стандартной кривой, основанной на серийных разведениях объединенной кДНК либо из MEC, либо из интересующей ткани, как указано в подписях к рисункам.Уровни экспрессии неизвестного образца рассчитывали по стандартной кривой и корректировали по экспрессии инвариантного гена B2m .

Иммуногистохимия Ki67 и анализ TUNEL

срезов молочной железы были приготовлены из правой третьей молочной железы, собранной на P18 и L5 (n = 5 для каждого генотипа и стадии развития). Срезы иммуноокрашивали кроличьим моноклональным анти-Ki67 (1:50; Abcam) и контрастно окрашивали 4′,6-диамидино-2-фенилиндола дигидрохлоридом (DAPI) (Vector Laboratories).Анализ TdT-опосредованного мечения dUTP Nick-End (TUNEL) проводили с использованием системы DeadEnd Colorimetric TUNEL (Promega), а срезы контрастно окрашивали DAPI (Vector Laboratories). Для обоих анализов срезы фотографировали с использованием микроскопа Axiovert 40 (Carl Zeiss, Inc), оснащенного камерой AxioCam. Для каждого животного случайным образом брали 8 микрофотографий одинакового размера из несмежных областей, и соответствующий иммунореактивный сигнал оценивали на 400–1000 окрашенных DAPI МЭК.Количество Ki67-позитивных или TUNEL-позитивных клеток делили на количество ядер, окрашенных DAPI, для получения процента пролиферирующих или апоптотических клеток.

Просвечивающая электронная микроскопия (ЭМ)

Правую третью молочную железу вырезали у подмножеств мышей WT и ΔXBP1 ^MEC на P18 и L5 (n = 2–3 для каждого генотипа и стадии развития). Кубики тканей (1 мм ³ ) погружали в фиксатор Карновского (16% параформальдегид, 50% глутаральдегид и 0.2М фосфатно-натриевый буфер [рН 7,2]; наук об электронной микроскопии). Фиксацию проводили в течение 1 часа на льду, а затем в течение ночи при 4°С. Затем образцы промывали 0,1 М фосфатно-натриевым буфером 3 раза в течение десяти минут. Образцы были помещены в EMbed 812 (Electron Microscopy Sciences), а затем обработаны в 65-нм срезы с помощью системы ультрамикротома Leica Ultracut. Изображения были получены с использованием JEM-1400 TEM. Встраивание, обработка и визуализация выполнялись на платной основе Центром электронной микроскопии и гистологии Медицинского колледжа Вейла Корнелла.

Вестерн-блоттинг

Ткань молочной железы была получена от мышей WT и ΔXBP1 ^MEC на L5 и гомогенизирована в буфере для радиоиммунопреципитации (RIPA) (10 мМ трис-HCl [pH 7,4], 150 мМ хлорида натрия, 1% Nonidet P-40, 1 мМ фенилметилсульфонил фторид, 1 мМ ЭДТА, 1 мМ фторид натрия, 0,25% дезоксихолат натрия и 10% глицерин), дополненный ингибиторами протеазы и фосфатазы (смесь ингибиторов фосфатазы Halt без ЭДТА; Thermo Scientific).Концентрации белка определяли с использованием анализа белка BCA (Thermo Scientific). Белки разделяли на 7–10% гелях SDS-PAGE в восстанавливающих условиях и переносили на нитроцеллюлозные мембраны (Protran, Schleicher & Schuell Bioscience). Мембраны блокировали в течение 1 часа при комнатной температуре в трис-буферном солевом растворе с добавлением 0,1% Tween 20 и 5% вес./об. обезжиренного сухого молока. Мембраны инкубировали в течение ночи при 4°C в блокирующем растворе, содержащем разведение 1:1000 первичного антитела (IRE1α [Cell Signaling], преобразователь сигнала и активатор транскрипции 3 (STAT3) [Santa Cruz Biotechnology, Inc], pY ⁷⁰⁵ STAT3 [Передача клеточных сигналов] и β-актин [Передача клеточных сигналов]).Сигналы проявляли с помощью вторичного антикроличьего антитела IRDye 800 в разведении 1:20 000 (LI-COR Biotechnology) и визуализировали с помощью системы инфракрасной визуализации LI-COR Odyssey (таблица 1).

Статистический анализ

Анализы были выполнены с использованием процедуры подбора модели JMP Pro 11.0 статистическое программное обеспечение (Институт SAS). Данные о росте детенышей анализировали с помощью процедуры подгонки модели, включая фиксированное влияние генотипа матери, дня лактации и их взаимодействие. Все другие переменные были проанализированы на стадиях развития (P14, P18 или L5) с помощью модели, учитывающей материнский генотип (WT или ΔXBP1 ^MEC ). Статистическая значимость и тенденция были установлены на уровне P < 0,05 и P < 0,10 соответственно.

Результаты

Экспрессия XBP1 необходима для нормальной лактации

Мы создали экспериментальных самок мышей, несущих аллели floxed XBP1 в отсутствие или в присутствии 1 копии трансгена BLG-Cre (обозначаемых в последующем тексте соответственно как WT и ΔXBP1 ^MEC ).Чтобы оценить рекомбинацию именно в эпителиальном компартменте, мы выделили MEC на P14, P18, L0 и L5. Эта изоляция была необходима, чтобы избежать разбавляющего влияния адипоцитов молочной железы, количество которых варьирует не только во время беременности и лактации (1, 28), но также между WT и ΔXBP1 ^MEC (описано ниже). Выделение прошло успешно, о чем свидетельствует более чем 20-кратное снижение экспрессии специфического для адипоцитов белка перилипина в МЭК по сравнению с интактной тканью молочной железы на всех стадиях беременности и лактации, независимо от генотипа (рис. 1А.Опосредованную BLG-Cre рекомбинацию XBP1 затем измеряли в изолированных MEC с помощью количественного анализа ПЦР в реальном времени с обратным праймером, расположенным в экзоне 2, экзоне, предназначенном для вырезания (15). В МЭК, собранных у мышей ΔXBP1 ^MEC , экзон 2, содержащий транскрипты XBP1, был снижен до 7%, 4% и 16% от содержания, обнаруженного в МЭК WT на P14, P18 и L5, соответственно ( P < 0,001). ) (Рисунок 1B. Напротив, количество транскриптов, содержащих экзон 2, не различалось на уровне L5 между генотипами в печени и скелетных мышцах (рисунок 1C.Эти результаты показывают, что Cre-опосредованная рекомбинация XBP1 происходит в MEC уже на P14 и не происходит в печени и скелетных мышцах.

Рисунок 1

Влияние рекомбинации, опосредованной BLG-Cre, на количество транскриптов XBP1. Мышей, несущих аллели floxed XBP1 в отсутствие (WT) или в присутствии трансгена β-лактоглобулина (ΔXBP1 ^MEC ), исследовали либо на P14, P18, либо на L5. A, Обе четвертые молочные железы вырезали у мышей WT и ΔXBP1 ^MEC на P14, P18 и L5.Часть желез сразу же замораживали (железы интактны), а оставшуюся часть использовали для выделения МЭК. Тотальную РНК выделяли из замороженных интактных желез и МЭК и анализировали с помощью количественной ПЦР в реальном времени на содержание мРНК перилипина. Для каждого генотипа и стадии развития содержание мРНК перилипина соотносится с уровнем интактной железы, при этом каждая полоса представляет собой среднее значение ± стандартная ошибка для 5–11 мышей. ***, P < 0,001. B, MEC были выделены из молочной железы мышей WT и ΔXBP1 ^MEC на P14, P18 и L5.Обилие мРНК XBP1, содержащей экзон 2, измеряли с помощью количественной ПЦР в реальном времени в изолированных MEC. На каждой стадии развития содержание мРНК XBP1, содержащей экзон 2 (обозначаемое как мРНК XBP1 экзона 2), соотносится с уровнем WT, где каждая полоса представляет среднее ± SE для 5–11 мышей. ***, P < 0,001. C, мРНК XBP1, содержащую экзон 2, измеряли с помощью количественной ПЦР в реальном времени в печени и мышцах, собранных у мышей WT и ΔXBP1 ^MEC на L5. Для каждой ткани изобилие мРНК XBP1, содержащей экзон 2 (обозначаемое как мРНК XBP1 экзона 2), относится к уровню WT, где каждая полоса представляет среднее значение ± стандартная ошибка для 5 мышей.

Рисунок 1

Влияние рекомбинации, опосредованной BLG-Cre, на количество транскриптов XBP1. Мышей, несущих аллели floxed XBP1 в отсутствие (WT) или в присутствии трансгена β-лактоглобулина (ΔXBP1 ^MEC ), исследовали либо на P14, P18, либо на L5. A, Обе четвертые молочные железы вырезали у мышей WT и ΔXBP1 ^MEC на P14, P18 и L5. Часть желез сразу же замораживали (железы интактны), а оставшуюся часть использовали для выделения МЭК. Тотальную РНК выделяли из замороженных интактных желез и МЭК и анализировали с помощью количественной ПЦР в реальном времени на содержание мРНК перилипина.Для каждого генотипа и стадии развития содержание мРНК перилипина соотносится с уровнем интактной железы, при этом каждая полоса представляет собой среднее значение ± стандартная ошибка для 5–11 мышей. ***, P < 0,001. B, MEC были выделены из молочной железы мышей WT и ΔXBP1 ^MEC на P14, P18 и L5. Обилие мРНК XBP1, содержащей экзон 2, измеряли с помощью количественной ПЦР в реальном времени в изолированных MEC. На каждой стадии развития содержание мРНК XBP1, содержащей экзон 2 (обозначаемое как мРНК XBP1 экзона 2), соотносится с уровнем WT, где каждая полоса представляет среднее ± SE для 5–11 мышей.***, P < 0,001. C, мРНК XBP1, содержащую экзон 2, измеряли с помощью количественной ПЦР в реальном времени в печени и мышцах, собранных у мышей WT и ΔXBP1 ^MEC на L5. Для каждой ткани изобилие мРНК XBP1, содержащей экзон 2 (обозначаемое как мРНК XBP1 экзона 2), относится к уровню WT, где каждая полоса представляет среднее значение ± стандартная ошибка для 5 мышей.

Затем мы оценили влияние удаления XBP1 в MEC на лактацию путем измерения роста щенков. В этом исследовании любое влияние генотипа детенышей было устранено путем реципрокного спаривания (т. е. самка WT × самец с флоксами, несущий BLG-Cre; мать ΔXBP1 ^MEC × самец WT).Количество родившихся детенышей не различалось между генотипами (7,8 ± 0,5 против 8,4 ± 0,5 у самок WT и ΔXBP1 ^MEC ). Размер помета был нормализован до 9 детенышей на самку на L1, чтобы обеспечить одинаковую потребность в лактации у всех самок. Вес щенков был идентичен в L1, но дефицит роста стал очевидным к L3 для детенышей, выкормленных самками ΔXBP1 ^MEC (рис. 2). Между 1-м и 14-м днем ​​лактации детеныши, выкормленные самками WT, набрали в среднем 4,8 г, тогда как детеныши, выкормленные самками ΔXBP1 ^MEC , набрали только 1.2 г (генотип × день, P < 0,0001). К 14 дню лактации вес отдельного детеныша в среднем составлял 6,4 г для пометов WT, но только 2,6 г для пометов ΔXBP1 ^MEC (генотип, P < 0,0001). Эти результаты показывают, что удаление XBP1 в эпителиальном компартменте молочной железы ухудшает лактацию.

Рисунок 2

Влияние удаления XBP1, специфичного для молочной железы, на рост детенышей. Самок, несущих XBP1 дикого типа (WT) или нулевой XBP1 в MEC (ΔXBP1 ^MEC ), исследовали в период с 1 по 14 день лактации (n = 6–11 самок для каждого генотипа).Пометы были стандартизированы до 9 детенышей и взвешивались каждый день. Каждая кривая представляет собой средний вес отдельных детенышей, выкормленных либо от самок WT, либо от самок ΔXBP1 ^MEC . Сообщается о значительных эффектах взаимодействия генотип, день и генотип × день.

Рисунок 2

Влияние удаления XBP1, специфичного для молочной железы, на рост щенков. Самок, несущих XBP1 дикого типа (WT) или нулевой XBP1 в MEC (ΔXBP1 ^MEC ), исследовали в период с 1 по 14 день лактации (n = 6–11 самок для каждого генотипа).Пометы были стандартизированы до 9 детенышей и взвешивались каждый день. Каждая кривая представляет собой средний вес отдельных детенышей, выкормленных либо от самок WT, либо от самок ΔXBP1 ^MEC . Сообщается о значительных эффектах взаимодействия генотип, день и генотип × день.

Чтобы определить, влияет ли отсутствие XBP1 на состав молока, молоко было собрано у самок обоих генотипов в L14 и проанализировано на основные органические компоненты. Концентрация лактозы и белка в молоке была соответственно на 37% и 21% ниже у ΔXBP1 ^MEC , чем у самок WT ( P < .001 и P < 0,01 соответственно) (рис. 3А. Анализ молока с помощью SDS-PAGE показал, что более низкое содержание белка объясняется снижением основных специфических белков молока, включая казеины и сывороточный кислый белок (рис. 3В). , Напротив, общее содержание жира в молоке было увеличено на 24% в молоке ΔXBP1 ^MEC ( P < 0,01) (рис. 3A. Жирные кислоты с 14 атомами углерода или менее синтезируются исключительно в MEC, и их общее содержание может быть используется в качестве показателя липогенеза (17, 22).Газохроматографический анализ молочного жира показал, что содержание жирных кислот с 14 или менее атомами углерода в ΔXBP1 ^MEC , как правило, ниже, чем в молочном жире WT ( P <0,07) (рис. 3C; см. также дополнительную таблицу 2). Этот дефицит молочного жира ΔXBP1 ^MEC компенсировался повышенной долей предварительно образованных жирных кислот ( P < 0,07), которые поступают из рациона и запасов жировой ткани. Доля жирных кислот с 16 атомами углерода, которые в равной степени получены из липогенеза МЭК и преформированных источников, не зависела от материнского генотипа.Эти изменения состава молока ΔXBP1 ^MEC привели к увеличению его калорийности (2,2 ± 0,1 против 2,6 ± 0,1 ккал/г для WT и ΔXBP1 ^MEC , P < 0,05).

Рисунок 3

Влияние удаления XBP1, специфичного для молочной железы, на состав молока. Мышей, несущих XBP1 дикого типа (WT) или нулевой XBP1 в MEC (ΔXBP1 ^MEC ), исследовали на 14-й день лактации. А. Молоко собирали у самок WT или ΔXBP1 ^MEC и анализировали на содержание лактозы, белка и жира.Столбцы представляют собой среднее значение ± стандартная ошибка указанного компонента молока (n = 5–8 самок на генотип). **, P < 0,01; ***, P < 0,001. B, молоко (10 мкл разведения 1:1 с PBS) анализировали с помощью SDS-PAGE и окрашивания кумасси синим (n = 5 на генотип). Для каждого генотипа показаны две репрезентативные выборки. Положения маркеров молекулярной массы показаны слева, тогда как идентификация белков молока указана справа (Лф, лактоферрин, СА, сывороточный альбумин, α-КСН, α-казеин, β-КСН, β-казеин, γ- CSN, γ-казеин; ϵ-CSN, ϵ-казеин; WAP, сывороточный кислый белок).C. Профиль жирных кислот молока анализировали с помощью газовой хроматографии (n = 7–8 самок для каждого генотипа). Жирные кислоты были сгруппированы по категориям, отражающим их длину цепи и происхождение (<16 атомов углерода [C ≤ 14], молочное происхождение; ровно 16 атомов углерода [C = 16], молочное и немаммарное происхождение; >16 атомов углерода [C ≥ 18], немаммарное происхождение ). Каждая категория была выражена в процентах от общего количества присутствующих жирных кислот. Процентное содержание общих жирных кислот показано для категории жирных кислот, где каждая полоса представляет собой среднее значение ± стандартная ошибка.#, P < 0,07.

Рисунок 3

Влияние удаления XBP1, специфичного для молочной железы, на состав молока. Мышей, несущих XBP1 дикого типа (WT) или нулевой XBP1 в MEC (ΔXBP1 ^MEC ), исследовали на 14-й день лактации. А. Молоко собирали у самок WT или ΔXBP1 ^MEC и анализировали на содержание лактозы, белка и жира. Столбцы представляют собой среднее значение ± стандартная ошибка указанного компонента молока (n = 5–8 самок на генотип). **, P < 0,01; ***, P < .001. B. Молоко (10 мкл разведения 1:1 с PBS) анализировали с помощью SDS-PAGE и окрашивания кумасси синим (n = 5 на генотип). Для каждого генотипа показаны две репрезентативные выборки. Положения маркеров молекулярной массы показаны слева, тогда как идентификация белков молока указана справа (Лф, лактоферрин, СА, сывороточный альбумин, α-КСН, α-казеин, β-КСН, β-казеин, γ- CSN, γ-казеин; ϵ-CSN, ϵ-казеин; WAP, сывороточный кислый белок). C. Профиль жирных кислот молока анализировали с помощью газовой хроматографии (n = 7–8 самок для каждого генотипа).Жирные кислоты были сгруппированы по категориям, отражающим их длину цепи и происхождение (<16 атомов углерода [C ≤ 14], молочное происхождение; ровно 16 атомов углерода [C = 16], молочное и немаммарное происхождение; >16 атомов углерода [C ≥ 18], немаммарное происхождение ). Каждая категория была выражена в процентах от общего количества присутствующих жирных кислот. Процентное содержание общих жирных кислот показано для категории жирных кислот, где каждая полоса представляет собой среднее значение ± стандартная ошибка. #, P < 0,07.

Затем мы спросили, влияют ли изменения в экспрессии гена MEC на влияние XBP1 на состав молока.В соответствии со сниженным содержанием белка в молоке ΔXBP1 ^MEC экспрессия специфичных для молочной железы белков сывороточного кислого белка ( Wap ) и β-казеина ( Csn2 ) была ниже у ΔXBP1 ^MEC , чем у WT MEC ( P <0,05 и P <0,09) (Фигура 4A. Абляция XBP1 не влияла на экспрессию липогенных генов синтазы жирных кислот ( Fasn ), стеароил-кофермента А-десатуразы 1 ( Scd1 ), и диацилглицерол-О-ацилтрансфераза 1 ( Dgat1 ) (рис. 4В, но повышенная экспрессия 3 генов, участвующих в образовании и секреции липидных капель в молоко (бутирофилин [ Btn1a1 ], ксантиндегидрогеназа [ Xdh ] и фактор фрагментации ДНК, вызывающий гибель клеток [ Cidea ]) ( P < .05) (Рисунок 4C. Наконец, абляция XBP1 не изменяет экспрессию фермента, ограничивающего скорость, ответственного за синтез галактозы (UDP-галактозо-4-эпимераза [ Gale ]), и не оказывает последовательного влияния на экспрессию 2 генов, кодирующих фермент лактозосинтаза (α-лактальбумин [ Lalba ] и UDP-Gal:βGlcNAc β1,4-галактозилтрансфераза [ B4galt1 ]) (рис. 4D. Эти изменения в экспрессии генов согласуются с реципрокными изменениями, наблюдаемыми в белках и жирах). содержание молока ΔXBP1 ^MEC , но не объясняет более низкое содержание лактозы.В целом, отсутствие значительного одностороннего снижения компонентов молока и экспрессии ассоциированных генов не согласуется с абсолютным требованием XBP1 для дифференцировки секреторного эпителия.

Рисунок 4

Влияние специфического для молочной железы удаления XBP1 на экспрессию генов, участвующих в синтезе органических компонентов молока. МЭК выделяли на 5-й день лактации из молочной железы мышей, несущих XBP1 дикого типа (WT) или нулевой XBP1 в МЭК (ΔXBP1 ^MEC ).Тотальную РНК выделяли и анализировали с помощью количественной ПЦР в реальном времени на экспрессию генов, участвующих в (A) синтезе молочных белков (сывороточный кислый белок [ Wap ] и β-казеин [ Csn2 ]), (B) синтезе липиды молока [синтаза жирных кислот ( Fasn ), стеароил-коэнзим А-десатураза 1 ( Scd1 ), диацилглицерол-О-ацилтрансфераза 1 ( Dgat1 )], (C) образование липидных капель (бутирофилин [], Btn1a1 ксантиндегидрогеназа [ Xdh ] и индуцирующий гибель клеток фактор фрагментации ДНК [ Cidea ]), (D) синтез лактозы (UDP галактозо-4-эпимераза [ Gale ], α-лактальбумин [ Lalba ] и UDP -Gal: βGlcNAc β1,4-галактозилтрансфераза [ B4galt1 ]).Для каждого гена экспрессия указанной мРНК соотносится с уровнем WT, где каждая полоса представляет собой среднее значение ± стандартная ошибка для 5–8 самок. *, P < 0,05; #, P < 0,09.