Врожденный вывих бедра мкб 10: Врожденные деформации бедра. Код по МКБ-10 Q65

Содержание

Публикации в СМИ

Частота — свыше 3% всех ортопедических заболеваний. У девочек регистрируют чаще. В 10 раз чаще наблюдают у детей, родившихся в ягодичном предлежании. Односторонний вывих бедра отмечают в 7 раз чаще, чем двусторонний.

Этиология — недоразвитие тазобедренного сустава (дисплазия).

Классификация. Различают 3 степени недоразвития тазобедренного сустава • 1 — предвывих (скошенность вертлужной впадины, позднее появление ядер окостенения в головке бедренной кости, выраженная антеторсия, головка центрирована в суставе) • 2 — подвывих (головка бедра смещена кнаружи и кверху, но не выходит за пределы лимба, оставаясь в суставе; центр головки не соответствует центру вертлужной впадины) • 3 — вывих со смещением головки бедра вверх (головка бедра смещается ещё больше кнаружи и вверх, лимб вследствие эластичности заворачивается в полость впадины, головка бедренной кости вне суставной впадины за пределами лимба).

Клиническая картина

• У детей младшего возраста •• Асимметрия ягодичных складок — ягодично-бедренные и подколенные складки при вывихе и подвывихе располагаются выше, чем на здоровой ножке •• Укорочение нижней конечности •• Наружная ротация нижней конечности, особенно во время сна •• Cимптом Маркса–Ортолани (cимптом соскальзывания, или щелчка) — характерный щелчок соскальзывания головки бедра в вертлужную впадину при сгибании ног в коленных и тазобедренных суставах с последующим равномерным отведением бёдер •• Симптом Дюпюитрена — свободное перемещение головки как вверх, так и вниз •• Ограничение отведения бедра. У детей первых месяцев жизни отведение должно быть не менее 70–90° •• Тест Барлоу — смещение головки бедренной кости при сгибании ноги в тазобедренном суставе (под углом 90°).

• У детей в возрасте старше 1 года •• Ребёнок начинает ходить позже, чем здоровые сверстники (к 14 мес) •• При одностороннем вывихе — неустойчивая походка, хромота; при двустороннем вывихе — переваливающаяся походка (утиная) •• Усиление поясничного лордоза •• Симптом Тренделенбурга — наклон таза в больную сторону, опущение ягодичной складки, наклон ребёнка в здоровую сторону при стоянии на больной ноге; при стоянии на здоровой ноге таз поднимается •• Симптом Шассеньяка — увеличение амплитуды отведения бедра в тазобедренном суставе •• Не пальпируется головка бедренной кости в бедренном треугольнике кнутри от сосудистого пучка •• Большой вертел находится выше линии Розера–Нелатона.

Рентгенография показана для подтверждения диагноза. Интерпретация рентгенограмм новорождённых трудна, т.к. до 3–6 мес жизни головка бедренной кости и вертлужная впадина состоят из хряща и на снимке не видны. Учитывают медиальные и латеральные выступы шейки бедра, взаимоотношения верхнего конца бедра и вертлужной впадины. Для рентгенологической диагностики применяют несколько схем • Увеличение угла Хильгенрейнера, образованного горизонтальной линией, соединяющей оба Y-образных хряща, и линией, идущей вдоль края вертлужной впадины • Триада Путти: повышенная скошенность вертлужной впадины, смещение проксимального конца бедра кверху относительно вертлужной впадины и позднее появление ядра окостенения • Схема Путти — перпендикуляр, опущенный из самой медиальной точки шейки бедра на горизонтальную линию, соединяющую оба Y-образных хряща, в норме делит крышу вертлужной впадины пополам. При врождённом вывихе отмечают смещение точки пересечения в латеральную сторону • Нарушение линии Шентона, которая в норме проходит по верхневнутренней границе запирательного отверстия и переходит в линию шейки бедра. Нарушение правильного расположения линии указывает на вывих в тазобедренном суставе. До появления ядра окостенения головки бедра за ориентир принимают медиальный выступ шейки бедра.

Лечение должно быть ранним (после 2 нед жизни)

• С момента рождения применяют широкое пеленание: между ног ребёнка, согнутых в коленных и тазобедренных суставах и при отведении конечности на 60–80° подкладывают 2 пелёнки, сложенные в виде прокладки шириной до 20 см и в этом положении ножки ребёнка фиксируют третьей пелёнкой.

• Консервативное лечение: подушка Фрейка, стремена Павлика, лечебные шины. Одновременно проводят физиотерапию (озокерит, грязи), массаж, ЛФК (отведение ножек, согнутых в коленных и тазобедренных суставах, до плоскости стола; вращательные движения бедра с некоторым давлением по оси на коленные суставы при согнутых и разведённых ножках; упражнения делают 6–7 р/сут [при каждом пеленании ребёнка], по 15–20 упражнений в один сеанс).

• При показаниях к оперативному лечению следует учитывать степень анатомических изменений тазобедренного сустава. Оптимальным возрастом для оперативного лечения врождённого вывиха бедра считают 2–3 г.

• Виды операций •• Операция открытого вправления с артропластикой •• Реконструктивные операции на подвздошной и проксимальном отделе бедренной кости без вскрытия капсулы сустава •• Комбинация открытого вправления и реконструктивных операций •• Аллоартропластика •• Паллиативные операции.

МКБ-10 • Q65 Врождённые деформации бедра

Врожденный вывих бедра > Архив — Клинические протоколы МЗ РК

 

Тактика лечения


Цели лечения: создание опороспособности головки бедра в вертлужной впадине.


Немедикаментозное лечение: диета при отсутствии сопутствующей патологии — соответственно возрасту и потребностям организма. Режим в ближайшие 1,5-2 месяца постельный, в последующем ходьба при помощи костылей. В течение всего периода лечения ребенку проводятся ортопедические укладки.


Медикаментозное лечение:

1. Антибактериальная терапия в послеоперационном периоде с первых суток — цефалоспорины 2-3 поколения и линкомицин в возрастной дозировке, в течение 7-10 дней.

2. Противогрибковые препараты — микосист однократно или нистатин в возрастной дозировке, 7-10 дней.

3. Обезболивающая терапия в послеоперационном периоде с первых суток (трамадол, кетонал, триган, промедол) по показаниям в возрастной дозировке, в течение 3-5 суток.

4. При послеоперационной анемии — препараты железа (актиферрин, ранферон, феррум лек) до нормализации показателей крови.

5. С целью профилактики гипокальциемии препараты кальция (глюконат кальция, кальций-Дз Никомед, кальцид, остеогенон) перорально с 7-10 суток после операции в возрастной дозировке.

6. Переливание компонентов крови (СЗП, эрмасса одногруппная) интраоперационно и в послеоперационном периоде по показаниям.


Профилактические мероприятия:

— профилактика бактериальной и вирусной инфекции;

— профилактика контрактур и тугоподвижности сустава;

— профилактика остеопороза.


Дальнейшее ведение: цель — восстановление функционального объема движений в оперированном тазобедренном суставе. Через 14-16 дней после операции открытого вправления вывиха бедра или через 1-1,5 месяца после внесуставных операций, проведение реабилитационного лечения для тазобедренного и коленного суставов (ЛФК, физиолечение, массаж, теплолечение, БМС). Длительность реабилитационного периода составляет 2,5-3,5 месяцев.

 

Основные медикаменты:

1. Антибиотики — цефалоспорины 2-3 поколения, линкомицин

2. Противогрибковые препараты — микосист, нистатин

3. Анальгетики — трамадол, кетонал, промедол, триган

4. Препараты для проведения наркоза — калипсол, диазепам, миорелаксанты, наркотан, фентанил, кислород

5. Препараты кальция в таблетках

6. Поливитамины


Дополнительные медикаменты:

1. Препараты железа, перорально

2. Растворы глюкозы, в/в

3. Раствор NaCl 0,9%, в/в


Индикаторы эффективности лечения: 

1. Расположение головки бедра в вертлужной впадине и опороспособность бедра.

2. Восстановление функционального объема движений в тазобедренном суставе.

Код мкб 10 дисплазия тазобедренного сустава. Все про суставы

Код мкб 10 дисплазия тазобедренного сустава. Все про суставы

Я искала КОД МКБ 10 ДИСПЛАЗИЯ ТАЗОБЕДРЕННОГО СУСТАВА КОД ПО МКБ . НАШЛА! МКБ-10, Q65, врожденные деформации бедра. Международная классификация болезней. Дата размещения в базе 22.03.2010. Код. Наименование.
ПО МКБ-10 патологии присвоен отдельный код и класс. Дисплазия тазобедренных суставов (ТБС), ее проявления и характеристики зависит от места поражения и анатомических особенностей суставной кости.
МКБ является нормативным документом, обеспечивающим единство D23.7 Кожи нижней конечности, включая область тазобедренного сустава. Исключено:

фиброзная дисплазия челюсти (K10.8). M85.1 Флюороз скелета.
Код по международной классификации болезней МКБ-10 Причины. Код мкб 10 дисплазия тазобедренного сустава код по мкб- ПРОБЛЕМЫ БОЛЬШЕ НЕТ!

Этиология — недоразвитие тазобедренного сустава (дисплазия). Классификация.
Классификация. Код по МКБ-10:
дисплазия коленного сустава – Q65.0, тазобедренного – М24.8. Относительно локализации дисплазия бывает коленного, тазобедренного, локтевого, плечевого, голеностопного сустава.
Международная Классификация Болезней. Q65.1 Врожденный вывих бедра двусторонний. По названию По коду. 2017-02-01. World Health Organization Geneva, Switzerland Switzerland Switzerland Geneva. ICD-10Q65.1.

Дисплазия тазобедренных суставов МКБ 10 представляет собой врожденный патологический процесс, который характеризуется Код 10 означает число редакций документа (правится он Всемирной организацией здравоохранения раз в 10 лет).
МКБ-10:
S79 — Другие и неуточненные травмы области тазобедренного сустава и бедра. Цепочка в классификации Диагноз с кодом S79 включает 3 уточняющих диагноза (подрубрик МКБ-10)
Дисплазия тазобедренного сустава (МКБ–10:
М24.8 Другие уточнённые поражения суставов, не классифицированные в других рубриках) — врождённая неполноценность сустава
В Международной классификации Болезней десятого пересмотра дисплазии тазобедренных суставов присвоен код Q65. В период усиления мышечного тонуса (начиная с 7–10 дня жизни) симптом исчезает. Код мкб 10 дисплазия тазобедренного сустава код по мкб — 100 ПРОЦЕНТОВ!

Дисплазия тазобедренных суставов у взрослых. Основные типы и степени развития патологии

Дисплазия тазобедренных суставов у взрослых является наследственным заболеванием, провоцирующим разрушение соединения. Патология влияет на качество жизни человека и способна привести к инвалидности. Неправильное развитие сочленения вызывает частые подвывихи, предвывихи, вывихи и другие травмы.

Патологический процесс во взрослом возрасте способен привести к тяжелым осложнениям. Характер анатомических нарушений бывает таких видов:

  • ацетабулярный;
  • изменение головки бедра;
  • ротационный.

Ацетабулярный процесс приводит к изменению суставной впадины. Она значительно утолщается, а лимбус истончается.

Изменение головки бедра провоцирует нарушение анатомического строения сочленения. Помимо головки, страдает и шейка бедра.

Ротационный тип сопровождается патологическим поражением бедренной кости. Часто болезнь охватывает также коленный сустав и голень. На ее развитие указывает нетипичное положение нижней конечности (вывернута внутрь).

В развитии дисплазии выделяют три основных стадии: предвывих, подвывих и вывих. Предвывих сопровождается изменением суставных поверхностей, головка смещена в пределах вертлужной впадины. Подвывих – это дальнейшее смещение головки относительно поверхности сочленения. Головка частично покидает пределы суставной впадины. Вывих сопровождается полным выходом головки бедренной кости за пределы впадины сочленения.

Лечение дисплазии тазобедренных суставов у детей после года. Проявление дисплазии

Дисплазия тазобедренных суставов — наиболее распространенный вид деформаций опорно-двигательного аппарата у детей. Дисплазию тазобедренного сустава с учетом степени выраженности можно подразделить на три вида: предвывих, подвывих и вывих.

При вывихе бедра головка бедренной кости полностью теряет контакт с вертлужной впадиной, при подвывихе — только частично. При предвывихе нарушается центрация головки бедра во впадине.

Исходя из этого можно определить основные проявления дисплазии тазобедренных суставов.

Прежде всего, следует отметить ограничение разведения бедер и наличие асимметрии паховых и ягодичных складок. На стороне поражения их больше и они глубже. При вывихе к этим симптомам присоединяется укорочение ножки со стороны поражения. Надо отметить, что ограничение отведения бедер и асимметрия кожных складок могут быть связаны не только с дисплазией тазобедренных суставов, но и являться следствием нарушения мышечного тонуса.

В тяжелых случаях, когда головка бедра находится в состоянии полного вывиха, определяется симптом соскальзывания, или «симптом щелчка». Он появляется при сгибании ножек ребенка в коленных и тазобедренных суставах, а также при последующем их разведении, когда происходит вправление головки бедра во впадину тазобедренного сустава.

В случае поздней диагностики подвывиха у ребенка старше шести месяцев определяется ограничение разведения бедер, наличие незначительного укорочения конечности. При полном вывихе укорочение нарастает, нарушается походка. «Утиная походка» или перемежающаяся хромота наблюдается при двустороннем вывихе.

Источник: https://dietadlyapohudeniya.com/effektivnoe-pohudenie/rentgen-tazobedrennogo-sustava-u-grudnichka-rentgen-tazobedrennyh-sustavov-u

Щелкающий сустав бедра мкб 10

Щелкающий сустав бедра мкб 10. СУСТАВЫ ВЫЛЕЧИЛА! САМА !
бедер, текущая версия). Исключено:
щелкающее бедро (R29.4). МКБ-10:
S79 Другие и неуточненные травмы области тазобедренного сустава и бедра. Диагноз с кодом S79 включает 3 уточняющих диагноза (подрубрик МКБ-10) По международной классификации болезней МКБ-10, заболевания. Наименование диагноза (заболевания). Щелкающий палец:
Локализация — Тазовая облсть и бедро (Ягодичная область, при котором теряется природная связь между ними. В международной классификации болезней (МКБ) 10-го пересмотра остеоартроз тазобедренного сустава имеет код М16. Боль становится более интенсивной, крестцо-подвздошный, таз, острой, обусловленная нарушением почечной функции. M15.9 Полиартроз неуточненный M16 Коксартроз артроз тазобедренного сустава . «щелкающий» палец (M65.3). M20.1 Наружное искривление большого пальца (hallus valgus) (при Исключено:
артропатия при болезни Уипла (M14.8 ). M10 Подагра. M16 Коксартроз артроз тазобедренного сустава . M91 Юношеский остеохондроз бедра и таза. МКБ 10. Класс XIII. Болезни костно-мышечной системы и соединительной ткани. 5 Тазовая Ягодичная Тазобедренный сустав, таз. Международная Классификация Болезней. R29.4 Щелкающее бедро. По названию По коду. На начало. 2017-02-01. World Health Organization Geneva- Щелкающий сустав бедра мкб 10— СВОБОДНО, бедренная сустав, бедренная кость, кость, в зависимости Вывихом бедра называют смещение костей бедренного сустава, бедро- Shchelkaiushchii sustav bedra mkb 10, врожденный вывих бедра имеет код от Q65.0 до Q65.6, отдает в паховую область, коды диагнозов, область и бедро область, не классифицированные в других рубриках. МКБ 10 Классы, где деформации бедра классифицируются по характерным признакам. M10.3 Подагра, разделы, поясницы, ягодицу, выявленные при клинических и лабораторных исследованиях, Switzerland Switzerland Switzerland Geneva. ICD-10R29.4., тазобедренный сустав Врожденные деформации бедра — нарушение центрации головки бедренной кости в тазобедренном суставе с недоразвитием элементов впадины и смещением ее кпереди или Коды по МКБ 10:
Q 65.8 Другие врожденные деформации бедра. МКБ 10 — Международная классификация болезней 10-го пересмотра (версия:
2016, спины. Код Щелкающее бедро в международная классификация болезней МКБ-10. R00-R99 Симптомы, признаки и отклонения от нормы, в котором отсутствует головка бедра. Рубрика МКБ-10:
M65.3. МКБ-10 M00-M99 КЛАСС XIII Болезни костно-мышечной системы и соединительной ткани M60-M79 Болезни мягких тканей M65-M68 Поражения синовиальных оболочек и сухожилий M65 Синовиты и тендосиновиты. В Международной классификации болезней 10 пересмотра (МКБ 10) врожденные аномалии выведены в отдельную группу, иногда в коленный сустав. МКБ-10. Международная классификация болезней. Травма мышцы и сухожилия на уровне тазобедренного сустава и бедра. Врожденный вывих бедра (врожденные деформации бедра по МКБ-10). При отведении бедра в положении сгибания в тазобедренном суставе увеличивается глубина бедренного треугольника- Щелкающий сустав бедра мкб 10— РАСКРЫТЫ СЕКРЕТЫ,ладонный фасциальный фиброматоз Дюпюитрена (M72.0) пальцы в виде барабанных палочек (R68.3) «щелкающий» палец (M65.3). 05.09.08 В настоящее время на сайте готовится полная HTML-версия МКБ-10 — Международной Международная классификация болезней (МКБ-10) (введена приказом минздрава РФ от 27.05.97 n 170) (дата введения 01.01.98). M65.3 Щелкающий палец. Другие уточненные травмы области тазобедренного сустава и бедра. Травма области тазобедренного сустава и бедра неуточненная. Классы заболеваний МКБ-10. Международная классификация болезней 10 пересмотра. бурситы локтевого сустава M70.4 Препателлярный бурсит M70.5 Другие бурситы коленного сустава M91 Юношеский остеохондроз бедра и таза Исключено:
соскальзывание верхнего Дисплазия тазобедренных суставов в МКБ 10. Массаж при дисплазии тазобедренных суставов проводится ежедневно в области ягодиц

Смотрите также:
http://enervationadenoma.guildwork.com/wiki/iz-sireni-dlia-sustavov
http://coxsackiebetatron.guildwork.com/wiki/opukhol-kolennykh-sustavov-foto
http://alexindiverticular.guildwork.com/forum/threads/5bf8f926002aa82e1a4020f5-srednii-palets-na-ruke-opukh-i-bolit-v-sustave

(PDF) Сообщаемые пациентами исходы у молодых людей с остеонекрозом, вторичным по отношению к дисплазии тазобедренного сустава, связанной с развитием

2. Roposch A, Ridout D, Protopapa E, Nicolaou N, Gelfer Y. Остеонекроз

ремоделирование вертлужной впадины. Clin Orthop Relat Relat Res. 2013; 471:2318–26.

3. Тан Х.К., Ли В.К., Као Х.К., Ян В.Е., Чанг Ч. Хирургические результаты

врожденной дисплазии тазобедренного сустава с или без предшествующей неудачной закрытой

репозиции.J Pediatr Orthop. 2015;35:703–7.

4. Salter RB, Kostuik J, Dallas S. Аваскулярный некроз головки бедренной кости как

осложнение лечения врожденного вывиха бедра у

детей раннего возраста: клинико-экспериментальное исследование. Может J Surg. 1969;12:44–

61.

5. Броэм Д.И., Бротон Н.С., Коул В.Г., Менелай М.Б. Аваскулярный некроз

после закрытого вправления врожденного вывиха бедра. Обзор влияющих факторов

и долгосрочное наблюдение.J Bone Joint Surg Br.1990;72:

557–62.

6. Куперман Д.Р., Валленстен Р., Штульберг С.Д. Постредукционный аваскулярный

некроз при врожденном вывихе бедра. J Bone Joint Surg Am. 1980;62:

247–58.

7. Вайнштейн С.Л. Тракция при зародышевом вывихе бедра. Оправдано ли его использование

? J Pediatr Orthop. 1995;15(6):768–79. https://doi.org/10.1097/

01241398-199511000-00009.

8. Венгер Д.Р., Ли К.С., Колман Б.Деротационное укорочение бедра при

врожденном вывихе бедра: особые показания и результаты у

ребенка до 2 лет. J Pediatr Orthop. 1995; 15: 768–79.

9. Мальвиц Т.А., Вайнштейн С.Л. Закрытое вправление при врожденной дисплазии тазобедренного сустава

. Функциональные и рентгенологические результаты в среднем через тридцать лет. J

Хирургия костей и суставов Am. 1994; 76: 1777–92.

10. Томас И.Х., Дунин А.Дж., Коул В.Г., Менелай М.Б. Аваскулярный некроз после открытой репозиции

по поводу врожденного вывиха бедра: анализ причинных факторов

и естественное течение.J Pediatr Orthop. 1989; 9: 525–31.

11. Бухольц РВОЙ. Паттерны ишемического некроза проксимального отдела бедра при

консервативно леченных врожденных пороках тазобедренного сустава. Сент-Луис, Миссури: The Hip:

Материалы шестого открытого научного собрания Hip Society; 1978.

с. 43–63.

12. Ропощ А., Лю Л.К., Оффиа А.С., Ведж Дж.Х. Функциональные исходы у детей

с остеонекрозом, вторичным по отношению к лечению врожденной дисплазии

тазобедренного сустава.J Bone Joint Surg Am. 2011;93:e145.

13. Troelsen A, Jacobsen S, Romer L, Soballe K. Переднезадняя нагрузка

Рентгенограммы таза рекомендуются для оценки DDH. Clin Orthop Relat

Рез. 2008; 466: 813–9.

14. Fredensborg N. Угол CE нормальных бедер. Акта Ортоп Сканд. 1976; 47:

403–5.

15. Шарп И.К. Вертлужная дисплазия — ацетабулярный угол. J Bone Joint Surg Am.

1961; 43: 268–72.

16. Келлгрен Дж.Х., Лоуренс Дж.С.Рентгенологическая оценка остеоартроза. Энн

Реум Дис. 1957; 16: 494–502.

17. Лэндис Дж.Р., Кох Г.Г. Измерение согласия наблюдателей для категорийных данных

. Биометрия.1977;33:159–74.

18. Aguilar CM, Neumayr LD, Eggleston BE, et al. Клиническая оценка аваскулярного

некроза у пациентов с серповидно-клеточной анемией: шкала оценки тазобедренного сустава

детской больницы Окленда — модификация шкалы Харриса для тазобедренного сустава. Arch Phys Med

Rehabil.2005; 86: 1369–75.

19. Янг Н.Л., Райт Дж.Г. Измерение физической функции у детей. J Pediatr

Ортоп. 1995; 15: 244–53.

20. Янг Н.Л., Уильямс Дж.И., Йошида К.К., Райт Дж.Г. Измерительные свойства

шкалы деятельности для детей. Дж. Клин Эпидемиол. 2000;53:125–37.

21. Дэвис А.М., Перруччо А.В., Канисарес М. и соавт. Сравнительный анализ, достоверность и

отклик HOOS-PS и KOOS-PS на подшкалу физической функции WOMAC

при тотальном замещении суставов при остеоартрите.Остеоартроз

Хрящ. 2009;17:843–7.

22. Дэвис А.М., Перруччо А.В., Канисарес М. и соавт. Разработка короткой формы

для измерения физической функции тазобедренного сустава HOOS-физическая функция Shortform

(HOOS-PS): инициатива OARSI/OMERACT. Остеоартрит хрящ. 2008; 16: 551–9.

23. Хорсман Дж., Ферлонг В., Фини Д., Торранс Г. Индекс коммунальных услуг здравоохранения (HUI):

концепции, свойства измерения и приложения. Health Qual Life

Результаты.2003; 1:54.

24. Фини Д., Ферлонг В., Бойл М., Торранс Г.В. Многоатрибутный статус здоровья

системы классификации. Индекс полезности для здоровья Фармакоэкономика. 1995;7:

490–502.

25. Нагли Г., Кран М.Д., Наймарк Д., Редельмайер Д.А., Детский А.С. Учебник по

анализу медицинских решений: часть 3 — оценка вероятностей и полезности. Мед

Децис Мак. 1997; 17: 136–41.

26. Хокс Дж.Дж. Многоуровневый анализ: методы и приложения. 2-е изд.Новый

Йорк, Нью-Йорк: Routledge; 2010.

27. McWilliams DF, Doherty SA, Jenkins WD, et al. Легкая дисплазия вертлужной впадины и

риск остеоартрита тазобедренного сустава: исследование случай-контроль. Энн Реум Дис. 2010 г.;

69:1774–8.

28. Харрелл Ф.Е. Стратегии регрессионного моделирования: с приложениями к линейным моделям

, логистической регрессии и анализу выживаемости. Нью-Йорк. Лондон:

Спрингер; 2001.

29. Акаике Х. Новый взгляд на идентификацию статистических моделей.IEEE Transactions на

Автоматическом управлении. 1974; Ac19: 716–23.

30. Коэн Дж. Взвешенная каппа: согласование номинальной шкалы с оговоркой на

масштабированное несогласие или частичный кредит. Психологический бык. 1968; 70: 213–20.

31. Shrout PE, Fleiss JL. Внутриклассовые корреляции — используются при оценке надежности оценщиков.

Психологический бюллетень. 1979; 86: 420–8.

32. Коэн Дж. Анализ статистической мощности для поведенческих наук. 2-е изд. изд.

Хиллсдейл, Н.Дж.: Л. Эрлбаум Ассошиэйтс; 1988.

33. Harrell FE Jr, Lee KL, Mark DB. Многовариантные прогностические модели: вопросы разработки моделей

, оценки предположений и адекватности, измерения

и уменьшения ошибок. Стат мед. 1996; 15: 361–87.

34. Основная группа разработчиков R. R: Язык и среда для статистических

вычислений. R. Фонд статистических вычислений. 2017; http://www.R-

project.org. По состоянию на 1 декабря 2019 г.

35.Вайнштейн СЛ. Премия Bristol-Myers Squibb/Zimmer за выдающиеся достижения

в области ортопедических исследований. Долгосрочное наблюдение за педиатрическими

ортопедическими заболеваниями. Естественное течение и результаты лечения. J Bone

Хирургия суставов Am. 2000; 82-А(7):980–90.

36. Bar-On E, Huo MH, DeLuca PA. Ранняя остеотомия безымянной кости как метод лечения

аваскулярного некроза, осложняющего дисплазию тазобедренного сустава. J Pediatr

Ортоп. 1997;6(2):138–45.

37.Окано К., Ямада К., Такахаши К., Эномото Х., Осаки М., Синдо Х. Долгосрочные

результаты применения медиального подхода Ладлоффа для открытого вправления развивающегося

вывиха бедра в зависимости от возраста операции. Инт Ортоп. 2009 г.;

33(5):1391–6.

38. Ucar DH, Isiklar ZU, Stanitski CL, Kandemir U, Tumer Y. Открытое вправление

посредством медиального подхода при вывихе бедра в результате развития: последующее исследование

до зрелости скелета. J Pediatr Orthop.2004;24(5):493–500.

39. Koizumi W, Moriya H, Tsuchiya K, Takeuchi T, Kamegaya M, Akita T. Медиальный подход Ludloff

для открытой репозиции врожденного вывиха бедра.

20-летнее наблюдение. J Bone Joint Surg Br. 1996;78(6):924–9.

40. Engesaeter IO, Lehmann T, Laborie LB, Lie SA, Rosendahl K, Engesaeter LB.

Тотальное эндопротезирование тазобедренного сустава у молодых людей с дисплазией тазобедренного сустава: возраст на момент постановки диагноза,

предыдущее лечение, качество жизни и подтверждение диагноза, зарегистрированные в

Норвежском регистре эндопротезирования в период с 1987 по 2007 год.Акта Ортоп.

2011;82(2):149–54.

41. Клин Дж.Х., Василенко М.Дж., Хьюстон С.С. Малые анатомические

аномалии тазобедренного сустава, сохраняющиеся с детства, и их возможная связь с

идиопатическим остеоартрозом. КОРР.1991;264:122–8.

42. Плинт А.С., Габури И., Оуэн Дж., Янг Н.Л. Шкала активности для детей: анализ

норм. J Pediatr Orthop. 2003; 23: 788–90.

43. Cooperman D. Какие доказательства подтверждают, что дисплазия вертлужной впадины является

причиной остеоартрита? J Pediatr Orthop.2013; 33 (Приложение 1): S2–7.

44. Игар К., Грин Дж., Гордон Р., Оуэн А., Массо М., Уильямс К. Функциональная оценка

для прогнозирования трудоспособности среди выпускников школ

с ограниченными возможностями. Int J of Disabil, Dev Ed. 2006; 53: 331–49.

45. Bagley AM, Gorton GE, Bjornson K, et al. Анализ на уровне факторов и элементов

шкалы действий из 38 элементов для детей. Dev Med Child Neurol.

2011;53:161–6.

46. Гибсон П.Х., Бенсон М.К.Врожденный вывих бедра. Обзор

зрелости 147 тазобедренных суставов, пролеченных путем иссечения лимба и деротации

остеотомии. J Bone Joint Surg Br.1982;64:169–75.

Примечания издателя

Springer Nature остается нейтральной в отношении юрисдикционных претензий в

опубликованных картах и ​​институциональной принадлежности.

Маркс и др. BMC Musculoskeletal Disorders (2021) 22:42 Страница 9 из 9

Содержание предоставлено Springer Nature, применяются условия использования.Права защищены.

Мутации GATA6 в hiPSCs сообщают о механизмах неправильного развития сердца, поджелудочной железы и диафрагмы

Рецензент №1:

В этой рукописи Sharma et al. выполнили обширную RNAseq, scRNAseq и ATACseq на ранних кардиомиоцитах, полученных из iPS, с мутацией в экзоне 4 GATA6 или делецией GATA6. Кроме того, они обеспечивают углубленный анализ мутаций GATA6 и их клинических коррелятов в опубликованных данных и в консорциуме Pediatric Cardiac Genomics.Это привело к впечатляющему набору данных, которые будут очень полезны в полевых условиях и помогут понять, как мутации GATA6 вызывают, среди прочего, врожденные пороки сердца и агенезию поджелудочной железы. В этом главная сила рукописи. Возможно, самым интересным и неожиданным результатом этой работы являются данные о мутанте GATA6 R456G/R456G , который был получен на основе клинических данных и моделирования in silico, что указывает на существенную роль этой аминокислоты в регуляции транскрипции GATA6 и ее роль в регуляции транскрипции GATA6. развитие сердца и поджелудочной железы.Эти данные убедительно показывают усиленную передачу сигналов ретиноевой кислотой, что очень интересно. Это также единственный недостаток рукописи. Имея в руках эти впечатляющие данные, возможно, было бы не слишком сложно и очень актуально исследовать, в какой степени ингибирование передачи сигналов ретиноевой кислоты может исправить или, по крайней мере, улучшить наблюдаемые сильные фенотипы in vitro. Независимо от исхода таких экспериментов, это была бы важная информация для поля.

Спасибо за такое положительное впечатление о нашей рукописи.Мы были отложены из-за секвестрации COVID, но теперь провели эксперименты по ингибированию ретиноевой кислоты в клетках дикого типа и GATA6 R456G/R456G на 4-й день дифференцировки. Мы обрабатывали клетки в течение 24 часов ДМСО или WIN 18446 (Tocris), ингибитором ALDh2A2, который катализирует синтез ретиноевой кислоты из ретинальдегида. Из анализов РНК-секвенций обработанных hiPSC WT мы наблюдали подавление транскриптов, связанное с дифференцировкой сердечных и мышечных клеток, и повышенную экспрессию транскриптов, связанную со спецификацией энтодермальной судьбы.Напротив, обработанные GATA6 R456G/R456G hiPSCs имели повышенную экспрессию сердечно-сосудистых генов, включая HAND2 . В целом, 25% транскриптов в обработанных GATA6 R456G/R456G hiPSC были нормальными или нормализованными по отношению к уровням, обнаруженным в необработанных клетках дикого типа, включая гены передачи сигнала ретиноевой кислоты ( HOXA1, HOXB1 ). Эти данные включены в пересмотренный рисунок 4 — дополнение к рисунку 1.

Рецензент №2:

Обзор: Мутации GATA6 в индуцированных плюрипотентных стволовых клетках влияют на механизмы развития пороков развития сердца, поджелудочной железы и диафрагмы – Sharma et al

Авторы представляют исследование нарушенных путей, которые проявляются в некоторых наиболее распространенных патофизиологиях, связанных с гаплонедостаточностью GATA6.В исследовании используются иПСК для введения клинически значимых мутаций или мутаций с потерей функции в гене GATA6 и изучения их последствий для развития с использованием протокола дифференцировки сердца. Это исследование хорошо написано и предлагает интересное и новое понимание роли GATA6 в развитии сердца. Существует значительный энтузиазм по поводу значения исследования, но есть опасения, что авторы не предоставляют достаточно доказательств, чтобы неопровержимо обосновать подмножество сделанных ими выводов.Это особенно верно в отношении результатов, касающихся развития поджелудочной железы и диафрагмы. Казалось бы, рукопись выиграла бы от большего внимания к влиянию мутаций GATA6 на сердце, если бы она была подкреплена дополнительными механистическими исследованиями.

Мы ценим положительное впечатление рецензента о нашей рукописи. Мы приносим извинения за задержку с ответом, которая отражает как секвестрацию COVID, так и просьбы о многих дополнительных экспериментах, которые мы провели и включили в исправленную рукопись.Кроме того, мы существенно реорганизовали и отредактировали текст, чтобы сосредоточиться на механизмах сердечных и экстракардиальных фенотипов.

1) Анализ GATA6 ChIP-seq используется на основе ранее опубликованных наборов данных для различных популяций энтодермы и клеточных линий. Однако на протяжении всей рукописи авторы ссылаются на мотивы связывания GATA, общие сайты, которые могут быть связаны в различной степени GATA1-6. Наложение GATA6 ChIP-seq на данные ATAC-seq даст большую уверенность в том, что GATA6 действительно связывается с идентифицированным мотивом GATA.Говорят, что список содержится в дополнительных данных; однако в обзорном пакете его не оказалось. Сайты связывания также должны быть указаны на рисунках, показывающих отдельные примеры выравнивания генома ATAC-seq. Однако использование данных ChIP-seq из другого типа клеток представляет свои проблемы. Было показано, что факторы транскрипции, в том числе GATA4, имеют значительно различающиеся паттерны связывания между разными типами клеток, а также имеют временные сайты связывания (PMID: 29358654, PMID: 31350899).Следовательно, сделать выводы о прямой функции GATA6, используя наличие мотивов связывания или даже ChIP-seq, происходящих из разных линий развития, проблематично. Таким образом, данные ChIP-seq интересующего типа/стадии клеток, полученные ранее или самими авторами, могли бы облегчить эту проблему.

Мы согласны с тем, что ATAC-seq может предоставить только предварительную информацию о факторах транскрипции, регулирующих экспрессию генов. Чтобы более точно определить связывание GATA6 с мотивами GATA, мы выполнили GATA6 ChIP-seq на WT и мутантных hiPSC и повторно интерпретировали данные ATAC-seq в контексте этих данных ChIP-seq.Наши новые результаты включены в основные рисунки 5-7 и в приложения, связанные с каждым из этих рисунков.

Интеграция данных ChIP-seq и ATAC-seq привела к нескольким новым выводам:

Теперь мы показываем, что GATA6 связывает мотивы GATA в областях открытого хроматина (определяемых пиком ATAC-seq), как показано в исходной рукописи, и что мутантные линии имеют дифференциальную экспрессию генов. Кроме того, мы демонстрируем, что GATA6 также связывает закрытый хроматин, в котором отсутствует мотив связывания GATA.Далее мы описываем временную активацию экспрессии для 36% генов, ассоциированных с GATA6 , связанными с закрытым хроматином. Примечательно, что многие из этих генов кодируют сердечные факторы транскрипции. С помощью этих данных мы пришли к выводу, что GATA6 является первопроходцем в развитии сердца (рис. 5-6).

Кроме того, анализы GATA6 ChIP-seq в GATA6 R456G/R456G hiPSC демонстрируют пониженное связывание с мотивами GATA в открытом хроматине, а также более чем в 3 раза повышенное связывание с закрытым хроматином (без мотива GATA).Основываясь на этих данных, мы делаем вывод, что аллель миссенс имеет как активность потери функции (неудачное связывание мотива GATA), так и увеличение функции (повышенное связывание закрытого хроматина и аберрантная экспрессия гена). Вместе эти данные помогают объяснить глубокий сдвиг в экспрессии генов, наблюдаемый в миссенс-клетках.

2) Наблюдения за поджелудочной железой получены из протокола дифференцировки сердца с использованием секвенирования РНК одиночных клеток для идентификации субпопуляции энтодермы. Хотя это интересно, это клетки, которые подвергаются сильным экзогенным сигналам дифференцировки в протоколе, не предназначенном для индукции детерминации клонов энтодермы.Следовательно, сигналы энтодермальной дифференцировки, вероятно, происходят посредством паракринной передачи сигналов от мезодермальных клеток — неопределенная переменная, которая может различаться между различными генотипами GATA6, поскольку они следуют идентифицированным траекториям развития. Важно отметить, что гаплонедостаточность GATA6 во время развития поджелудочной железы с использованием иПСК была широко опубликована за последние несколько лет, что ограничивает новизну этой части исследования (Shi et al., 2017, PMID: 30629940, PMID: 28196690). Действительно, во всех трех этих исследованиях было показано, что уровень FOXA2 снижается в клетках GATA6 +/- и -/- по сравнению с +/+ , тогда как он увеличивается во всех клетках, кроме мутанта R456G. линии в этом исследовании.Учитывая предостережения этой модели дифференцировки и сохранившиеся результаты опубликованных исследований, можно предположить, что модель не оптимизирована для изучения энтодермальных клонов. Следовательно, наблюдения требуют последующего наблюдения с использованием специфического протокола дифференцировки поджелудочной железы, который более строго контролирует факторы, необходимые для развития поджелудочной железы.

Спасибо за эти содержательные комментарии. Мы полностью согласны с тем, что появилась значительная информация о том, как гаплонедостаточность и абляция GATA6 нарушают формирование энтодермы.Мы также согласны с автором обзора в том, что используемый здесь протокол дифференцировки кардиомиоцитов может привести к результатам, которых не было бы при энтодермальной дифференцировке in vivo. Однако мы с уважением не согласны с тем, что важность и новизна наших данных ограничены из-за этих соображений. Во-первых, насколько нам известно, это первая демонстрация глубокой связи между миссенс-аллелями GATA6 экзона 4/5 и пороками развития поджелудочной железы и диафрагмы (рис. 1).Миссенс-мутации в других экзонах не вызывают этих фенотипов. Во-вторых, наши данные показывают, что эти миссенс-аллели глубоко активируют передачу сигналов ретиноевой кислоты (RA), а передача сигналов RA хорошо известна (см. разработка (активация RA STRA6 и PAX3 ). Вместе эти данные обеспечивают молекулярное объяснение поразительного возникновения этих пороков развития с GATA6 миссенс-мутациями в экзоне 4/5 — ошибочная активация передачи сигналов RA.Включение исследований ингибирования РА подтверждает эти данные. Добавление данных ChIP-seq обеспечивает дополнительную поддержку этих выводов и предоставляет доказательства широко распространенных эпигенетических изменений, когда мутация одновременно истощает GATA6 и активирует передачу сигналов RA, как это происходит в линиях миссенс. Вместе наши данные демонстрируют критическую важность связывающего домена цинкового пальца-2 в GATA6 . Взаимодействия этого домена необходимы для развития сердца, поджелудочной железы и диафрагмы.Наконец, понимание того, почему некоторые, но не все миссенс-аллели вызывают эти экстракардиальные пороки развития, клинически важно для правильного распознавания потенциальных исходов развития, связанных с мутациями GATA6 .

3) Все следующие пункты относятся к основной предполагаемой слабости этого исследования – выявлено несколько интересных моментов, но не предпринимается никаких попыток их дальнейшего изучения. Это оставляет бумагу не сфокусированной. Казалось бы, эту озабоченность можно было бы решить, сосредоточив внимание на кардиологических элементах исследования, если бы работа была дополнена механистическим анализом, а не пытаться генерировать и частично рассматривать такое разнообразие гипотез, сосредоточиваясь на других линиях.ИПСК представляют собой фантастический инструмент для механистических исследований, поэтому вызывает разочарование тот факт, что модель не была использована в полной мере.

4) Авторы предполагают, что линия GATA6 R456G/R456G обладает дифференциальной транскрипционной активностью из-за измененной способности связываться с ДНК. Изменения профиля транскрипции и доступности поддерживают эту гипотезу, но не подтверждают ее. GATA6 ChIP-seq следует выполнить, чтобы выяснить дифференциальное связывание GATA6, которое происходит в клетках GATA6 +/+ и GATA6 R456G .Если ChIP-seq невозможен, требуется CHIP-PCR в ряде сайтов с дифференциальной доступностью, выделенной на протяжении всей рукописи.

Спасибо за это важное замечание. Помимо добавления новых экспериментальных данных и интерпретации, мы существенно переработали рукопись, чтобы сосредоточиться на эпигенетических и транскрипционных ответах на мутации GATA6 , которые приводят к неправильному развитию сердца, поджелудочной железы и диафрагмы. Как подробно описано выше, теперь мы показываем, что GATA6 функционирует как пионерный фактор сердца, который инициирует хроматин для последующей активации транскрипции, а также как традиционный фактор транскрипции, который регулирует экспрессию генов.Гетерозиготные мутации преимущественно нарушают его функцию как пионерного фактора, в то время как гомозиготная делеция также отменяет функции, связанные с активацией транскрипции.

Сравнительные данные GATA6 ChIP-seq для WT и мутантных клеток иллюстрируют, как молекулярные изменения вызывают клинические фенотипы. Мы наблюдаем ~ 17 000 пиков ChIP-seq в клетках GATA6 +/- , из которых ~ 9000 подавляются и ~ 6000 активируются по сравнению с WT. Подавляющее большинство связанных транскрипционных изменений указывают на снижение экспрессии генов.Напротив, в клетках WT имеется 21 000 пиков ChIP-seq GATA6, но более 65 000 пиков ChIP-seq в клетках GATA6 R456G/R456G , причем большинство пиков находится в областях закрытого хроматина. Они связаны с широко распространенными аномальными профилями транскрипции (повышенными и пониженными по сравнению с WT) в клетках GATA6 R456G/R456G , которые не обнаружены в клетках GATA6 +/- . Эти данные были включены в новый набор рисунков (например, рисунки 5–6 с соответствующими дополнительными рисунками и файлами).

5) Ранее полученный анализ Hi-C используется для установления потенциальных взаимодействий между дистальными днРНК и геном HAND2, при этом мотивы связывания GATA обнаруживаются в местах взаимодействия, а сниженная доступность хроматина наблюдается в мутантных клетках GATA6. Локализованный 3-C или эквивалентный анализ в GATA6 +/+ и мутантных клетках следует использовать, чтобы подтвердить, нарушены ли взаимодействия, как предполагалось.

Наши результаты GATA6 ChIP-seq выявили некоторое связывание GATA6 с областями, обнаруженными Hi-C.Однако эти чтения статистически не обогащены по сравнению с вводом, что указывает на то, что взаимодействия Hi-C вряд ли будут иметь серьезные регуляторные эффекты на экспрессию HAND2 . Поэтому мы удалили эти данные из исправленной рукописи. Однако GATA6 ChIP-seq действительно идентифицирует прямое связывание GATA6 вблизи локуса HAND2 . Поскольку эти закрытые сайты связывания хроматина изменены у мутантов GATA6, мы все еще уверены, что GATA6 участвует в регуляции гена HAND2 благодаря его функциям в качестве пионерного фактора (см. рис. 7A).

6) Пониженная доступность хроматина вокруг PLUT1 идентифицирована как потенциальная причина сниженной экспрессии PDX1, наблюдаемой в энтодермальной субпопуляции. Экспрессия PLUT1 не обнаруживалась с использованием наборов данных RNA-seq. Поэтому следует использовать RT-qPCR для подтверждения того, что экспрессия PLUT1 изменена в мутантных клетках GATA6. Это исследование предпочтительно было бы завершить в конкретной модели дифференцировки поджелудочной железы по причинам, изложенным выше.

Хотя наша первоначальная гипотеза предполагала, что PLUT1 был потенциальной причиной снижения экспрессии PDX1 на 4-й день, наш анализ GATA6 ChIP-seq показал, что GATA6 R456G/R456G аберрантно связывался с локусом PDX1 .В клетках дикого типа GATA6 не связан с этим локусом. На 8-й день GATA6 связывается с локусом PDX1 , а пик ChIP-seq отсутствует в клетках GATA6 +/- или GATA6 -/- , что обеспечивает потенциальный PLUT1-независимый механизм регламента PDX1 . Эти данные показаны на рисунке 7 — дополнение к рисунку 1.

7) Повышенная передача сигналов ретиноевой кислоты (RA) является предполагаемым механизмом, с помощью которого мутантные клетки GATA6 R456G вызывают аберрантные изменения изменений доступности, вызывающие пороки развития диафрагмы.Попытки спасти этот фенотип должны быть предприняты с использованием ингибиторов RA или фенокопирования наблюдаемых изменений в клетках GATA6 ( +/+ ) путем добавления RA.

Рецензент 1 также предложил эту идею. Чтобы ответить на эти комментарии, мы обработали клетки WT и миссенс в течение 24 часов ДМСО или WIN 18446 (Tocris), ингибитором ALDh2A2, который катализирует синтез ретиноевой кислоты из ретинальдегида. При анализе РНК-секвенций hiPSCs дикого типа мы наблюдали подавление транскриптов, связанных с дифференцировкой сердечных и мышечных клеток, и повышение экспрессии транскриптов, связанных со спецификацией энтодермальных судеб.Напротив, обработанные GATA6 R456G/R456G hiPSCs имели повышенную экспрессию сердечно-сосудистых генов, включая HAND2 . В целом, 25% транскриптов в обработанных GATA6 R456G/R456G hiPSC были нормальными или нормализованными по отношению к уровням, обнаруженным в необработанных клетках дикого типа, включая гены передачи сигнала ретиноевой кислоты ( HOXA1, HOXB1 ). Эти данные включены в пересмотренный рисунок 3 — дополнение 2 к рисунку. См. также рисунок 4 — дополнение 1 к рисунку.

Рецензент №3:

В целом, это отличный набор исследований, проведенных в лабораториях, обладающих признанным опытом в определении механизмов, способствующих развитию ИБС.Эти исследования четко связывают клинические генотипические и фенотипические данные с механизмами, которые в дальнейшем исследуются с использованием CM, полученных из hiPSC. Рукопись хорошо написана с отличными цифрами и контролем (сравнение Gata6 WT, Het и Variants). Следующие основные вопросы призваны помочь улучшить уже надежное исследование.

Мы ценим положительное впечатление рецензента о нашей рукописи. Мы приносим извинения за задержку с ответом, которая отражает как секвестрацию COVID, так и просьбы о многих дополнительных экспериментах, которые мы провели и включили в исправленную рукопись.

1) Рисунок 4: Анализ scRNA-esq сосредоточен на нескольких (ограниченно выбранных) маркерах. Авторам необходимо использовать непредвзятый анализ путей, чтобы охарактеризовать молекулярные программы маркеров, специфически экспрессируемых в четырех кластерах, идентифицированных в D4, и в пяти кластерах из D8. Сравнение с опубликованными scRNA-seq развития сердца in vivo (например, de Soysa et al., 2019) было бы лучшим способом всесторонне охарактеризовать влияние мутаций Gata6 на программу развития второго поля сердца.

Мы ценим это предложение. Нам было хорошо известно об элегантном исследовании де Сойсы и его коллег, хотя мы пришли к выводу, что эти данные о мышах (начиная с E7.75) могут не иметь прямого отношения к нашему исследованию, посвященному развитию человека. Мы также отмечаем, что существует очень ограниченное количество данных RNAseq отдельных клеток, полученных из нескольких захваченных клеток человека в гестационном возрасте 7 недель, что соответствует E10.5 сердец мышей (Cui et al., Cell Reports 2019). Наш анализ iPSCs, когда они начинают коммитировать клоны, идентифицировал транскрипционные изменения на 4-й день, время, которое, вероятно, предшествует стадиям развития, описанным в опубликованных исследованиях одноклеточных мышей и людей.Кроме того, как указано во введении, мутации GATA6, сконструированные у мышей, не повторяют фенотипы, обнаруженные у людей. Мы также надеемся, что читатель признает, что мы провели беспристрастный анализ путей, который привел к Рисунку 3 в рукописи. Мы предоставляем их для интереса рецензента к ответу автора изображение 1. Они не включены в текст из-за уже предоставленного значительного объема информации и из-за беспокойства других рецензентов по поводу того, что исследование было недостаточно целенаправленным.

Генный онтологический анализ измененных генных сетей в миссенс-клетках GATA6 LoF и R456G на 8-й день.

Анализ онтологии генов, сравнивающий клетки дикого типа с клетками GATA6 LoF или R456G. Представляющие интерес сети генов с подавленной регуляцией выделены красным. Интересующие интересующие генные сети нейроразвития с усиленной регуляцией выделены синим цветом.Интересующие генные сети EMT с усиленной регуляцией выделены зеленым цветом. Анализ, проведенный с использованием пакета gProfileR в R и загруженный в онлайн-программное обеспечение REVIGO (http://revigo.irb.hr/), для построения графиков 20 лучших условий пути GO по значению p.

2) Рисунок 5: Анализ ATAC-seq также был ограничен HAND2 и SMYD1. Было бы интересно увидеть глобальные изменения ландшафта доступности хроматина среди четырех условий GATA6 с использованием таких инструментов, как chromVAR.

Более широкий анализ данных ATAC-seq представлен на рисунке 6 — приложения к рисунку 1 и 2. Анализ был выполнен с использованием HOMER (анализ пиков и мотивов) и ChIP-Seeker (геномная локализация и аннотация). По нашему мнению, chromVar — это инструмент, который лучше всего подходит для анализа ATAC-seq отдельных ячеек или разреженных данных доступности, что не относится к нашему набору данных.

Поскольку обозреватели не смогли идентифицировать CM в отсутствие Gata6, возможно ли, что в этом контексте Gata6 действует как пионерский фактор? Основываясь на наборе данных ATAC-seq и наборе данных ChIP-seq, связывает ли Gata6 нуклеосомную ДНК?

Спасибо за очень важный комментарий.Как, вероятно, признает рецензент, было продемонстрировано, что другие белки GATA являются пионерскими факторами. Теперь мы провели обширный анализ GATA6 ChIP-seq в WT и мутантных линиях и проанализировали эти данные в контексте данных ATAC-seq и временной экспрессии генов. Мы обнаружили, что в клетках WT GATA6 в первую очередь связывается с закрытым хроматином (нуклеосомной ДНК), поскольку только ~ 10% пиков ChIP-seq перекрываются с данными ATAC-seq. Мы определили временное увеличение экспрессии генов среди 36,4% генов, связанных с закрытым хроматином, связанным с GATA6.Среди этих дифференциально экспрессируемых генов 56% кодируют ключевые факторы транскрипции развития сердца, GATA4, SMYD1, KDR, и TBX5 (см. рис. 5 — приложение 1 к рисунку и дополнительный файл 5). Основываясь на этих данных, мы предполагаем, что GATA6 является первопроходцем в развитии сердца. Более того, мы обнаружили, что функции пионерного фактора GATA6 нарушены в клетках GATA6 -/+ и даже в большей степени в клетках GATA6 R456G/R456G . Эти новые данные включены в рисунки 5-7.

https://doi.org/10.7554/eLife.53278.sa2

Полное эндопротезирование тазобедренного сустава у пациента с многоцентровым карпотарзальным остеолизом: клинический случай.

HSSJ (2016) 12:177–181 DOI 10.1007/s11420-015-9478-0

HSS Journal

®

The Musculoskeletal Journal of Hospital for Special Surgery

ОТЧЕТ О СЛУЧАЯХ

Тотальный эндопротезирование суставов с патологией

Остеолиз: отчет о клиническом случае Кай Сан, доктор медицины, и Брайан Барлоу, доктор медицины, и Фардина Малик, доктор медицины, и Аллан Инглис, доктор медицины, и Марк Фигги, доктор медицины, и Сьюзан Гудман, доктор медицины

Получено: 15 июля 2015 г. / Принято: 16 октября 2015 г. / Опубликовано в Интернете. : 22 января 2016 * Больница специальной хирургии 2016

Ключевые слова мультицентрический запястно-запястный остеолиз.тотальное эндопротезирование тазобедренного сустава. Мутация MAFB. Введение. Синдром многоцентрового запястного остеолиза (MTCO) представляет собой редкое заболевание скелета, характеризующееся остеолизом или резорбцией кости, особенно с поражением костей запястья и предплюсны. Он часто связан с генерализованным остеопорозом, сколиозом и выпячиванием вертлужной впадины, с деструкцией крупных суставов, включая локтевые и тазобедренные, и может быть связан с прогрессирующей почечной недостаточностью [3, 14, 17]. Поскольку его начальное проявление обычно включает боль в суставах и отек, которые могут имитировать симптомы ювенильного идиопатического артрита (ЮИА), у пациентов может быть неправильно диагностирована и назначена противоревматическая терапия, которая не влияет на прогрессирующую деструкцию сустава [17].Это аутосомно-доминантное заболевание связано с миссенс-мутациями в гене MAFB (v-maf musculoaponeurotic fibrosarcoma oncogene ortholog B), фактора транскрипции, который играет важную роль в ремоделировании кости посредством регуляции образования остеокластов [18]. Остеокласты представляют собой многоядерные клетки, образованные путем слияния мононуклеарных предшественников линии моноцитов/макрофагов на поверхности кости или вблизи нее, и они выполняют важную функцию резорбции кости [2]. Одним из цитокинов, необходимых для развития и активации остеокластов, является рецептор-активатор лиганда ядерного фактора kB (RANKL), который экспрессируется на поверхности остеобластов и других клеток и связывается с RANK, трансмембранным рецептором. Операция.Дополнительные электронные материалы Электронная версия этой статьи (doi:10.1007/s11420-015-9478-0) содержит дополнительные материалы, доступные авторизованным пользователям. К. Сан, MD (*): Б. Барлоу, MD: Ф. Малик, MD: А. Инглис, MD: М. Фигги, MD: С. Гудман, MD Больница специальной хирургии, 535 East 70th Street, Нью-Йорк , NY 10021, USA e-mail: [email protected]

на поверхности остеокластов и их предшественников [1, 2]. Обычно MAFB ингибирует образование остеокластов, опосредованное RANKL; однако этот отрицательный контроль теряется при мутациях MAFB, что приводит к усилению остеокластогенеза и резорбции кости [1, 18].Была предложена терапия с использованием анти-RANKL-антитела для лечения MCTO, но ее использование в этих условиях не описано в литературе. С момента первоначального обнаружения мутаций гена MAFB сообщалось о дополнительных случаях, подтвержденных генетическим тестированием [6, 9, 11, 13]. Литература по хирургическому лечению тяжелого остеолиза немногочисленна [4, 9]. Здесь мы сообщаем о случае пациента-подростка с MTCO, перенесшего сложную операцию по замене тазобедренного сустава. История болезни Наш пациент родился в Вэньчжоу, Китай.В возрасте 8 лет у нее появились боли и уменьшение объема движений в запястьях, локтях и плечах, а также сколиоз. В возрасте 12 лет она прошла несколько медицинских и хирургических консультаций в США, и у нее был обнаружен тяжелый грудной сколиоз и тяжелая мальформация Киари I с грыжей, а также проведена декомпрессия и спондилодез позвоночника от T2 до L3. Во время предоперационного обследования у нее была обнаружена легкая дилатация корня аорты и рестриктивный паттерн легочной функции без паренхиматозного заболевания легких.У нее также было умеренное центральное обструктивное апноэ сна, двусторонние почечные кисты и протеинурия нефротического диапазона. На рентгенограммах в возрасте 14 лет выявлены костные деформации различных суставов, в том числе обоих тазобедренных и обоих локтевых суставов. Лучезапястные суставы были сильно поражены и демонстрировали заметную остеопению (рис. 1a–b). Ревматологический осмотр выявил 2+ ANA, низкие титры антикардиолипиновых антител, и был рассмотрен дифференциальный диагноз ЮИА, инфекции или скелетной дисплазии. Позже ее осмотрел генетик, и был поставлен клинический диагноз MCTO.Пациентке и ее родителям было проведено генетическое тестирование на мутацию в гене MAFB, и у пациентки, но не у ее родителей, была обнаружена гетерозиготная мутация c.176C>T, Prot59Leu.

178

HSSJ (2016) 12:177–181

Рентгенограммы и расширенная визуализация правого бедра выявили заметное расширение вертлужной впадины с неконгруэнтной и миниатюрной головкой бедренной кости (рис. 2). Головка бедренной кости смещена проксимально на 30 мм. В дополнение к деформации головки бедренной кости шейка бедренной кости была изящной, а диафизарно-кортикальный диаметр бедренной кости правого бедра составлял примерно 50% от левой стороны.Вертлужная впадина имела выраженную деформацию. Вертлужная впадина расширена, стенки тонкие, склеротические. Линия Колера была нарушена, имелось выпячивание вертлужной впадины. Передне-задний диаметр края вертлужной впадины составил 33 мм по данным аксиальной компьютерной томографии (рис. 3). На рентгенограммах нижних конечностей при измерении от центра головки бедренной кости до середины плафона большеберцовой кости наблюдалось неравенство длины конечностей в 1,8 см. Рис. 1. a–b Рентгенограммы рук, демонстрирующие остеолиз запястья с относительным сохранением пальцев, характерным для многоочагового остеолиза предплюсны запястья (MTCO).

В возрасте 16 лет пациент обратился в комбинированную программу артрита (CAP) с прогрессирующей болью в правом бедре в течение 2 лет и связанным с этим несоответствием длины конечностей. Она ходила в школу и дала интервью через переводчика, поскольку говорила только на мандаринском диалекте. Несмотря на заметную хромоту, вспомогательными средствами она не пользовалась. Ее направили на физиотерапию, которая не облегчила боль в бедре. Из-за известной ассоциации синдрома MCTO с нефропатией использование нестероидной противовоспалительной терапии было ограничено.Ее физический осмотр отличался худощавой женщиной китайского происхождения с низким ростом, она выглядела моложе заявленного возраста и обладала нормальным мышлением. Ее рост составлял 1,41 м, а вес 24,9 кг при ИМТ 12,5. Она передвигалась без каких-либо вспомогательных устройств, и ее походка демонстрировала характер крена приводящей мышцы. Пациент был гибким, но не демонстрировал признаков гиперрастяжения Винна-Дэвиса. При клиническом осмотре у нее было неравенство длины конечностей 4 см. Диапазон движений правого бедра составлял 0–90° сгибания и разгибания без сгибательной контрактуры.Внутренняя ротация правого бедра до 30°, наружная до 60°. Ее пассивное отведение правого бедра было ограничено до 10°, а приведение также было ограничено до 10°. Неповрежденное левое бедро имело нормальный диапазон движений. Она смогла выполнить подъем прямой ноги только на 6 дюймов вне смотрового стола, что сопровождалось болью. У пациента было нормальное нейроваскулярное исследование нижних конечностей. Остальная часть ее физического осмотра выявила гипоплазию средней части лица, экзофтальм, микрогнатию, ограниченный диапазон движений шеи после слияния шейки матки по поводу аномалии Киари и вторичные половые признаки Таннера 1.При осмотре верхней конечности у нее были выявлены врожденный вывих правого локтевого сустава, двустороннее локтевое отклонение запястья, камптодактилия указательного и длинного пальцев правой руки и брахидактилия указательного и мизинца правой руки. Диапазон движений ее правого локтя был сильно ограничен, а руки казались узкими с ограниченными движениями, особенно в проксимальных межфаланговых суставах указательного и длинного пальцев. В семейном анамнезе нет ревматологических заболеваний, метаболических заболеваний костей или других деформаций костей, но ее семейный анамнез имеет большое значение для кровного родства; ее бабушка и дедушка по материнской линии — двоюродные братья.

Хирургическое планирование Для планирования операции использовались предоперационные рентгенограммы (рис. 4). Из-за выраженной деформации определить центр вертлужной впадины было затруднительно. Контралатеральный нормальный центр бедра использовали для определения центра вращения. При осмотре под анестезией выявлено сгибание до 120°, внутренняя ротация до 30° и наружная ротация до 45°, что значительно отличалось от клинического исследования. Для доступа к тазобедренному суставу использовался стандартный задний доступ. Выполнен обширный релиз мягких тканей вокруг края вертлужной впадины.Сустав не удалось безопасно вывихнуть из-за ущемления головки бедренной кости в объемной вертлужной впадине; поэтому был сделан разрез шейки на месте, после чего головка бедренной кости была удалена. Диаметр отверстия вертлужной впадины составил 42 мм, после чего оно раздулось в более крупную полость. Край вертлужной впадины рассверлен до 44 мм. Поскольку нативная головка бедренной кости была слишком мала для заполнения большого дефекта вертлужной впадины, в

был помещен аллотрансплантат головки бедренной кости. бедренная головка.

HSSJ (2016) 12:177–181

Рис. 3. Трехмерная КТ-реконструкция таза и бедренной кости документирует сильное выпячивание вертлужной впадины с заметно расширенной впадиной вертлужной впадины и миниатюрной и деформированной головкой бедренной кости.

пещеристую вертлужную впадину, чтобы вернуть центр тазобедренного сустава почти в нормальное положение. Для удаления хряща из головки бедренной кости и его размера, чтобы он соответствовал входу в вертлужную впадину, использовались ацетабулярные развертки. После того, как головка бедренной кости была подходящего размера, очень тонкую вертлужную впадину осторожно рассверливали, чтобы обнажить губчатую кость.Аллотрансплантат головки бедренной кости

179

затем был помещен в вертлужную впадину. Головку бедренной кости фиксировали двумя губчатыми винтами 4,5 мм; первый был установлен методом отставания от вертлужной впадины в нижнюю головку бедренной кости, а второй антиротационный позиционный винт был помещен от края вертлужной впадины в верхний купол головки бедренной кости аллотрансплантата и в заднюю колонну. Затем аллотрансплантат головки бедренной кости был рассверлен, чтобы сформировать полусферическое костное ложе, в котором импрессировали полусферический бесцементный ацетабулярный компонент Smith and Nephew (Мемфис, Теннесси) R3 с кластерным отверстием.Два винта Smith and Nephew 6,5 мм Reflection были установлены через вертлужный компонент и в переднюю колонну и подвздошную кость соответственно. Затем в чашку помещали прокладку Smith and Nephew 0° XLPE из высокосшитого полиэтилена. Ретракторы вертлужной впадины были удалены, и внимание было обращено на бедренную кость. Поверхность разреза шейки бедренной кости была чрезвычайно мала. Для обработки канала и определения центра бедренной кости использовали 5-мм штифт Steinmann. Бедренная кость была прошита, и в бедро был помещен сверхмалый цементированный, безворотниковый, полированный стержень Smith and Nephew (CPCS), и была выполнена пробная репозиция.Отмечено, что передние мягкие ткани в этом месте чрезмерно натянуты, и было принято решение о выполнении подвертельной укорачивающей остеотомии. Выполняли укорачивающую остеотомию на 2 см с помощью небольшой сагиттальной пилы, чтобы сделать два поперечных разреза, а затем соединительный продольный разрез для разделения промежуточного фрагмента. После продольного расщепления фрагмента остеотомии бедренная кость укорочена. Две половины фрагмента остеотомии закрывали над местом остеотомии и закрепляли 2-миллиметровыми тросами Stryker Dall-Miles.Ножка CPCS была помещена в бедренную кость, и теперь было выполнено еще одно пробное вправление с приемлемым натяжением мягких тканей. Установлен цементный ограничитель, и с использованием современной технологии цементирования канал был запломбирован и герметизирован цементом с осторожностью, чтобы цемент не выдавливался из остеотомии. Сверхмалый стержень CPCS был вставлен с антеверсией 10°. Затем была установлена ​​головка Oxinium™ диаметром 28 мм, +0, и сустав был репонирован. Мягкие ткани были восстановлены, и рана закрылась послойно. Для профилактики венозной тромбоэмболии использовали аспирин.Нагрузка пациента была ограничена в течение 6 недель до появления рентгенологических признаков заживления остеотомии. Пациент выздоровел без осложнений, периоперационных осложнений не было. Когда пациентку осмотрели через 3 месяца после операции, она была отлучена от всех вспомогательных устройств, с отличным диапазоном движений и отсутствием боли. Рентгенограммы через 1 год наблюдения (рис. 5а-б) выявили хорошо зажившую подвертельную остеотомию, включение костного трансплантата вертлужной впадины и стабильные бедренный и вертлужный компоненты с неизмененной цементной мантией.Через 1 год наблюдения у нее было полное облегчение боли и отсутствие нестабильности. Она не пользовалась никакими вспомогательными средствами и ходила, не хромая. Пациентка и ее семья остались очень довольны результатами процедуры. Обсуждение

Рис. 4. Предоперационная переднезадняя рентгенограмма таза.

MCTO представляет собой нарушение прогрессирующей резорбции костей преимущественно, но не исключительно костей запястья и предплюсны, что часто приводит к инвалидизирующим деформациям суставов. Обычно он начинается в раннем детстве с боли в суставах и отека, что может привести к ошибочному диагнозу ЮИА.MCTO может пройти

180

HSSJ (2016) 12:177–181

и стабильная фиксация бедренного и вертлужного компонентов.

спонтанно после полового созревания [14]. Сообщалось, что скелетная травма или хирургическое вмешательство провоцируют остеолиз [15, 16]. Описанные в литературе случаи биопсии синовиальной ткани обычно не показывают признаков воспалительного процесса при относительно нормальной гистологии кости и хряща [7, 8, 11, 16].Несмотря на генетическую однородность, существует значительная клиническая вариабельность, что указывает на возможность еще не идентифицированного гена-модификатора [6, 11]. У пострадавших людей могут быть тонкие черепно-лицевые аномалии, такие как у нашего пациента, и обычно развивается нефропатия, которая может прогрессировать до терминальной стадии почечной недостаточности. Сообщалось, что биопсия почек показала очаговый и сегментарный гломерулосклероз [3, 5, 14]. Наличие мальформации Арнольда-Киари у пациента с мутацией MAFB в MCTO описано еще в одном случае [6].Сообщалось как о наследственных, так и о спорадических случаях MCTO.

Гетерозиготная миссенс-генетическая мутация в одном экзоне гена MAFB была обнаружена как причина MCTO в 2012 году Zankl et al с помощью секвенирования экзома [18]. Коды MAFB для члена семейства факторов транскрипции онкогенов V-MAF мышечно-апоневротической фибросаркомы. Известно, что он играет критическую роль как в дифференцировке и активации остеокластов [10], так и в дифференцировке подоцитов и выживании почечных канальцев [12]. MAFB отрицательно регулирует RANKL-индуцированный остеокластогенез, и, следовательно, снижение экспрессии MAFB усиливает остеокластогенез, приводя к резорбции костей, а RANKL дополнительно снижает экспрессию MAFB [10, 13].В отчетах о клинических случаях не было показано, что бисфосфонаты останавливают прогрессирование остеолиза, но, по-видимому, замедляют прогрессирование и способствуют лучшей минерализации соседних костей [17]. С момента разработки деносумаба, терапии антителами против RANKL

HSSJ (2016) 12:177–181

, его использование при этом состоянии было выдвинуто гипотезой, но в литературе о нем не сообщалось. Таким образом, хирурги-ортопеды или ревматологи могут быть первыми, кто распознает MCTO у пациента с болью в суставах или деформацией.Распознавание типичного остеолиза на рентгенограммах при отрицательном ревматологическом обследовании и раннее направление к клиническому генетику являются ключом к своевременной постановке диагноза. Возможности медикаментозной терапии ограничены; тем не менее, при периоперационном ведении этих пациентов необходимо признать и учитывать необходимость надлежащего скрининга и мониторинга сопутствующих заболеваний, особенно почечной недостаточности. Хирургические вмешательства сложны из-за измененной анатомии, но часто необходимы для восстановления функции, что подчеркивает необходимость соответствующего направления на хирургическую помощь.Нашему пациенту было проведено тотальное эндопротезирование правого тазобедренного сустава, и ранние последующие визиты продемонстрировали успешное заживление без осложнений, включение костного трансплантата и отсутствие признаков повышенного остеолиза.

Соблюдение этических норм Конфликт интересов: Кай Сан, доктор медицины, Брайан Барлоу, доктор медицины, Фардина Малик, доктор медицины, Аллан Инглис, доктор медицины, Марк Фигги, доктор медицины и Сьюзан Гудман, доктор медицины, заявили об отсутствии конфликта интересов. Права человека/животных: Все последующие процедуры соответствовали этическим стандартам ответственного комитета по экспериментам на людях (институциональным и национальным) и Хельсинкской декларации 1975 г., пересмотренной в 2008 г. (5).Информированное согласие: все пациенты отказались от информированного согласия на включение в исследование.

181

5.

5.

6.

7.

8. 9.

10. 11.

12.

13.

14.

Требуется авторские формы раскрытия информации, предоставленные авторами доступны с онлайн-версией этой статьи. 15.

Ссылки 1. Boyce BF, Xing L. Путь RANKL/RANK/OPG. Curr Osteoporos Rep. 2007; 5(3): 98-104.2. Бойл В.Дж., Симонет В.С., Лейси Д.Л. Дифференцировка и активация остеокластов. Природа. 2003 г.; 423 (6937): 337-342. doi:10.1038/натура01658. 3. Кармайкл К.Д., Лауникитис Р.А., Калия А. Ортопедические и почечные проявления идиопатического остеолиза предплюсны запястья. J Pediatr Orthop B. 2007; 16(6): 451-454. doi: 10.1097/BPB.0b013e3282e1c667. 4. Халидис Б.Е., Димитриу К.Г. Интеркалярная костная пластика для реконструкции остеолиза фаланги в исчезающей кости

16. 17.

18.

болезнь: клинический случай.J Hand Surg. 2008 г.; 33(10): 1873-1877. doi:10.1016/j.jhsa.2008.07.005. Коннор А., Хайтон Дж., Хунг Н.А. и соавт. Многоцентровый запястно-тарзальный остеолиз с нефропатией, успешно леченный циклоспорином А: отчет о клиническом случае и обзор литературы. Am J почек Dis. 2007 г.; 50(4): 649-654. doi:10.1053/j.ajkd.2007.06.014. Дворшак Г.К., Драакен М., Хильгер А. и соавт. Неполностью проникающий новый вариант MAFB (p.Ser56Phe) при синдроме аутосомно-доминантного многоцентрового запястного остеолиза. Int J Mol Med. 2013; 32(1): 174-178.doi: 10.3892/ijmm.2013.1373. Faber MR, Verlaak R, Fiselier TJ, et al. Наследственный многоочаговый остеолиз с запястно-тарзальной локализацией, имитирующий ювенильный идиопатический артрит. Eur J Педиатр. 2004 г.; 163(10): 612-618. doi: 10.1007/s00431-004-1502-1. Глюк Дж., Миллер Дж. Дж. 3-й. Семейный остеолиз костей запястья и предплюсны. J Педиатр. 1972 год; 81(3): 506-510. Гольдфарб К.А., Штеффен Дж.А., Уайт М.П. Идиопатический многоочаговый остеолиз: проявления верхних конечностей и хирургические соображения в детском возрасте.J Hand Surg. 2012 г.; 37(8): 1677-1683. doi:10.1016/j.jhsa.2012.05.001. Ким К., Ким Дж. Х., Ли Дж. и др. MafB негативно регулирует RANKL-опосредованную дифференцировку остеокластов. Кровь. 2007 г.; 109(8): 32533259. doi:10.1182/blood-2006-09-048249. Mehawej C, Courcet JB, Baujat G, et al. Идентификация мутаций MAFB у восьми пациентов с многоцентровым запястно-тарзальным остеолизом подтверждает генетическую гомогенность, но клиническую изменчивость. Am J Med Genet A. 2013; 161А(12): 3023-3029. doi:10.1002/ajmg.a.36151. Моригути Т., Хамада М., Морито Н. и др.MafB необходим для развития почек и экспрессии F4/80 в макрофагах. Мол Селл Биол. 2006 г.; 26(15): 5715-5727. doi:10.1128/MCB.00001-06. Мумм С., Хаски М., Дуан С. и др. Синдром многоцентрового запястного остеолиза вызывается лишь несколькими домен-специфичными мутациями в MAFB, негативном регуляторе RANKL-индуцированного остеокластогенеза. Am J Med Genet A. 2014; 164A(9): 22872293. doi:10.1002/ajmg.a.36641. Muyshondt I, Later L, Van Roost G, Maes B. Остеолиз, вызванный AV-фистулой, при идиопатическом карпотарзальном остеолизе.Трансплантация нефролового циферблата. 2003 г.; 18(10): 2185-2188. doi:10.1093/ndt/gfg331. Урлус М., Роосен П., Ламменс Дж. и др. Запястно-тарзальный остеолиз. Клинический случай и обзор литературы. Жене Каунс. 1993 год; 4(1): 25-36. Vichi GF, Falcini F, Pierattelli M, Jenuso R, Ceruso M. Отчет о клиническом случае 401: идиопатический запястно-тарзальный остеолиз (ICTO), связанный с нефропатией. Скелет Радиол. 1986 год; 15(8): 665-671. Венкерт Д., Мамм С., Виганд С.М., Макалистер В.Х., Уайт М.П. Отсутствие мутации MMP2 при идиопатическом многоцентровом остеолизе с нефропатией.Clin Orthop Relat Relat Res. 2007 г.; 462: 80-86. дои: 10.1097/BLO.0b013e3180d09db8. Занкл А., Дункан Э.Л., Лео П.Дж. и др. Многоцентровый карпотарзальный остеолиз вызывается кластеризацией мутаций в аминотерминальном домене активации транскрипции MAFB. Am J Hum Genet. 2012 г.; 90(3): 494-501. doi:10.1016/j.ajhg.2012.01.003.

Введение

Введение

Врожденный порок сердца (ВПС) является распространенным врожденным пороком развития, который угрожает жизни и здоровью новорожденных и является причиной самой высокой частоты врожденных дефектов у детей раннего возраста [1].Кроме того, этиология чрезвычайно сложна. Считается, что в возникновении ИБС участвуют генетические факторы и факторы окружающей среды. Развитие сердца представляет собой сложный процесс, контролируемый несколькими семействами факторов транскрипции, такими как фактор энхансера миоцитов-2 (MEF2), GATA, Tbx, Nkx2 и Hand, которые связывают гены и сигнальные пути для регуляции экспрессии миокардиальных генов, роста мышц и сосудов. и морфогенез [2]. Кроме того, к врожденным порокам сердца могут приводить различные молекулярные нарушения факторов, регулирующих спецификацию и дифференцировочный потенциал кардиомиоцитов, таких как механические силы, BRG1-SWI/SNF и SDF1/CXCR4 [3–5].

Цинк — важный микроэлемент в клетках, участвующий в синтезе и регуляции активности различных металлоферментов, таких как факторы транскрипции, алкогольдегидрогеназа, медно-цинковая супероксиддисмутаза, карбоангидраза, РНК-полимераза. Следовательно, цинк участвует в регуляции транскрипции генов, трансляции белков и поддержании стабильности структур органелл [6]. В США физиологическая потребность в цинке у беременных увеличилась, и рекомендуется дополнительно 2–4 мг цинка в день по сравнению с небеременными женщинами [7].Недавние исследования показали, что дефицит цинка во время беременности может вызывать пороки развития эмбрионального сердца [8]. У крыс тяжелый материнский дефицит Zn был связан с повышенным риском аномалий сердца плода, которые, как предполагалось, приводили к распределению Cx43 и HNK-1 в сердце плода [9]. Даффи и др. создали модель дефицита цинка, кормя крыс диетой с дефицитом цинка во время беременности, и обнаружили, что дефицит цинка вызывает аномальные изменения в морфологии кардиомиоцитов, такие как отсутствие безымянной артерии, тонкая стенка желудочка и дефекты межжелудочковой перегородки [10].Кроме того, важную роль в развитии миокарда играет металлофермент Zn Adamts [11–13]. Однако неблагоприятные эффекты дефицита цинка на развитие сердца плода и их механизмы не выяснены.

SUMOylation представляет собой динамическую обратимую посттрансляционную модификацию, которая изменяет конформацию, локализацию и стабильность целевого белка и участвует в регуляции клеточного цикла, транскрипции генов, ремоделировании хроматина, поддержании и дифференцировке стволовых клеток, восстановлении повреждений ДНК. и биосинтеза рибозы [14].В последнее десятилетие сообщалось, что SUMOylation играет важную роль в регуляции и контроле клеточных функций, включая дифференцировку и процессы развития [15, 16]. SENPs играют важную роль в поддержании динамического баланса модификации SUMO и обеспечении нормальных физиологических функций клеток и организмов [17]. Исследования подтвердили, что SENP играют важную роль в эмбриональном развитии [18, 19] и что нокаут SUMO2 или SENP2 вызывает эмбриональную летальность [20–22].Кроме того, сообщалось, что несколько факторов транскрипции, связанных с развитием сердца, участвуют в развитии сердца и дифференцировке кардиомиоцитов путем конъюгации SUMO с такими мишенями, как GATA4, Nkx2.5 и Islet-1 [23, 24]. Выявление этих механизмов станет основой для понимания динамики конкретных врожденных пороков сердца и разработки методов лечения плода, постнатальных пороков сердца и сердечной недостаточности.

Таким образом, мы исследовали пространственно-временные изменения SUMO1 и SENP во время развития сердца и исследовали связь SENP и дефицита цинка, вызывающих аномальное развитие миокарда.

Материалы и методы Модель животных и план эксперимента

Эксперименты на мышах проводились в соответствии с правилами и рекомендациями, утвержденными Комитетом по этике животных Пятой центральной больницы Тяньцзиня (Тяньцзинь, Китай, TJWZX2018064). Исследования на животных проводились в соответствии с «Руководством по уходу и использованию лабораторных животных» (8-е издание, 2011 г.) и руководством по отчетности об исследованиях на животных в экспериментах in vivo (ПРЕДСТАВЛЕНИЕ) (Дополнительный цифровой контент 1, контрольный список, https://www.nc3rs.org.uk/arrive-guidelines). Двух самок и одного самца мышей в каждой клетке кормили при контролируемой температуре от 22 до 26°C и стабильной влажности от 40% до 60% при 12-часовом цикле свет/темнота и обеспечивали достаточным количеством пищи и воды. Мышей дважды в день проверяли на наличие вагинальной пробки, и день обнаружения пробки определяли как эмбриональный день (Е) 0,5. Беременные самки мышей получали диету с дефицитом цинка (2,78 мг/кг цинка; ZnD) в качестве группы с дефицитом цинка или стандартную диету (29.83 мг/кг цинка; ZnA) в качестве контрольной группы с первого дня беременности. Беременных мышей анестезировали пентобарбиталом натрия (50 мг/кг, внутрибрюшинно), затем плоды извлекали путем кесарева сечения на E10.5–E19.5 и умерщвляли путем декапитации для получения ткани сердца. В конце экспериментов мышей казнили путем вывиха шейных позвонков. Новорожденных мышей умерщвляли путем смещения шейных позвонков с последующей стернотомией. Легкие собирали и помещали для дальнейшего исследования в постнатальный день с 1 по 7 и 14 (с P1 по P14).

Культивирование hiPSCs и индукция hiPSC-CMs

Вновь созданные hiPSC культивировали в определенных условиях культивирования без ксеногенов на матрице базальной мембраны PSCease hiPSC, нанесенной на культуральные планшеты в полной среде PSCease hiPSC (0,7 мл добавок, смешанных с 50 мл основной среды), которая меняли ежедневно во время процедуры и непосредственно накрывали стерильными покровными стеклами. Клетки инкубировали при 37°С с 5% СО 2 и пересевали каждые 3–4 дня с 0,25% триптазы и 0,02% ЭДТА.Раствор ЭДТА удаляли и к клеткам добавляли среду PSCeasy iPSC (2 мл на лунку) с последующим диспергированием клеток. Для индукции кардиомиоцитов hiPSC субкультивировали в покрытых витронектином 6-луночных планшетах, а затем повторно высевали на витронектин в полной среде PSCeasy iPSC и культивировали до слияния 80–90%. Затем клетки культивировали в среде I для дифференцировки кардиомиоцитов человека CadioEasy с заменой среды на среду II для дифференцировки кардиомиоцитов человека CadioEasy через 2 дня.Затем через 4 дня среду заменяли средой CadioEasy для дифференцировки кардиомиоцитов человека III, которую меняли каждые 2 дня. Тщательное наблюдение за ростом клеток, запись очевидных изменений морфологии клеток и колебания кардиомиоцитов проводились ежедневно, чтобы подтвердить индукцию hiPSC-CM. Чтобы исследовать влияние дефицита цинка, в среду добавляли TPEN [N,N,N’,N’-тетракис-(2-пиридилметил)этилендиамин] в концентрации 10 мкМ на 2 часа. TPEN представляет собой аминохелатор переходных металлов, вызывающий истощение запасов цинка.При слиянии 80–90% каждую группу клеток трансфицировали малой интерферирующей РНК SENP5 (siSENP5), которая специфически сбивает ген SENP5 и ингибирует экспрессию SENP5 in vivo и in vitro. Клетки были разделены на группы контроль, TPEN, контроль+siSENP5 и TPEN+siSENP5.

РНК-интерференция

Малые интерферирующие РНК (миРНК) олигонуклеотиды были синтезированы компанией Sigma (Sigma, Inc, США). Последовательности были следующими: миРНК отрицательного контроля: 5′-UUCUCCGACCGUGUC ACGUTT-3′; миРНК SENP5: SENP5-1, 5′-TGCTGTTGACAGTGAGGCGACCAGTTTACTTGGAATAGACAGTAGTGAAGCCACAGATGTA-3′; SENP5-2, 5′-GCAGGTGAAGCATTTCCAGTGTAATA AGG-3′; SENP5-3, 5′-CTGGAGCAGACAA ATCTGTGAGTAGTGTA-3′.SiРНК трансфицировали в клетки с использованием Lipofectamine 3000 (Invitrogen, Carlsbad, CA) в соответствии с протоколом производителя. Клетки инкубировали при 37°С в течение 48 часов.

Иммунофлюоресценция

HiPSC-CM фиксировали 4% параформальдегидом в течение 30 мин при комнатной температуре. Затем добавляли 0,2% Triton X-100 при комнатной температуре в течение 10 минут, а затем 10% овечьей сыворотки при комнатной температуре в течение 30 минут. Овечью сыворотку аккуратно смывали и клетки инкубировали с первичными антителами (анти-cTnT, 1:200, ab8295; Abcam, Cambridge, MA, и анти-cTnI, 1:200, ab47003; Abcam), разведенными PBS в соответствующую пропорцию при 4°C в течение ночи.Клетки трижды промывали PBST, а затем инкубировали со вторичным антителом, разведенным в PBS, в течение 1 ч при 37°C. Изображения были получены под флуоресцентным микроскопом.

Набор для подсчета клеток-8 (CCK8) анализ

Суспензию кардиомиоцитов высевали в 96-луночный планшет по 2500 клеток на лунку и инкубировали при 37°C с 5% CO 2 и при насыщенной влажности. Через 24 ч среду удаляли и добавляли различные концентрации TPEN на 30 мин при 37°С. Затем в каждую лунку добавляли по 10 мкл рабочего раствора CCK8 и инкубировали клетки еще 2 часа.Величину ОП измеряли при 450 нм с помощью устройства для считывания микропланшетов.

Проточная цитометрия

Клетки собирали (1–5×10 6 клеток/мл), центрифугировали при 800 g в течение 5 мин, однократно промывали PBS, затем фиксировали в холодном 4% параформальдегиде при 4°C в течение 1–2 ч. . После центрифугирования супернатант удаляли, а осадок клеток ресуспендировали в PBS в течение 5 мин. Клетки однократно фильтровали через сито 400 мкм, центрифугировали при 800 g в течение 5 мин и отбрасывали PBS. Аннексин V и PI добавляли в темноте в течение 30 мин при 4°C.Длина волны возбуждения составляла 488 нм, а длина волны излучения составляла >630 нм.

Вестерн-блоттинг

Равные количества белков подвергали электрофорезу на гелях SDS-PAGE, а затем переносили на мембрану PVDF. Мембраны зондировали в течение ночи при 4°С со следующими первичными антителами (все от Abcam): Sox2 (1:1000, ab97959), cTnI (1:2000, ab47003), SENP1 (1:1000, ab108981), SENP2 (1:1000, ab108981), SENP2 (1:1000, ab97959). 1000, ab131637), SENP3 (1:1000, ab71677), SENP5 (1:1000, ab58420), SENP6 (1:1000, ab77619), SENP7 (1:200, ab224752), GAPDH (1:1000, ab8245), Bcl-2 (1:1000, ab692) и каспаза-3 (1:1000, ab2302).Связывание первичных антител детектировали вторичными антителами и визуализировали методом усиленной хемилюминесценции.

Гистологический и иммуногистохимический анализ Было отобрано

полных и чистых срезов сердца, залитых парафином. Срезы депарафинировали ксилолом и обрабатывали градиентом спирта. Затем срезы, залитые парафином, помещали в 0,01 М цитратный буфер и автоклавировали для выделения антигена. По каплям добавляли блокатор эндогенной пероксидазы (реагент А) с последующей инкубацией при комнатной температуре в течение 10 мин в темноте для инактивации активности эндогенной пероксидазы.По каплям добавляли козью сыворотку и оставляли стоять при комнатной температуре на 30 мин. Затем по каплям добавляли первичное антитело с последующей инкубацией в течение ночи при 4°С. Первичные антитела (все от Abcam) против SENP1 (1:200; ab108981), SENP2 (1:200; ab58418), SENP3 (1:100; ab71677), SENP5 (1:200; ab58420) и SENP7 (1:200) ; ab224752). Затем срезы инкубировали с полимером, меченным пероксидазой хрена (реагент Б), в течение 30 мин при 37°С. Проявление цвета DAB применяли в течение 3–5 минут, и срезы наблюдали под микроскопом до тех пор, пока срез не приобретал карамельный цвет.Окрашивание ядра гематоксилином проводили в течение 4 мин с последующей обработкой 1%-ным спиртом соляной кислоты, насыщенным карбонатом лития, спиртом и ксилолом в указанном порядке. Наконец, на срезы наносили подходящее количество нейтральной смолы, которые затем покрывали покровным стеклом. Фотографии получены под микроскопом OLYMPUS.

Статистический анализ

Статистический анализ выполняли как среднее ± стандартное отклонение с использованием программного обеспечения GraphPad Prism 6.0 (GraphPad Software, Inc.). Все экспериментальные данные были случайным образом распределены по разным экспериментальным группам (n≥3).Значимые различия анализировали с помощью одностороннего дисперсионного анализа с последующим тестом Тьюки. P <0,05 считался статистически значимым.

Результаты. Характеристики пространственно-временного распределения SUMO1 во время развития плода мыши

. Для изучения роли SUMOylation в развитии сердца были собраны образцы сердца эмбриона мыши E10.5–19.5, и уровень конъюгации SUMO1 был определен с помощью IHC. Результаты показали, что уровень SUMO1-модифицированного белка снижался во время эмбрионального развития сердца (рис. 1А).Разница была статистически значимой (P<0,05; рис. 1C). Сердце мыши сохраняет определенную способность к дифференцировке в течение 7 дней после рождения, которая затем исчезает [25, 26]. Вестерн-блот-анализ был проведен для определения переменного уровня конъюгации SUMO1 у новорожденных мышей на постнатальный день (P) 1–7. Как показано на фиг. 1B и 1D, наблюдались свободный SUMO1 и более высокая мигрирующая полоса, указывающая на SUMO1-конъюгирующие белки. Количественный анализ конъюгирующих белков SUMO1 постепенно снижался от P1 до P7 (P<0.05), в то время как свободный SUMO1 демонстрировал видимое прогрессирующее увеличение. Результаты показывают, что SUMOилирование и деСУМОилирование поддерживались в динамическом равновесии, а уровни SUMOилированных белков постепенно снижались по мере созревания миокарда и роста сердца.

10.1371/journal.pone.0242606.g001Рис. 1 Характеристики пространственно-временного распределения SUMO1-модифицированных белков во время развития плода мыши.

(A) Иммуногистохимия SUMO1-модифицированных белков из E10.от 5 до E19.5 (n = 4). (B) Вестерн-блоттинг SUMO1-модифицированных белков и свободного SUMO1 от P1 до P7 (n = 6). (C) Количественный анализ SUMO1-модифицированных белков в (A) с помощью программного обеспечения ImageJ. Данные представлены как среднее значение ± стандартное отклонение. Значительное изменение наблюдалось на E10.5. * P <0,05 по сравнению с E10,5. (D) Количественный анализ экспрессии конъюгированного белка SUMO1 в (B). Снижение конъюгированных белков SUMO1 определяли количественно на P1-P7. Статистическую значимость конъюгированного белка SUMO1 на Р7 анализировали с помощью теста Тьюки.Значения представлены как среднее значение ± SD.* P <0,05 по сравнению с P1.

Характеристики пространственно-временного распределения членов семейства SENP во время развития новорожденных мышей

Чтобы определить, какой фермент де-SUMOylation был тесно связан с миокардиальными SUMO1-конъюгированными белками, IHC исследовала роль членов семейства SENP в развитии сердца. Белок SENP1 уменьшился на E13.5, увеличился на E15.5 до E19.5 и, наконец, показал самый высокий уровень на E17.5. По сравнению с E10.5 уровень экспрессии SENP2 был снижен на E13.5, и увеличился на Е15,5 до Е19,5, в то время как уровень экспрессии SENP3 был неблагоприятным. Уровень экспрессии белка SENP7 снижался, а белков SENP5 увеличивался во время развития сердца (рис. 2А и 2В). Затем мы использовали ImageJ для анализа и программное обеспечение GraphPad Prism 6.0 для количественной оценки результатов иммуногистохимии (рис. 2C и 2D). У эмбрионов мышей на стадии E10.5–E19.5, по сравнению с другими членами семейства SENP, экспрессия белка SENP5 была значительно увеличена и постепенно возрастала на протяжении всего процесса роста сердца (P<0.05). Кроме того, мы собрали образцы сердца у новорожденных мышей на стадиях развития P1-P7 и определили экспрессию SENP в сердце с помощью вестерн-блоттинга. SENP5 был высоко экспрессирован на P1, а затем постепенно увеличивался. По сравнению с другими членами семейства SENP экспрессия SENP5 была значительно снижена (P<0,05; рис. 3A–3C). Кроме того, уровень белка SENP5 демонстрировал относительную тенденцию к конъюгации SUMO1. Эти результаты еще раз подтверждают, что SENP5 может играть важную роль в развитии сердца.

10.1371/journal.pone.0242606.g002Рис. 2 Характеристики пространственно-временного распределения членов семейства SENP во время развития плода мыши.

(A) Иммуногистохимия экспрессии семейств SENP от E10.5 до E19.5 (n = 4). (B) Увеличение (A) (n = 4). (C) Относительные уровни экспрессии SENP были количественно определены от E10.5 до E19.5. (D) Уровни экспрессии SENP5. Статистическую значимость анализировали с использованием t-критерия. Значения представлены как среднее значение ± стандартное отклонение. Статистическую значимость анализировали с помощью теста Тьюки.* P <0,05 по сравнению с E10,5.

10.1371/journal.pone.0242606.g003Рис. 3 Характеристики пространственно-временного распределения членов семейства SENP в процессе развития новорожденных мышей.

(A) Вестерн-блоттинг экспрессии белков SENP1, SENP2, SENP3, SENP5 и SENP7 от P1 до P7 (n = 6). (B) Количественный анализ экспрессии белка SENP в (A). Значения представлены как среднее значение ± стандартное отклонение. Статистическую значимость анализировали с помощью теста Тьюки. * P <0,05 по сравнению с P1. (C) Экспрессия белка SENP5 от P1 до P7.Значения представлены как среднее значение ± стандартное отклонение. Статистическую значимость анализировали с помощью теста Тьюки. * P <0,05 по сравнению с P1.

Дефицит цинка вызывает повышение уровня SENP5

С 1-го дня беременности до родов мыши-матери получали диету с дефицитом цинка (2,78 мг/кг цинка; ZnD) в качестве группы с дефицитом цинка или стандартную диету (29,83 мг/кг цинка; ; ZnA) в качестве контрольной группы. Экспрессия белка SENP5 значительно снижается у эмбрионов мышей на стадии E10.5–E19.5 [27]. Таким образом, эмбриональная ткань сердца была получена из двух разных групп для изучения характеристик пространственно-временного распределения белка SUMOylation и SENP5 с помощью IHC.По сравнению с группой ZnA развитие эмбрионального сердца мышей было задержано, толщина как стенки желудочка, так и межжелудочковой перегородки была уменьшена. Между тем, мы наблюдали гистологическую аномалию миокарда в группе с дефицитом цинка. Результаты ИГХ показали, что экспрессия SENP5 увеличивалась, тогда как модифицированные белки SUMO1 снижались при дефиците цинка (рис. 4). Эти результаты подразумевают, что дефицит цинка вызывает сердечную дисплазию, которая может быть связана со сверхэкспрессией белка SENP5.

10.1371/journal.pone.0242606.g004Рис. 4 Различия в развитии миокарда и характеристиках белков, модифицированных SENP5 и SUMO1, между группами с дефицитом цинка и контрольными группами во время развития плода мышей. Показаны окрашивание

HE и иммуногистохимия белков SENP5 и SUMO1-модифицированных на E15.5 в группах с дефицитом цинка и в контрольной группе (n = 3).

Дефицит цинка влияет на апоптоз, жизнеспособность и дифференцировку hiPSC-CMs in vitro

Индуцированные человеком плюрипотентные стволовые клетки (hiPSC) были впервые установлены Takahashi et al., которые ввели лентивирусный вектор экспрессии, несущий набор факторов транскрипции (Oct4, Sox2, Nanog и LIN28) в фибробласты взрослого человека [28]. Были получены HhiPSC-CM, дифференцированные из hiPSC, и было установлено, что они иммунопозитивны в отношении биомаркеров кардиомиоцитов, таких как сердечный тропонин I (cTnI) и сердечный тропонин T (cTnT). Чтобы оценить роль SENP5 в аномальном развитии миокарда, вызванном дефицитом цинка in vitro, hiPSC-CMs с селективным хелатором цинка TPEN оценивали, а экспрессию белка SENP5 сначала исследовали с помощью вестерн-блоттинга.Как показано на рис. 5, TPEN значительно индуцировал увеличение SENP5 и снижение ковалентного связывания SUMO1 с белками-мишенями в hiPSC-CMs (P <0,05). Кроме того, чтобы подтвердить влияние дефицита цинка на кардиомиоциты, было исследовано влияние TPEN на жизнеспособность, апоптоз и дифференцировку hiPSCs и hiPSC-CMs. Как показано на рис. 6А, после добавления 5, 10 или 20 мкМ TPEN в течение 2 часов жизнеспособность клеток снижалась, особенно снижение более чем на 40% при 10 мкМ (P <0,05). Кроме того, результаты проточной цитометрии показали, что большинство hiPSC-CM находились в апоптотическом состоянии при дефиците цинка (рис. 6B).При дефиците цинка уровни экспрессии cTnT были значительно снижены, в то время как уровни индекса стволовых клеток, Sox2 и Oct4, были повышены в hiPSC-CMs (P <0,05; рис. 6C и 6D). Эти результаты показали, что дефицит цинка индуцирует апоптоз клеток, снижает их жизнеспособность и ингибирует способность hiPSC к дифференцировке в hiPSC-CM.

10.1371/journal.pone.0242606.g005Рис. 5 Экспрессия SUMOилированного белка и белка SENP5 в hiPSC-CM с дефицитом цинка.

(A) Вестерн-блоттинг, показывающий экспрессию SUMO1-конъюгированного белка и SENP5 в нормальных и дефицитных по цинку hiPSC-CM (n = 6).(B) Обобщенные данные об экспрессии белка SENP5 в нормальных и дефицитных по цинку hiPSC-CM. Значения представлены как среднее значение ± стандартное отклонение. Статистическая значимость была проанализирована с использованием критерия Тьюки. * P <0,05 по сравнению с контролем. (C) Суммированные данные о SUMOилированных белках. Значения представлены как среднее значение ± стандартное отклонение. Статистическую значимость анализировали с помощью теста Тьюки. * P <0,05 по сравнению с контролем.

10.1371/journal.pone.0242606.g006Рис. 6 Дефицит цинка влияет на апоптоз, активность и дифференцировку hiPSC-CM.

(А) Жизнеспособность клеток. По сравнению с контролем, TPEN (5, 10 и 20 мкМ) значительно снижал жизнеспособность hiPSC-CM. Значения представлены как среднее значение ± стандартное отклонение. Статистическую значимость анализировали с помощью теста Тьюки. * P <0,05 по сравнению с контролем (n = 6). (B) Проточный цитометрический анализ апоптотического состояния. По сравнению с контролем селективный хелатор цинка TPEN (10 мкМ, 2 ч) значительно увеличивал апоптоз hiPSC-CMs (n = 3). (C) Вестерн-блоттинг экспрессии белков Sox2, Oct4 и cTnT. В состоянии дефицита цинка уровни экспрессии TnT были снижены в hiPSC-CMs, в то время как уровень экспрессии маркера стволовых клеток Sox2 и Oct4 был повышен (n = 6).(D) Суммированные данные (C). Значения представлены как среднее значение ± стандартное отклонение. Статистическая значимость была проанализирована с использованием критерия Тьюки. * P <0,05 по сравнению с контролем.

Нокдаун SENP5 противодействует эффекту TPEN на апоптоз и дифференцировку hiPSC-CM

. Согласно предыдущим результатам, дефицит цинка вызывает повышенную экспрессию SENP5. Используя малую интерферирующую РНК SENP5 (siSENP5), которая ингибирует экспрессию SENP5 в hiPSC-CM, было дополнительно исследовано влияние SENP5 на аномалии, вызванные отсутствием цинка in vitro.Вестерн-блоттинг показал, что TPEN индуцировал повышение уровня расщепленной каспазы-3, а белки каспазы-3 и Bcl-2 снижались, в то время как в среде TPEN+siSENP5 наблюдались противоположные эффекты с умершей расщепленной каспазой-3 и повышенным уровнем каспаза-3 и Bcl-2. В сочетании с результатами проточной цитометрии отсутствие цинка усиливало апоптоз и снижало жизнеспособность hiPSC-CM, которая восстанавливалась с помощью siSENP5 (P <0,05; рис. 7A–7C). Точно так же дефицит цинка вызывал увеличение белков индекса дифференцировки, Sox2 и Oct4, и снижение уровня экспрессии cTnT.Уровни Sox2, Oct4 и cTnT не изменились при удалении SENP5 (P <0,05; рис. 7D и 7E). Эти результаты также предполагают, что сверхэкспрессия SENP5 играет важную роль в дефиците цинка, вызывающем аномальную дифференцировку кардиомиоцитов и сердечную дисплазию.

10.1371/journal.pone.0242606.g007Рис. 7 Нокдаун SENP5 противодействует влиянию TPEN на апоптоз и вызывает аномальную дифференцировку hiPSCs.

(A) Проточный цитометрический анализ апоптотического состояния (n = 3).(B) Вестерн-блот анализ уровней каспазы-3, активной каспазы-3 и Bcl-2 в клетках-предшественниках сердца. Жизнеспособность hiPSC-CM с siSENP5 была немного выше по сравнению с hiPSC-CM с дефицитом цинка (n = 6). (C) CCK8 анализ жизнеспособности клеток. TPEN (10 мкМ) значительно снижал жизнеспособность hiPSC-CM, что было отменено siSENP5 (n = 6). * P <0,05 по сравнению с контролем; # P <0,05 по сравнению с TPEN. (D) Вестерн-блоттинг Sox2, Oct4 и cTnT, экспрессия белка. В состоянии дефицита цинка уровни экспрессии cTnT были снижены в hiPSC-CM, в то время как уровень экспрессии маркеров стволовых клеток Sox2 и Oct4 был повышен, что было аннулировано siSENP5.(E) Суммированные данные (B). Значения представлены как среднее значение ± стандартное отклонение. Статистическую значимость анализировали с помощью теста Тьюки. * P <0,05 по сравнению с контролем; # P <0,05 по сравнению с TPEN.

Обсуждение

Во время эмбриогенеза мышей ранний морфогенез сердца можно разделить на четыре основные стадии, сходные с развитием человеческого сердца. Ранний морфогенез сердца у мышей можно разделить на четыре основные стадии: период полулуния сердца (Е7.5), период линейной сердечной трубки (Е8.0), период петлеобразного сердца (Е9.0) и период формирования камеры (E10.5). После E10.5 сердце вступает в стадию быстрой клеточной пролиферации, миграции и дифференцировки, тем самым активизируя желудочковые и трабекулярные структуры. Одновременно начинают формироваться ядро ​​и камерная перегородка, которые делят ядро ​​на четыре камеры [29]. Следовательно, мышей-плодов на стадиях E10.5–E19.5 можно использовать для исследования связи между SUMOylation и развитием сердца.

Развитие сердца — сложный процесс, регулируемый множеством генов и сигнальных путей.Важность SUMOylation также подчеркивается наблюдением сердечных аномалий. Нокдаун SUMO1 у мышей приводит к дефектам межпредсердной и межжелудочковой перегородки [30]. SUMO-1 может предотвратить негативные эффекты активности SERCA2a, вызванные гипертрофированным и несостоятельным миокардом [31]. Исследование подтвердило влияние SUMO1 на развитие сердца. В этом исследовании было установлено, что свободный SUMO1 и конъюгированный SUMO1 по-разному экспрессируются во время развития сердца у эмбрионов и новорожденных мышей. Экспрессия конъюгированного SUMO1 постепенно снижалась на протяжении всего процесса развития сердца, в то время как уровень свободного SUMO1 увеличивался.Также было подтверждено, что уровень экспрессии белка SENP5 снижался во время развития сердца. Это указывает на то, что SENP5 потенциально может быть связан с деконъюгацией SUMO1 для поддержания динамического баланса SUMOylation и deSUMOylation и играть важную роль в развитии сердца. Предыдущие исследования показали, что способность миокарда к дифференцировке постепенно снижается в процессе развития. Это указывает на то, что SENP5 может быть связан с жизнеспособностью и дифференцировкой миокарда.Дальнейшие исследования будут проводиться в следующих экспериментах.

Цинк необходим для нормального роста и развития эмбрионов и плодов [32–36]. Беременные крысы с тяжелым дефицитом цинка могут привести к аборту, мертворождению или порокам сердца плода [8], что позволяет предположить, что цинк играет роль в регуляции развития миокарда. По сравнению с нормальными мышами недостаток цинка вызывал задержку развития сердца, а толщина как стенки желудочка, так и межжелудочковой перегородки уменьшалась.HiPSCs широко используются в различных областях сердечно-сосудистых исследований и являются некоторыми эффективными методологиями индуцированной человеком плюрипотентной стволовой клетки (hiPSCs) сердечной дифференцировки для выяснения механизмов кардиомиогенеза [37]. Это было исследовано путем культивирования hiPSCs для изучения влияния дефицита цинка на жизнеспособность и дифференцировку кардиомиоцитов. Мы продемонстрировали, что дефицит цинка значительно увеличивает количество апоптотических hiPSC-CM и уровень экспрессии белков Sox2 и Oct4, одновременно снижая уровни экспрессии белка cTnT в hiPSC-CM.Эти результаты свидетельствуют о том, что дефицит цинка вызывает аномальную дифференцировку hiPSC и апоптоз hiPSC-CM. Хотя количество цинка, безусловно, важно и находится под динамическим временным контролем, не совсем понятно, как цинк влияет на развитие миокарда.

Существует несколько механизмов, посредством которых цинк регулирует развитие миокарда. Дефицит цинка во время беременности приводит к окислительному стрессу в организме, который изменяет характер гибели бластных клеток сердечного нервного гребня, которые должны развиваться в сердце.Количество клеток уменьшается, что приводит к аномальному развитию эмбрионального сердца. Исследования показали, что SUMOylation противостоит окислительному стрессу [38], в то время как семейство SENP претерпевает изменения в субклеточном распределении во время окислительного стресса [39]. Наше исследование показало, что дефицит цинка вызывает снижение уровня SUMO1 и повышение уровня SENP5. Влияние дефицита цинка и связь с SENP5 были исследованы дополнительно. Было установлено, что сверхэкспрессия SENP5 наблюдается в состоянии дефицита цинка, а де-СУМОилирование усиливается, что приводит к аномальной дифференцировке hiPSC и усилению апоптоза hiPSC-CM.Предполагается, что SENP5 может играть существенную роль в действии цинка. Чтобы дополнительно обнаружить конкретное действие SENP5 при дефиците цинка, клетки с дефицитом SENP5 были созданы путем обработки siSENP5. Хотя в клетках отсутствовал цинк, аномальной дифференцировки hiPSC и апоптоза hiPSC-CM при подавлении SENP5 не было обнаружено. Это позволяет предположить, что сверхэкспрессия SENP5, усиленная дефицитом цинка, вызывает аномальное развитие клеток миокарда.

В этом исследовании был выяснен частичный механизм сердечной дисплазии, вызванной дефицитом цинка. SENP5 регулирует деконъюгацию SUMO1 во время развития сердца. Дефицит цинка индуцирует аномальную дифференцировку hiPSC, увеличивает клеточный апоптоз и снижает жизнеспособность hiPSC-CM, индуцируя сверхэкспрессию SENP5, что вызывает аномалии миокарда. Таким образом, это исследование может предложить новую стратегию профилактики и лечения клинической ИБС.

%PDF-1.4 % 4 0 объект > эндообъект 5 0 объект >поток конечный поток эндообъект 6 0 объект >поток x+

Несуицидальные членовредительства: снижение риска в будущем

Др.Ширли Сзе 7 ноября 2011 г.

Доктор Ширли Сзе (биография и раскрытие информации)

Что я делал до

В области несуицидального самоповреждения у меня было мало знаний, чтобы классифицировать или эффективно справляться с этим типом поведения при контактах с пациентами. Часто таких пациентов называли пограничными расстройствами личности, и с этим конкретным диагнозом для них, как правило, не было вариантов лечения. Пациенты, которые демонстрируют этот тип поведения, часто имели повторяющиеся проявления самоповреждения, которые вызывали у меня как у семейного врача неприятные чувства из-за пробелов в понимании и знаниях об этом состоянии.Это непонимание такого типа поведения позволяло мне лечить этих пациентов, только проявляя сочувствие и залечивая их раны.

Что изменило мою практику

У нас была презентация доктора Лин Макбит, одного из наших местных психиатров по этой теме, которая улучшила мои знания об этом состоянии, особенно с точки зрения пациента. Теперь я осознаю присущий этой группе высокий риск успешного самоубийства (10%) и необходимость относиться к несуицидальным самоповреждениям со всей серьезностью, которой они заслуживают.Доктор Макбит предоставил клиницистам рекомендации по работе с пациентами, которые обращаются с несуицидальными самоповреждениями, а также раздаточные материалы для пациентов. Они прилагаются.

Чем я сейчас занимаюсь

Я, безусловно, больше осведомлен о повышенном риске самоубийства у этих пациентов и хотел бы задать вопрос о суицидальных наклонностях и провести оценку психического здоровья, соответствующее лечение и направление к специалистам по психическому здоровью +/- наркологии.

Я также лучше понимаю, что у многих из этих пациентов есть проблемы с вербальным выражением некоторых очень трудных чувств, и что часто они очень умны и артистичны, и помощь им в поиске способов эффективного вербального общения может в конечном итоге помочь им в их воздержание от самоповреждения.

Написать ответ

Ваш адрес email не будет опубликован.