Если вы не помните свой пароль, вы можете сбросить его, введя свой адрес электронной почты и нажав кнопку «Сбросить пароль». Затем вы получите электронное письмо, содержащее безопасную ссылку для сброса пароля

. Если адрес совпадает с действующей учетной записью, на адрес __email__ будет отправлено электронное письмо с инструкциями по сбросу пароля

Механизмы физиологического ремоделирования тканей у животных: манипулирование тканями, органами и морфологией организмов

Основные моменты

•

Физиологическое ремоделирование тканей имеет решающее значение для установления и поддержания формы, структуры и функции тканей в различных таксонах.

•

Изменения во внеклеточных (ECM) и последующих клеточных ответах работают согласованно, управляя ремоделированием тканей.

•

Консервированные регуляторные механизмы у животных способствуют ремоделированию тканей в ответ на широкий диапазон индуктивных сигналов.

•

Физиологическое ремоделирование тканей у эмбриональных, ювенильных и взрослых животных замедлено, чтобы вызвать системные или дискретные изменения.

Реферат

Ремоделирование ткани в широком смысле определяется как реорганизация или восстановление существующих тканей.Процессы ремоделирования тканей отвечают за управление развитием и поддержанием тканей, органов и общей морфологии организма. Следовательно, изучение регуляторных и механистических аспектов ремоделирования тканей позволяет расшифровать, как структура и функция ткани управляются у животных. Таким образом, исследования, направленные на изучение естественной реорганизации тканей у животных модельных организмов, имеют большой потенциал для продвижения медицинских методов лечения в сочетании с тканевой инженерией и регенеративной медициной.Здесь мы обсуждаем молекулярные и клеточные механизмы, ответственные за события ремоделирования тканей, которые происходят у животных нескольких типов. Примечательно, что в этом обзоре подчеркиваются молекулярные и клеточные механизмы, участвующие в эмбриональных и постнатальных физиологических событиях ремоделирования тканей, от метаморфоза до ремоделирования кости во время функциональной адаптации.

Ключевые слова

Ремоделирование ткани

Физиологическое ремоделирование

Морфология

Ремоделирование эмбриона

Постэмбриональное ремоделирование

Метаморфоз

Рекомендуемые статьи Цитирующие статьи (Abstract 0)

Рекомендуемые статьи

Ссылки на статьи

Зондирование, реструктуризация и инвазия эндотелиальных клеток в гидрогелевые структуры коллагена | Интегративная биология

Мы отметили, что круглые структуры более благоприятны для клеточной адгезии и в некоторых случаях круглые структуры вызывают инвазию клеток быстрее, чем острые.Эти результаты подчеркивают способность эндотелиальных клеток воспринимать небольшие вариации геометрии ВКМ и отвечать балансом инвазии матрикса, а также деформации, с потенциальными последствиями для механизмов обратной связи, которые могут усиливать сосудистые аномалии в ответ на изменения ВКМ, вызванные опухолью.

Понимание, инновации, интеграция

Экспериментальные инструменты для моделирования взаимодействий клетки и ткани, вероятно, приведут к новым способам понимания и лечения рака. В то время как механические свойства и регуляция инвазии были недавно изучены для опухолевых клеток, им уделялось меньше внимания в контексте сосудистой динамики опухоли.В этой статье исследуется взаимодействие эндотелиальных клеток со структурами внеклеточного матрикса, обнаруженными в кровеносных сосудах. Мы использовали микротехнологию для создания таких структур в гидрогелях коллагена и продемонстрировали новое клеточное восприятие, ремоделирование и вторжение в окружающие ткани, от нормальных до опухолевых. Кроме того, в этом отчете обсуждается роль острых изогнутых структур по сравнению с , механические силы и локальные вариации геометрии в мягких и жестких структурах в стимулировании проникновения клеток.

^5–8 Однако недавние данные свидетельствуют о том, что механические сигналы, вероятно, играют не менее важную роль в нескольких аспектах прогрессирования опухоли.

Механические сигналы, такие как плотность матрицы, размер пор и толщина волокна, регулируют поведение многих клеток. Плотный матрикс из волокнистого коллагена указывает на высокий риск метастазирования рака груди. ^{9 , 10} Маленькие поры обеспечивают прикрепление клеток и более быструю, но ограниченную подвижность клеток, тогда как большие поры лучше подходят для подвижности клеток на большие расстояния. ^{11 , 12} Кроме того, роль жесткости матрицы и размера пор ранее изучалась независимо. Было показано, что уменьшение размера ограничения путем уменьшения ширины канала для данной жесткости ECM увеличивает миграцию клеток, в то время как увеличение жесткости ECM увеличивает миграцию клеток за счет того же эффекта ограничения. ¹³ Однако независимые эффекты сложно отделить, и точная роль более сложных аспектов структурной микросреды ECM остается неясной.

Что касается топографии субстрата, исследования показали, что скорость и направление миграции клеток зависят от кривизны поверхности. ¹⁴ Геометрические ориентиры играют роль в определении положения новых участков ветвления из уже существующих эпителиальных клеток молочной железы ¹⁵ и инвазия опухолевых клеток была исследована с разных позиций внутри протоков молочной железы; ⁴ , однако, связь с сосудистыми сетями опухоли, которые характеризуются сложными ветвящимися структурами, не была четко продемонстрирована.Более того, диаметры кровеносных сосудов в окружающей среде опухоли неравномерны и резко и ненормально различаются по размеру по сравнению с диаметрами кровеносных сосудов в здоровых сосудах. ¹⁶ В нашей предыдущей работе мы наблюдали, что локальные сигналы ECM в определенных контекстах могут перекрывать более традиционные химические факторы инвазии эндотелиальных клеток (EC), однако анализ механизмов остается проблемой из-за ограниченной способности контролировать топографию ECM представлен в клетки. ¹⁷ Кроме того, механизм, с помощью которого индекс кривизны, который представляет топографию базальной мембраны кровеносных сосудов, влияет на инвазию ЭК, изучался редко.

Традиционные методы изучения взаимодействий ЭК-ткань включают посев клеток внутри или поверх каркасов, сделанных из природных гидрогелей ВКМ (, например, , матригель, коллаген, фибронектин) или синтетических полимерных каркасов (, например, поли (молочнокислых) co -гликолевая кислота) (PLGA) или полиэтиленгликоль (PEG)). ^{18 , 19} Эти платформы обычно не содержат сложных градиентов или гетерогенности, которые необходимы для регулирования соответствующих клеточных фенотипов, таких как миграция или инвазия.Хотя исследования in vivo и обеспечивают более высокую степень физиологической значимости, динамические эксперименты являются сложной задачей. Кроме того, обычно модели in vivo предоставляют корреляции, а не причинную информацию относительно роли микросреды в регулировании динамики инвазии из-за неспособности определить или настроить ключевые параметры микросреды в живых системах. Микрожидкостные модели кровеносных сосудов могут обеспечить высокую степень физиологической значимости, а также потенциал для динамических, причинно-следственных исследований.Они были разработаны с использованием литографических нисходящих или жертвенных методов для определения шаблонных каналов, покрытых ЭК, как биомиметических сосудов; однако эти исследования были в основном сосредоточены на простых конструкциях, включая прямоугольную геометрию и прямые сосуды. ^20–23

В этой статье мы исследовали влияние различных микромасштабных топографий, сформированных в гидрогелях коллагена, на миграцию ЭК и образование капилляров. Мы изготовили набор острых и круглых структур, которые имитируют геометрию кровеносных сосудов, таких как трубки и участки разветвления, с широким диапазоном жесткости, чтобы моделировать ткани с различными механическими свойствами. Наш подход в полной мере использует возможность управления с высокой точностью топологической микросредой тканей. Кроме того, мы охарактеризовали процесс инвазии клеток, измерив среднюю длину отростка и частоту инвазии. Наконец, мы исследовали взаимодействие клетки-ECM ECs с острыми и круглыми структурами, обнаружив новую двунаправленную регуляцию между микроструктурой ECM и инвазией EC. Такая технология позволит определить in vitro и с беспрецедентным пространственным разрешением трехмерной геометрии ткани, которая имитирует сложные структуры, обнаруженные in vivo .Эти платформы позволят детально изучить взаимодействия между механическими и химическими сигналами в опухолевых процессах, таких как ангиогенез и метастазирование, а также влияние противораковых препаратов на эти процессы в физиологически значимом контексте.

42″> Коллагеновый гидрогель

45″> Препарат коллагенового гидрогеля

Коллагеновый гидрогель был изготовлен в конечных концентрациях 5,7.5 и 10 мг / мл ^-1 из исходных растворов 7,5, 11,25 и 15 мг / мл ^-1 соответственно. Согласно ряду публикаций, этот диапазон концентраций гидрогеля коллагена охватывает механическую жесткость, включая как нормальные, так и опухолевые ткани. ^25–27 Раствор коллагена и разбавляющая среда, состоящая из среды Игла, модифицированной Дульбекко (DMEM) 10 × (0,1 × конечный объем нейтрализованного коллагена), NaOH (объем коллагена × 0,02) и DMEM 1 × (столько, сколько необходимо для отрегулировать конечную желаемую массовую долю коллагена) были отдельно приготовлены на льду.Среду для разбавления пипеткой вносили в раствор коллагена и осторожно перемешивали небольшим стерилизованным шпателем, чтобы избежать образования пузырьков. Как только раствор коллагена был нейтрализован, что примерно определялось по цвету фенолового красного красителя в среде и подтверждено pH-бумагой, его наносили на покровное стекло с полидиметилсилоксановыми подложками (ПДМС) сбоку и наносили на поверхность. Штамп PDMS, который запечатлел микроструктуры в гидрогеле. Сначала нейтрализованные растворы коллагена предварительно инкубировали при 4 ° C для облегчения сборки молекул волокон, а затем инкубировали при 37 ° C для сшивания волокон.Все оборудование и аксессуары, включая штамп PDMS, хранили на льду до предварительной инкубации, чтобы предотвратить сшивание незрелого коллагена. По мере увеличения плотности коллагеновых волокон время предварительной инкубации также увеличивалось, чтобы обеспечить достаточно времени для молекулярной сборки волокон. ^{28 , 29} Мы предварительно инкубировали 5 мг / мл раствора коллагена ^-1 в течение 1 часа и оба раствора коллагена по 7,5 мг / мл ^-1 и 10 мг / мл ^-1 растворов коллагена в течение 3 часов.

¹⁷ Клеточную среду и факторы роста меняли каждые 48 ч в течение эксперимента.5 мг / мл. ^-1 гидрогелевые устройства фиксировали через 48 ч после добавления факторов роста (VEGF и TPA). На этот раз для устройств с гидрогелем 7,5 мг / мл ^-1 и 10 мг / мл ^-1 было увеличено до 72 часов.

51″> Изготовление гидрогелевой структуры

Структуры были впервые изготовлены из кремния с использованием метода глубокого реактивного ионного травления (DRIE) (AMS 100, Франция), как мы ранее опубликовали. ³⁰ С помощью мягкой литографии были изготовлены штампы PDMS с негативной репликой структур.Марки обрабатывали кислородной плазмой (Harrick-Plasma, NY, USA) и покрывали 1% бычьим сывороточным альбумином (BSA) в течение 30 мин при комнатной температуре и хранили на льду в стерильных условиях в шкафу биобезопасности. Это делает поверхность PDMS неадгезивной к гидрогелю коллагена. Нейтрализованные растворы коллагена с конечными концентрациями 5 мг / мл ^-1 , 7,5 мг / мл ^-1 и 10 мг / мл ^-1 готовили из концентрированных исходных растворов коллагена и хранили в отдельных микропробирках на льду.BSA из штампов PDMS был аспирирован и заменен каплей нейтрализованного коллагена ~ 50 мкл. Поскольку растворы коллагена на 7,5 мг / мл ^-1 и 10 мг / мл ^-1 являются очень вязкими, когда капли коллагена выливаются на структуры PDMS, между структурами PDMS и гидрогелем коллагена могут образовываться пузырьки. Чтобы удалить эти потенциальные пузырьки из структур и капель гидрогеля, устройства с гидрогелем на 7,5 мг / мл ^-1 и 10 мг / мл ^-1 помещали в химический стакан, наполненный льдом.Стаканы закрывали перфорированным парафильмом и помещали под домашний вакуум примерно на 2 мин. Затем нейтрализованный раствор коллагена наносили пипеткой на покровное стекло с двумя полосками подложки PDMS с обеих сторон, чтобы удерживать раствор коллагена, и штампы PDMS со структурами отливали против раствора коллагена.

Поскольку клетки лежали на боковой стенке микроканала, вышеупомянутые параметры можно было просто измерить, поскольку они были отображены сверху с помощью инвертированного оптического микроскопа.

57″> Результаты

В таблице 1 представлены размеры, индекс кривизны и угол наклона изготовленных конструкций. Топография a содержит круглые (Ra) и острые (Sa) структуры размером x = 100 мкм и y = 50 мкм. Топография b содержит круглые (Rb) и острые (Sb) структуры размером x = 100 мкм и y = 125 мкм, а топография c содержит круглые (Rc) и острые (Sc) структуры с x = 100 мкм и y = 250 мкм.Расстояние между соседними структурами на всех топографиях составляет 150 мкм. Каждое устройство содержит пять топографий из каждого набора круглых и острых структур, состыкованных вдоль микроканала шириной 500 мкм и глубиной 95 мкм (рис. 2a – c).

Рис. 1

Ориентация засеянных ячеек и размеры изготовленных структур на острых (а) и криволинейных (б) структурах.

Рис. 1

Ориентация засеянных ячеек и размеры изготовленных структур на острых (а) и криволинейных (б) структурах.

Таблица 1

Размеры готовых конструкций, а также показатели кривизны и остроты круглых и острых конструкций

		a (мкм)	2 b (мкм)	Осевое отношение ( a / b )	Угол ( θ ) / индекс кривизны (CI)
Топография a	Sharp a (Sa)	100	50	4	θ 9034 9034
	Круглый a (Ra)				C.I. min = 0,0025, max = 0,16
Топография b	Sharp b (Sb)		125	1,6	θ = 65 °
	Круглый b (Rb)				C.I. min = 0,0062, max = 0,025
Топография c	Sharp c (Sc)		250	0,8	θ = 100 °
	Круглый c (Rc)	C. I. min = 0,0064, max = 0,0125

		a (мкм)	2 b (мкм)	Осевое соотношение ( a / b )	Угол ( θ ) ) / индекс кривизны (C.I.)
Топография a	Sharp a (Sa)	100	50	4	θ = 28 °
	Круглый a (Ra)				C.I. min = 0,0025, max = 0,16
Топография b	Sharp b (Sb)		125	1,6	θ = 65 °
	Круглый b (Rb)				C.I. min = 0,0062, max = 0,025
Топография c	Sharp c (Sc)		250	0.8	θ = 100 °
	Круглый c (Rc)	C.I. min = 0,0064, max = 0,0125

Таблица 1

Размеры готовых конструкций, а также показатели кривизны и остроты круглых и острых конструкций

		a (мкм)	2 b (мкм )	Осевое отношение ( a / b )	Угол ( θ ) / индекс кривизны (CI)
Топография a	Sharp a (Sa)	100	50 4		θ = 28 °
	Круглый a (Ra)				C.I. min = 0,0025, max = 0,16
Топография b	Sharp b (Sb)		125	1,6	θ = 65 °
	Круглый b (Rb)				C.I. min = 0,0062, max = 0,025
Топография c	Sharp c (Sc)		«> 250	0,8	θ = 100 °
	Круглый c (Rc)	C.I. min = 0,0064, max = 0,0125

		a (мкм)	2 b (мкм)	Осевое соотношение ( a / b )	Угол ( θ ) ) / индекс кривизны (C.I.)
Топография a	Sharp a (Sa)	100	50	4	θ = 28 °
	Круглый a (Ra)				C.I. min = 0,0025, max = 0,16
Топография b	Sharp b (Sb)		125	1,6	θ = 65 °
	Круглый b (Rb)				C.I. min = 0,0062, max = 0,025
Топография c	Sharp c (Sc)		250	0.8	θ = 100 °
	Круглый c (Rc)	C.I. мин = 0,0064, макс = 0,0125

Рис. 2

Микрофотографии изготовленных структур в 7,5 мг / мл гидрогеля коллагена ^-1 для структур (а) Sa и Ra, (б) Sb и Rb и (в) Sc и Rc, а также конфокальные изображения ориентация коллагеновых волокон вокруг Sb для (d) 5 мг / мл ^-1 , (e) 7,5 мг / мл ^-1 и (f) 10 мг / мл ^-1 гидрогелевых устройств, использующих линзу объектива 25x, и в увеличенном масштабе коллагеновые волокна (г) 5 мг мл ^-1 , (з) 7.5 мг / мл ^-1 и (i) 10 мг / мл ^-1 гидрогелевых устройств. Масштабная линейка: 150 мкм для (a – c) и 50 мкм для (d – f). Размер кадра прибл. 70 мкм × 70 мкм для (г – я).

Рис. 2

Микрофотографии изготовленных структур в 7,5 мг / мл гидрогеля коллагена ^-1 для структур (а) Sa и Ra, (б) Sb и Rb и (в) Sc и Rc, а также конфокальные изображения ориентация коллагеновых волокон вокруг Sb для (d) 5 мг / мл ^-1 , (e) 7,5 мг / мл ^-1 и (f) 10 мг / мл ^-1 гидрогелевых устройств с использованием линзы объектива 25x, и в увеличенном масштабе коллагеновые волокна (г) 5 мг. мл ^-1 , (h) 7.5 мг / мл ^-1 и (i) 10 мг / мл ^-1 гидрогелевых устройств. Масштабная линейка: 150 мкм для (a – c) и 50 мкм для (d – f). Размер кадра прибл. 70 мкм × 70 мкм для (г – я).

Кроме того, в таблице 2 показаны условия полимеризации гидрогелевых устройств с различными концентрациями, а также глубина микроканала гидрогеля и производительность изготовления. Глубину канала гидрогеля рассчитывали путем посева флуоресцентных микрошариков на гидрогелевые устройства и измерения разницы между точкой фокусировки микробусин наверху и внизу микроканалов с помощью инвертированного микроскопа (Axio Observer.Z1, Carl-Zeiss, Германия). Для экспериментов по посеву клеток мы использовали топографии гидрогеля коллагена, показатели кривизны и резкости которых были в пределах 10% от показателей кремниевого шаблона. Как показано в таблице 1, выход для концентрации 5 мг / мл ^-1 составлял 70%, в то время как выходы для 7,5 мг / мл ^-1 и 10 мг / мл ^-1 были более 90%.

Таблица 2

Сводка параметров изготовления и условий изготовления гидрогелевых структур различной жесткости. Выход был определен как процент гидрогелевых устройств, изготовленных с точностью передачи рисунка 90% от исходных кремниевых структур

	5 мг / мл -1	7.5 мг мл -1	10 мг мл -1
Обработка плесени	Без обработки	В вакууме	В вакууме
Полимеризация
Предварительная инкубация	4 ° C в течение 1 часа	4 ° C в течение 3 часов	4 ° C в течение 3 часов
Инкубация	37 ° C в течение 1 часа	37 ° C в течение 1 часа	37 ° C для 1 час
z (глубина) = (измерено D , SD)	67.7 мкм, 6,8 мкм	71,7 мкм, 3,9 мкм	68,8 мкм, 3,1 мкм
Выход (в пределах 10%)	~ 70%	~ 90%	~ 90%

5 мг мл ^-1 7,5 мг мл ^-1 10 мг мл ^-1 Обработка плесени Без обработки Под вакуумом Под вакуумом Полимеризация Предварительная инкубация 4 ° C в течение 1 часа 4 ° C в течение 3 часов 4 ° C в течение 3 часов Инкубация в течение 1 часа 37 ° C в течение 1 часа 37 ° C в течение 1 часа z (глубина) = (измерено D , SD) 67. 7 мкм, 6,8 мкм 71,7 мкм, 3,9 мкм 68,8 мкм, 3,1 мкм Выход (в пределах 10%) ~ 70% ~ 90% ~ 90% Таблица 2

Сводка параметров и условий изготовления гидрогелевых структур различной жесткости. Выход был определен как процент гидрогелевых устройств, изготовленных с точностью передачи рисунка 90% от исходных кремниевых структур

	5 мг / мл -1	7.5 мг мл -1	10 мг мл -1
Обработка плесени	Без обработки	В вакууме	В вакууме
Полимеризация
Предварительная инкубация	4 ° C в течение 1 часа	4 ° C в течение 3 часов	4 ° C в течение 3 часов
Инкубация	37 ° C в течение 1 часа	37 ° C в течение 1 часа	37 ° C для 1 час
z (глубина) = (измерено D , SD)	67.7 мкм, 6,8 мкм	71,7 мкм, 3,9 мкм	68,8 мкм, 3,1 мкм
Выход (в пределах 10%)	~ 70%	~ 90%	~ 90%

5 мг мл ^-1 7,5 мг мл ^-1 10 мг мл ^-1 Обработка плесени Без обработки Под вакуумом Под вакуумом Полимеризация Предварительная инкубация 4 ° C в течение 1 часа 4 ° C в течение 3 часов 4 ° C в течение 3 часов Инкубация в течение 1 часа 37 ° C в течение 1 часа 37 ° C в течение 1 часа z (глубина) = (измерено D , SD) 67.7 мкм, 6,8 мкм 71,7 мкм, 3,9 мкм 68,8 мкм, 3,1 мкм Выход (в пределах 10%) ~ 70% ~ 90% ~ 90%9 Чувствительность клеток и ремоделирование коллагенового гидрогеля

На рис. 3 показаны конфокальные изображения структур Sa, Sc, Ra и Rc с развитыми нео-сосудами от верхушки структур. Отметим, что на всех четырех изображениях новообразования формировались из областей с более высокими показателями кривизны или резкости.Эти параметры были выбраны таким образом, чтобы клетки воспринимали структуры с широким диапазоном резкости (от плоских поверхностей до острых углов) и кривизны (полуэллиптические структуры с различными индексами кривизны). На рис. 4а и б показаны микрофотографии структуры Sa сразу после изготовления и через 3 дня после изготовления без присутствия клеток. Конструкции не показали никаких признаков деградации. На рис. 4с представлена ​​микрофотография тех же структур с посевом клеток через 3 дня (1 день после добавления фактора роста).Прикрепление клетки к клетке начало деформировать стыки и стороны структур. Более подробно на рис. 4d – f показано это явление, отображаемое с помощью конфокальной микроскопии. Эти изображения показывают структуры Sa, Sb и Sc (волокна коллагена показаны красным цветом) через 1 день после добавления факторов роста в клеточную среду с наложенными изображениями структур гидрогеля до культивирования клеток (волокна коллагена показаны белым). Как показывают изображения, ECM был деформирован с торцевых сторон, что привело к увеличению плотности коллагеновых волокон в этих местах (насыщенный красный цвет).Структуры с наивысшими показателями резкости и кривизны подверглись большему изменению структур с микрорельефом коллагена (показаны зелеными стрелками).

Рис. 3

Конфокальные изображения клеточной инвазии через структуры гидрогеля коллагена для (a) Sa, (b) Sc, (c) Ra и (d) Rc. [Красный: волокна коллагена, синий: ядра и зеленый: VE-кадгерин]. Масштабная линейка: 50 мкм.

Рис. 3

Конфокальные изображения клеточной инвазии через структуры гидрогеля коллагена для (a) Sa, (b) Sc, (c) Ra и (d) Rc.[Красный: волокна коллагена, синий: ядра и зеленый: VE-кадгерин]. Масштабная линейка: 50 мкм.

Рис. 4

Микрофотография 7,5 мг мл ^-1 коллагеновых гидрогелевых структур (а) после изготовления, (б) через 3 дня после изготовления, (в) через 3 дня после посева клеток (1 день после добавления факторов роста) . Конфокальные изображения деформации структур гидрогеля силами клеточно-клеточного натяжения на краю структуры для (г) Sa, (д) ​​Sb и (е) Sc. [Красный: волокна коллагена после посева клеток, белый: волокна коллагена до посева клеток, синий: ядра и зеленый: актин].Масштабная линейка: 50 мкм.

Рис. 4

Микрофотография 7,5 мг мл ^-1 коллагеновых гидрогелевых структур (а) после изготовления, (б) через 3 дня после изготовления, (в) через 3 дня после посева клеток (1 день после добавления факторов роста) ). Конфокальные изображения деформации структур гидрогеля силами клеточно-клеточного натяжения на краю структуры для (г) Sa, (д) ​​Sb и (е) Sc. [Красный: волокна коллагена после посева клеток, белый: волокна коллагена до посева клеток, синий: ядра и зеленый: актин].Масштабная линейка: 50 мкм.

Например, в устройствах с гидрогелем на 5 мг / мл ^-1 мы не обнаружили какой-либо существенной разницы между Sa и Ra, но частота инвазии (Sa и Ra) была значительно выше по сравнению с (Sb и Rb).Для устройств на 5 мг / мл ^-1 (6 устройств; 30 образцов для каждой структуры) мы наблюдали, что частота инвазии клеток была значительно выше для топографии a по сравнению с топографией b и c (рис. 5a). Для устройств 7,5 мг / мл ^-1 (4 устройства; 20 структур из каждого) через 2 дня частота клеточной инвазии была значительно выше для топографии a по сравнению с топографией b и топографией c (рис. 5b), а через 3 дня, Частота инвазии клеток оставалась значительно выше для топографии a по сравнению с топографией b, но не с топографией c (рис.5д). Для устройств 10 мг / мл ^-1 (5 устройств; 25 структур из каждого) частота клеточной инвазии была значительно выше для топографии a по сравнению с топографией c (рис. 5f), но не топографией b. Длина проникновения для устройств 5 мг / мл ^-1 и 7,5 мг / мл ^-1 не привела к каким-либо значительным различиям между различными структурами (рис. 5c, d и g), однако эти различия были значительными при 10 мг / мл ^-1 , при этом более широкие структуры приводят к более длительным вторжениям (рис.5ч). Кроме того, можно наблюдать, что длина инвазии клеток для соответствующих структур выше для более мягких гидрогелевых устройств, когда они были измерены в тот же момент времени (, например, , 5 мг / мл ^-1 и 7,5 мг / мл ^-1 устройств через 2 дня и 7,5 мг мл ^-1 и 10 мг мл ^-1 устройств через 3 дня) (рис. 5c, d, g и h). Как уже было показано, более мягкие гидрогелевые субстраты приводят к увеличению инвазии ЭК, ^{25 , 31 , 32} мы сосредоточим следующие результаты и разделы анализа на проникновении ЭК от 5 мг / мл ^{— 1} устройств исправлено через 2 дня и 7. 5 мг мл ^-1 и 10 мг мл ^-1 устройства фиксируются через 3 дня. Когда мы сравнивали частоту или продолжительность вторжений, мы делали это с использованием тех же временных точек. На фиг.6 представлена ​​микрофотография структур гидрогеля коллагена с HUVEC при конечных концентрациях 5 мг / мл ^-1 , 7,5 мг / мл ^-1 и 10 мг / мл ^-1 . Каждое изображение включает в себя увеличенную врезку, которая показывает интересующую структуру вместе с новыми ростками.

Рис.5

График частоты клеточной инвазии, измеренной через 2 дня для структур Sa, Sb, Sc, Ra, Rb и Rc для (а) 5 мг / мл ^-1 , (б) 7,5 мг / мл ^-1 , и продолжительность клеточной инвазии за тот же период времени и структуры для (c) 5 мг / мл ^-1 , (d) 7,5 мг / мл ^-1 , и частота инвазии клеток, измеренная через 3 дня для (e) 7,5 мг / мл ^-1 (f) 10 мг мл ^-1 гидрогелевых устройств и продолжительность клеточной инвазии за тот же период времени для (g) 7.5 мг мл ^-1 (ч) 10 мг мл ^-1 гидрогелевые устройства. (*** p <0,001, ** p <0,01 и * p <0,05).

Рис. 5

График частоты клеточной инвазии, измеренной через 2 дня для структур Sa, Sb, Sc, Ra, Rb и Rc для (а) 5 мг мл ^-1 , (б) 7,5 мг мл ^-1 , и продолжительность клеточной инвазии за тот же период времени и структуры для (c) 5 мг / мл ^-1 , (d) 7,5 мг / мл ^-1 , и частота инвазии клеток, измеренная через 3 дня для (e) 7.5 мг мл ^-1 (f) 10 мг мл ^-1 гидрогелевые устройства и длина инвазии клеток за тот же период времени для (г) 7,5 мг мл ^-1 (ч) 10 мг мл ^-1 гидрогелевые аппараты. (*** p <0,001, ** p <0,01 и * p <0,05).

Рис. 6

Микрофотографии инвазии клеток из структур Sa, Sb, Sc, Ra, Rb и Rc. для (i) 5 мг мл ^-1 гидрогелевых устройств, фиксируется 48 ч (ii) 7. 5 мг мл ^-1 гидрогелевых устройств, фиксированных 72 часа, и (iii) 10 мг мл ^-1 гидрогелевых устройств, фиксированных через 72 часа после добавления факторов роста. В большинстве случаев инвазия клеток развивается из-за острого или изогнутого кончика структур. Масштабная линейка: 100 мкм.

Рис. 6

Микрофотографии инвазии клеток из структур Sa, Sb, Sc, Ra, Rb и Rc. для (i) 5 мг мл ^-1 гидрогелевых устройств, фиксированных 48 часов (ii) 7,5 мг мл ^-1 гидрогелевых устройств, фиксированных 72 часа и (iii) 10 мг мл ^-1 гидрогелевых устройств, фиксированных 72 часа после добавления факторов роста.В большинстве случаев инвазия клеток развивается из-за острого или изогнутого кончика структур. Масштабная линейка: 100 мкм.

образуется после добавления факторов роста. Как показано на графике на рис. 7e (iii), при таком анализе круглые структуры (Ra) образовывали более длинные нео-сосуды, чем острые структуры (Sa), со статистически значимой разницей ( p <0.01).

Рис.7

Конфокальные изображения прикрепления клеток на круглых и острых структурах на 7,5 мг мл ^-1 устройства из гидрогеля для структур (а) Sa, (б) Sc, (в) Ra и (г) Rc 24 ч после культивирования клеток. Шкала: 50 мкм, (e) (i) длина инвазии и (ii) частота для Sa и Ra, и (iii) частота инвазии для Sa и Ra для длины инвазии ниже и выше средней. [Красный: коллагеновые волокна, синий: ядра и зеленый: актиновые нити].

Фиг.7

Конфокальные изображения прикрепления клеток к круглым и острым структурам на 7,5 мг мл ^-1 устройства с гидрогелем для структур (a) Sa, (b) Sc, (c) Ra и (d) Rc через 24 ч после культивирования клеток . Шкала: 50 мкм, (e) (i) длина инвазии и (ii) частота для Sa и Ra, и (iii) частота инвазии для Sa и Ra для длины инвазии ниже и выше средней. [Красный: коллагеновые волокна, синий: ядра и зеленый: актиновые нити].

Для структур Sa, Ra, Sc и Rc мы приняли радиус желтых кружков с центром на вершине структур, которые представляют подобласти с высокими показателями кривизны / резкости, равными 40 мкм, 40 мкм, 50 мкм, и 70 мкм. За пределами этих субрегионов мы посчитали, что вторжение было инициировано из субрегионов с более низким индексом кривизны / резкости. Рис. 8a – d (ii) показывают круговые диаграммы распределения новых сосудов по различным подобластям изогнутых и острых структур для 5 мг мл ^-1 , 7.5 мг / мл ^-1 и 10 мг / мл ^-1 гидрогелевых устройств для Sa, Ra, Sc и Rc соответственно. На рис. 5a, b, e и f показано, что топография a (Sa и Ra), которая включает структуры с наивысшим индексом кривизны / резкости, дает больше новых сосудов по сравнению с другими топографиями. Здесь, внутри той же структурной группы, показано, что инвазия клеток наблюдается больше из более острых субрегионов или субрегионов с более высоким индексом кривизны. Как видно на рис. 8a (ii) и b (ii), на структурах Sa и Sc большинство нео-сосудов было сформировано из острого кончика структур.Точно так же, как показано на рис. 8c (ii), на структурах Ra большая часть нео-сосудов сформирована из верхушки структур, где индекс кривизны самый высокий. Однако в структурах Rc клеточная инвазия распределялась равномерно по периметру, как показано на рис. 8d (ii).

Рис. 8

Микрофотографии клеточной инвазии и конфокальные изображения с круговой диаграммой распределения клеточной инвазии из разных участков внутри каждой структуры для (a) Sa, (b) Sc, (c) Ra и (d) Rc.Круговая диаграмма показывает процентиль инвазии клеток из изогнутых / острых субрегионов с высоким индексом (желтый) и изогнутых / острых субрегионов с низким индексом (серый). Масштабная линейка: 100 мкм.

Рис. 8

Микрофотографии клеточной инвазии и конфокальные изображения с круговой диаграммой распределения клеточной инвазии из разных участков внутри каждой структуры для (a) Sa, (b) Sc, (c) Ra и (d) Rc. Круговая диаграмма показывает процентиль инвазии клеток из изогнутых / острых субрегионов с высоким индексом (желтый) и изогнутых / острых субрегионов с низким индексом (серый).Масштабная линейка: 100 мкм.

^{33 , 34} В нашей текущей работе прикрепления клетка-клетка и клетка-ВКМ могут вызывать такие силы тяги, которые усиливают процесс клеточной инвазии в соседних структурах, где более высокая локальная плотность клеток, опосредованная индексами резкости и кривизны, приводит к ECM, более подверженный вторжению. Как отмечалось ранее, мы наблюдали более высокую силу тяги, прилегающую к областям, где мы наблюдали более высокую инвазию клеток. В будущей работе влияние таких сил может быть исследовано путем изменения геометрии на краях структур, сохраняя при этом постоянные показатели кривизны и резкости там, где ранее наблюдалось, что клетки инициируют вторжение.

Одним из факторов, который может влиять на продолжительность клеточной инвазии среди различных структур, является то, что факторы роста могут быть неравномерно распределены, если плотность клеточной инвазии не одинакова во всех структурах. Например, было замечено, что ростков клеток из Топографии a больше, чем из Топографии c, в то время как Топография c поддерживает еще большую площадь поверхности. Это означает, что в топографии c меньшее количество клеточных ростков имеет больше возможностей для роста, в то время как между ростками меньше конкуренции за факторы роста.Более того, инвазия клеток и рост ростков — это непрерывное явление, которое начинается сразу после добавления факторов роста до тех пор, пока клетки не закрепятся. Таким образом, средняя длина инвазии смещается вниз из-за новообразованных сосудов. Однако структуры, способствующие инвазии клеток, должны содержать более длинные нео-сосуды. В ранние временные точки эта разница может быть очень небольшой, но по прошествии времени и увеличении количества новых сосудов может не быть заметной разницы между длинами новых сосудов.Наши предварительные попытки устранить это смещение путем объединения более проростков по сравнению с ростками ниже средней длины в одном конкретном случае (7,5 мг мл ^-1 гидрогелевых устройств, зафиксированных через 48 часов после добавления факторов роста) показали, что в пределах одной группы кривизны и резкости, круглые структуры способствуют инвазии клеток раньше в процессе, чем острые структуры, в результате чего длина инвазии превышает среднюю, сохраняется в более поздние сроки. Более медленный процесс вторжения из этих острых структур может быть отнесен на счет дополнительного времени и энергии, которые клетки тратят на ремоделирование и прикрепление к острым структурам, а также может помочь объяснить наблюдаемую тенденцию более высокой частоты вторжения для круглых по сравнению с острыми структурами.

Мы экспериментально продемонстрировали, что частота клеточной инвазии зависит от геометрических сигналов, а геометрия с самым высоким индексом кривизны / резкости дает больше новых сосудов. Для устройств ^-1 на 7,5 мг мл частота инвазии клеток была значительно выше для топографии a (самая узкая), чем для топографии b (средняя ширина) и топографии c (самая широкая) (рис. 5b) через 2 дня, а для топографии a (самая узкая). ), чем только топография b (промежуточная ширина) через 3 дня (рис. 5e).Для устройств на 10 мг / мл ^–1 частота инвазии клеток была значительно выше для топографии a по сравнению с топографией c (самая широкая) через 3 дня (рис. 5f). Эти результаты предполагают, что с увеличением времени зависимость клеточной инвазии от индекса кривизны / резкости уменьшается (Fig. 5b and e), поэтому эти различия могут быть наиболее значимыми для ранних стадий прорастания и формирования новых сосудов. Кроме того, мы можем утверждать, что индекс кривизны / резкости играет большую роль, чем площадь поверхности, в стимулировании проникновения клеток с более жесткого субстрата (рис.5e и f), поскольку Topography c имеет большую площадь поверхности, но меньшую кривизну поверхности, чем Topography b. Кроме того, как уже отмечалось, мы наблюдаем наибольшее изменение длины проникновения в зависимости от геометрии для самого жесткого ECM, например, . для 10 мг мл ^-1 устройств средняя длина инвазии из топографии c была выше по сравнению с другими структурами (рис. 5h). Эти наблюдения показывают, что при увеличении механической жесткости ЕСМ возрастает зависимость инвазии клеток от конфигурации кривизны и резкости. Частично это может быть связано с низким количеством клеточных ростков, конкурирующих за клеточную среду и факторы роста в Топографии c, однако дополнительные механизмы, связанные с такими эффектами, как силы тяги и реструктуризация матрикса, должны быть изучены в будущей работе, в то время как можно использовать микрожидкостное питание канала. для устранения вариаций в уровнях питания.

В целом, наша настоящая работа предоставляет доказательства того, что ЭК уравновешивают механическую реорганизацию структуры ВКМ с клеточной инвазией, в зависимости от индекса кривизны и соответствия матрицы.Такая динамическая регуляция ECM сосудистыми структурами ранее не была продемонстрирована и предполагает, что могут существовать сложные петли обратной связи между структурой ECM, геометрией и сосудистой динамикой, которые могут обеспечить терапевтические цели или же привести к неконтролируемому росту опухоли, если их не остановить. . Наше наблюдение повышенной зависимости длины отростка от локальной микрогеометрии ВКМ при более высокой плотности ткани по сравнению с более низкой может также иметь важные последствия для нашего понимания протекающей, извилистой, ветвящейся и, как правило, сильно неупорядоченной сосудистой сети, наблюдаемой в плотных тканях опухоли. .Наши платформы сделают возможным уникальное исследование перехода динамики ЭК от 2D к 3D геометрии с точки зрения изменения морфологии клеток и динамики фокальной адгезии, а также исследования молекулярных сигналов, регулирующих наблюдаемую динамику клеток.

88″> Благодарности

Мы хотели бы поблагодарить Институт критических технологий и прикладных наук (ICTAS) , Национальный научный фонд (CBET-1403304, М. Ага) и Национальные институты здравоохранения (NIBIB-R21EB019123, С. Вербридж) за финансовую поддержку этого проекта. Кроме того, мы хотели бы поблагодарить г-на Дональда Лебера из лаборатории Micron Cleanroom в Технологическом институте Вирджинии и доктора Боба Гейла из Института перспективных материалов, нанонауки и технологий Университета Северной Каролины в Чапел-Хилл за их помощь в процессе изготовления Доктору Кристи ДеКурси из Биотехнологического центра Фралина в Технологическом институте Вирджинии за помощь в создании конфокальных изображений, соответственно.Мы также хотели бы поблагодарить д-ра Элизабет Антуан, д-ра Селесту Нельсон и г-на Абузара Монаварфешани за полезные обсуждения.

Заметки автора

Этот журнал принадлежит Королевскому химическому обществу, 2015 г.

Память, закодированная во всем нашем организме: молекулярная и клеточная основа регенерации тканей

Многомасштабное моделирование на основе изображений предсказывает реорганизацию волокон на тканевом и сетевом уровнях в растянутых уплотненных клетками коллагеновых гелях.

Abstract

Механическая среда играет важную роль в передаче сигналов клеток и гомеостазе тканей. Нарушение связи между внешними нагрузками и клеточным ответом часто затрудняется неоднородностью внеклеточного матрикса (ЕСМ).Многомасштабные модели на основе изображений обеспечивают основу для изучения мельчайших деталей поведения тканей, но они требуют проверки в нескольких масштабах. В этом исследовании мы разработали многомасштабную модель, которая захватила анизотропию и гетерогенность уплотненного клетками коллагенового геля, подвергнутого механическому испытанию внеосевой фиксации, а затем — двухосному растяжению. И в модели, и в экспериментах ECM реорганизовывался неаффинным и гетерогенным образом, который зависел от многомасштабных взаимодействий между оптоволоконными сетями.Моделирование предсказало, что растягивающие и сжимающие силы волокна были созданы, чтобы приспособиться к макроскопическим смещениям. Силы волокон при моделировании варьировались от -11,3 до 437,7 нН, при этом значительная часть волокон подвергалась сжатию (12,1% при внеосевом растяжении). Гетерогенная реструктуризация сети, предсказываемая моделью, служит примером того, как методы многомасштабного моделирования обеспечивают теоретическую основу для понимания взаимосвязей между структурой ECM и механическими свойствами на уровне ткани и как микроскопические перестройки волокон могут приводить к передаче сигналов механотрансдуктивных клеток.

Многие виды активности зависимых от закрепления клеток, включая пролиферацию (1, 2), миграцию (3-5), экспрессию генов / синтез белка (6, 7), химическую чувствительность (8, 9) и дифференцировку (10, 11) ), опосредуются механическими взаимодействиями между клетками и окружающей их средой. Хотя нам часто удобно рассматривать клеточную среду и взаимодействия с ней как изотропные и однородные, обширная биология выступает против такого упрощения. Ткани могут казаться однородными в макроскопическом масштабе, но на самом деле они очень иерархичны, проявляясь как дискретные структурные образования (например,ж., волокна) в масштабе клетки. Точно так же клетка не взаимодействует гладко со своим окружением, а скорее образует адгезии клеточного матрикса, которые также неоднородно распределены в дискретных местах на поверхности клетки (12).

Таким образом, крайне важно, чтобы мы исследовали механобиологию не только с точки зрения общей механики ткани, но и с точки зрения ее составляющих, принимая как можно более подробный обзор. Следует признать, что номинально однородная нагружающая среда в масштабе ткани, такая как одноосное растяжение, на самом деле очень неоднородна в масштабе волокна, причем некоторые волокна, возможно, даже находятся в состоянии сжатия (т.е.е., изогнутый) из-за сложных взаимодействий в сети. Поскольку клетка опрашивает только часть общей популяции волокон, необходимо более подробное представление внеклеточного матрикса (ЕСМ). Наша группа разрабатывает методы многомасштабного моделирования, чтобы понять, как сложные механические взаимодействия, возникающие в микроструктуре ВКМ, интегрируются в механическую реакцию всей ткани, особенно в тканях, созданных с помощью инженерии (13–15). В наших экспериментах мы механически тестируем крестообразные, уплотненные клетками коллагеновые гели (крестообразные) (16), одновременно визуализируя реструктуризацию локальной сети коллагеновых волокон (17).Затем строится многомасштабная вычислительная модель на основе изображений, которая должна соответствовать как макроскопическому механическому отклику крестовины, так и микроскопическим перестройкам волоконной сети ЕСМ, которые происходят во время нагрузки. В модели построены уникальные трехмерные волоконно-оптические сети, соответствующие направлению и силе выравнивания волокон, измеренной с помощью визуализации в поляризованном свете. Основные параметры на уровне волокна, используемые для моделирования крестообразной реакции на испытание на внеосевое удержание, затем используются для прогнозирования крестообразной реакции на испытание на равноосное растяжение.В этой работе мы демонстрируем, как многомасштабная модель на основе изображений, состоящая из пространственно изменяющихся микроструктурных сетей, может использоваться для моделирования множественных макроскопических деформаций одного и того же образца и как микроструктурные перестройки, предсказываемые моделью, согласуются с изображениями деформированных образцов в поляризованном свете. . Насколько нам известно, экспериментальные данные, полученные в разном масштабе в уплотненном клетками коллагеновом геле, ранее не были успешно предсказаны. Из экспериментов и моделирования мы видим, что реорганизация ECM происходит неаффинно и неоднородно, что зависит от многомасштабных взаимодействий, передаваемых между оптоволоконными сетями.Кроме того, изучение кинематики на уровне волокон показывает расположение и зависящее от протокола нагрузки распределение сил волокон, которое включает как растяжение, так и сжатие.

результатов

Населенному фибробластами коллагеновому типу I типа крестообразную форму, используемому в этом исследовании, позволяли уплотняться в течение 4 дней, чтобы произвести выравнивание волокон, но минимизировать синтез дополнительных компонентов ECM (1). Для изученной геометрии пресс-формы уплотнение ячеек привело к сильному выравниванию вдоль вертикальных и горизонтальных плеч крестообразной формы и дало центральную область немного большее выравнивание в горизонтальном направлении из-за использования более широких горизонтальных плеч (16).Во время механических испытаний реорганизация волокон в крестообразной форме в реальном времени оценивалась путем отслеживания изменений направления волокон (θ) и силы выравнивания волокон (δ *) с помощью поляриметрической визуализации выравнивания волокон (PFAI). Эти данные использовались для построения трехмерных микроструктурных сетей в эквивалентных местах многомасштабной модели, а также для отслеживания и сравнения микроструктурных изменений в ответ на нагрузку. В материальном уравнении волокна используются два параметра: A = E _f A _f = 52 нН и B = 3.8, были выбраны так, чтобы соответствовать макроскопическому отклику крестообразной формы на внеосевое растяжение (рис. 1). Затем было смоделировано испытание на равноосное растяжение с использованием тех же параметров модели. E _f — это подгоночный параметр, который сводится к модулю Юнга в пределе небольшой деформации, а A _f — это площадь поперечного сечения волокна. Чтобы понять физический смысл A , коллагеновое волокно диаметром 100 нм и A, = 52 нН будет иметь E _f = 6.8 МПа.

Крестообразная механическая реакция на внеосевое удержание и равноосное растяжение. ( A ) На вставке показана типичная крестообразная форма в форме с шириной горизонтальных и вертикальных рычагов 8 и 4 мм соответственно. Параметры A и B , которые определяют механический отклик сетевого волокна, были выбраны таким образом, чтобы прогнозы модели (красные линии) соответствовали эксперименту с внеосевым удержанием (круглые маркеры), и использовались для прогнозирования реакции модели на равноосное растяжение.В испытании на удержание вне оси ( A ) вертикальные рычаги крестовины были смещены на 2 мм (λ _y = 1,29) за 15 секунд, в то время как горизонтальные рычаги оставались неподвижными. Средняя реакция на нагрузку по обеим осям представлена ​​как функция вытянутости вертикальной оси. ( B ) Для равноосного растяжения обе руки были выдвинуты на 1,5 мм (λ _y = 1,21) за 15 секунд. Модель разумно предсказывала крестообразный отклик, но недооценивала нелинейность в вертикальном плече.

Макроскопический ответ на тесты на удержание вне оси и на эквивалентное растяжение.

Для испытания на удержание вне оси (рис. 1 A ) сила, развиваемая в вертикальном плече, была больше, чем в неподвижном горизонтальном плече, достигая пиковых значений 8,4 мН и 2,4 мН, соответственно. Модель, вероятно, занижает начальный механический отклик здесь из-за неспособности учесть вращательную жесткость поперечных связей. Когда крестовина подвергалась равноосному растяжению (рис.1 B ), механический отклик увеличился нелинейно, с большей силой, необходимой для разгибания более широкого горизонтального плеча (пиковая сила 14,8 мН), чем более тонкого вертикального плеча (пиковая сила 7,1 мН). Модель зафиксировала это поведение, но недооценила нелинейность в вертикальном плече.

Область модели конечных элементов была указана на захватах, чтобы соответствовать смещениям захватов в эксперименте, оставляя криволинейную поверхность свободной для деформации в соответствии с реструктуризацией сети, происходящей внутри элементов.Сравнение области модели и крестообразной формы (рис. 2) показывает, что для теста удержания вне оси предсказания модели расширения области были менее точными с увеличением растяжения [таблица 1, параметр перекрытия (OP) (см. перекрытие области модели. )]. Положение изогнутой поверхности было завышено возле горизонтального захвата и занижено в центре кривой. Моделирование равноосного растяжения выполнено аналогичным образом. Первоначально область модели немного занижала область эксперимента.Однако с увеличением растяжения границы расширения были в основном переоценены.

Изменения крестообразных доменов и реорганизация микроструктуры при внеосевом и равноосном растяжении. Левый нижний квадрант крестообразной формы показан с областью модели и свойствами выравнивания сети (красный), наложенными на измерения PFAI ориентации волокна и силы выравнивания (белый). Черные области по горизонтали и вертикали — это зажимы сжатия, которые охватывают свободную поверхность крестовины.Разница в принципиальном направлении между моделью и экспериментом изображена на вставке . Также показано распределение углов сети в модели (красный) и в эксперименте (синий). ( A ) Для теста фиксации вне оси модель предсказывает измеренное вращение и выравнивание волоконных сетей с удлинением вертикальной оси. ( B ) Та же самая модель, подвергшаяся равноосному растяжению, предсказывает, что направление локальной сети немного поворачивается в сторону горизонтали, и разумно соответствует эксперименту.

Разница в свойствах сети и перекрытие доменов

Микроскопический ответ на удержание вне оси и эквиаксиальное растяжение.

Модельные сети были созданы, чтобы соответствовать начальному главному направлению (θ) и силе совмещения (δ *) крестовины перед испытанием внеосевой фиксации (Таблица 1). Изотропная сеть без предпочтительного направления обозначается δ * = 0, тогда как полностью выровненная сеть с каждым волокном, ориентированным в одном направлении, обозначается δ * = 1 (см. Материалы и методы ).В тесте удержания вне оси удлинение вертикальной оси заставляло коллагеновые сети вращаться и растягиваться при вертикальном захвате. Модель зафиксировала это поведение, хотя есть некоторые области разногласий (рис. 2). Для равноосного растяжения сети, которые уже были преимущественно выровнены либо в горизонтальном, либо в вертикальном направлении, становились более выровненными с увеличением растяжения, и наблюдался аналогичный уровень согласия между моделью и экспериментом. Распределение главного угла на каждой стадии деформации показывает, что модель зафиксировала реорганизацию общей сети как во внеосевом испытании удержания, когда средняя ориентация микроструктуры изменилась с горизонтального на вертикальное направление, так и в испытании на равноосное растяжение, где небольшое чистый поворот к горизонтали произошел.В некоторых регионах переориентация сети не прошла. По большей части эти регионы соответствуют местам, где сеть была почти изотропной, и поэтому главное направление было плохо определено. Например, в испытании на удержание вне оси при d = 1,00 мм сеть около центра крестообразной формы с δ * = 0,103 была очень неточной в главном направлении с Δθ = 34,0 °. Эта сеть стала более выровненной при полном растяжении, поскольку она завершила свой переход от основного направления, ориентированного горизонтально, к направлению, ориентированному вертикально, и согласование было значительно улучшено (Δθ = 11.8 °). Однако верхняя левая сеть не попадает в эту категорию. Вместо этого коллагеновая сеть в этом месте реорганизовалась способом, плохо предсказываемым моделью (Δθ = 70,4 °). Несмотря на эту сеть, средняя разница в главном угле для максимального растяжения составила только Δθ = 7,0 ± 9,5 ° и Δθ = 8,3 ± 6,1 ° для испытаний внеосевого удержания и равноосного растяжения, соответственно. Точно так же средняя разница в замедлении составила только Δδ * = 0,112 ± 0,083 ° и Δδ * = 0,125 ± 0,085 °. Эти результаты показывают, что в целом модель хорошо отражает реструктуризацию сети.Однако в начале моделирования равноосного растяжения некоторые сети не были хорошо согласованы с их эквивалентными местоположениями в эксперименте, что позволяет предположить, что изменения в микроструктуре произошли в результате испытания на удержание вне оси.

Зависящее от местоположения поведение сети и кинематика волокна.

Моделирование также использовалось для прогнозирования отклика отдельных волокон в сетях. Для теста удержания вне оси при максимальном растяжении, когда степень макроскопического растяжения в направлении y составляла λ _y = 1.29, коэффициенты растяжения волокон λ _f варьировались от 0,39 до 1,44 (〈λ _f 〉 = 1,06 ± 0,08), показывая, что значительная часть волокон в модели находилась в состоянии сжатия (12,1%). . Процент сжатых волокон варьировал в зависимости от региона. Больше сетевых волокон было сжато в элементах в центре крестообразной формы, чем где-либо еще в домене ( f _c ^max = 25,2%, где f _c — доля сжатых волокон в элементе, и верхний индекс указывает, что это максимальное или минимальное значение для всех элементов в домене).Самый низкий процент сжатых волокон был обнаружен в элементах на границе вертикального захвата ( f _c ^min = 3,1%). Для сравнения, для равноосного растяжения (λ x = λ _y = 1,21) диапазон λ _f увеличился до диапазона с 0,38 до 1,68 (〈λ _f 〉 = 1,11 ± 0,09 ), а процент сжатых волокон (5,5%) уменьшился. Для равноосного растяжения самый высокий процент сжатых волокон был обнаружен вдоль изогнутой границы ( f _c ^max = 14.2%) и самый низкий в центре крестообразной формы ( f _c ^min = 2,0%). Степень сжатия сети в направлении z варьировалась и зависела от того, насколько сильно сети были согласованы с основными направлениями нагрузки. В общем, равноосное растяжение ограничивало вращение волокна в плоскости и ускоряло сжатие сети в направлении z .

Чтобы лучше проиллюстрировать кинематику волокна на сетевом уровне, мы исследовали сети в трех точках модели (рис.3). В вертикальном плече крестообразной формы для теста удержания вне оси сеть, которая изначально была строго выровнена в вертикальном направлении (таблица 2), увеличилась в выравнивании, и были предсказаны силы волокон с -8,5 до 45,6 нН (рис. 3 ). 1 ). Гистограмма коэффициентов растяжения волокон показывает, что большинство из них ниже степени макроскопического растяжения, λ _y , и что небольшое количество волокон находится в состоянии сжатия. Та же самая сеть, подвергнутая равноосному растяжению, развивала аналогичные уровни силы в волокнах, но с меньшим растяжением, потому что волокна в других частях модели, которые до этого были свободны, чтобы вращаться к вертикали, больше не могли этого делать из-за растяжения в волокнах. горизонтальное направление.Эти эффекты передавались повсюду, даже в вертикальное плечо крестовины. Дополнительные ограничения позволили получить больше волокон с коэффициентом растяжения, который превышает λ _y , чем раньше.

Реорганизация сети в ответ на внеосевое и равноосное растяжение. Изображены сети из трех разных областей в крестообразной форме перед растяжением (, центр, ) и их реакция на увеличение растяжения за счет внеосевого растяжения (, центр, , , левый, ) и равноосное растяжение (, центр, , , правый, ).Реорганизация сети происходит в зависимости от местоположения, и развивается ряд внутрисетевых сил. Гистограмма коэффициентов растяжения волокон в деформированных сетях показывает, что некоторые волокна находятся в состоянии сжатия, даже несмотря на то, что к образцу приложена макроскопическая растягивающая нагрузка. Сплошные красные линии показывают макроскопический коэффициент растяжения на уровне ткани (λ _y ) в направлении y (вертикальная ось). λ _y = 1,15 при d = 1,00 мм, λ _y = 1.21 при d = 1,50 мм и λ _y = 1,29 при d = 2,0 мм.

Свойства отдельных сетей, изображенных на рис. 3

Зависящая от местоположения реструктуризация сети была более очевидной в центральной области крестообразной формы (рис. 3 2 ). Сети в этом районе изначально имели умеренное выравнивание по горизонтали. Во время теста на удержание вне оси многие волокна смогли вращаться и растягиваться в вертикальном направлении при смещении вертикального захвата (рис.3). В результате силы в волокнах оставались ниже (от -5,3 до 39,1 нН), чем в вертикальной области крестообразной формы. При равноосном растяжении волокна не могли свободно вращаться по вертикали, и возникали более высокие силы. Гистограммы степени растяжения волокна показывают, что все волокна были ниже λ _y для теста на удержание вне оси, но часть волокон превышала λ _y при равноосном растяжении.

Сети вдоль изогнутой поверхности домена повернуты таким образом, что при просмотре на большем масштабе длины возникает то, что выглядит как сдвиг (например.g., сетевой или тканевый уровень) (рис. 3 3 ). Для внеосевого удержания значения λ _f были значительно ниже λ _y даже при максимальном растяжении, что приводило к более низким силам в этой области. Напротив, равноосное растяжение ограничивает вращение волокна, при этом волокна вместо этого деформируются в осевом направлении и развивают самые высокие силы из трех изображенных сетей.

Обсуждение

В этой работе мы построили многомасштабную модель на основе изображений, которая соответствовала геометрии, локальной микроструктуре и механическому отклику уплотненной ячейки крестообразной формы, подвергшейся внеосевому испытанию на удлинение удержания.Затем модель была использована для прогнозирования многомасштабной механической реакции крестовины на испытание на равноосное растяжение. Несмотря на то, что использовались идеализированные волоконно-оптические сети, модель смогла сопоставить макроскопические и микроскопические механические и структурные реакции. Наши результаты показывают, что эти методы моделирования обеспечивают теоретическую основу для интерпретации экспериментальных механических данных с точки зрения структуры и неоднородности ECM. В этой работе модель показала, как приложенные извне нагрузки передаются по всей крестообразной форме и сталкиваются с неаффинной перестройкой сети, что приводит к распределению растягивающих и сжимающих сил волокон.Подробные модели необходимы для исследования того, как механические свойства на уровне ткани зависят от структуры и состава ВКМ. Без такой модели было бы трудно оценить вовлеченные многомасштабные взаимодействия.

Техническая оценка модели.

При формулировании модели был сделан ряд ключевых предположений. Во-первых, не учитывались важные вклады клеток и интерстициальной жидкости. Несколько исследований показали, что клетки как активно, так и пассивно участвуют в механике уплотненных гелей (18) и что интерстициальная жидкость поддерживает сжимающие нагрузки и способствует вязкоупругому отклику геля (19).Различия в механической реакции крестовины на два механических испытания могут отражать зависимость от скорости деформации эксперимента. Испытания на удержание вне оси и на равноосное растяжение были полностью продлены за 15 секунд, что соответствует линейным скоростям деформации 116 и 84 деформации (%) / мин, соответственно. Используя данные аналогичного эксперимента, в котором одноосное испытание проводилось на бесклеточных коллагеновых гелях (20), мы оценили разницу в линейном модуле для этих скоростей деформации всего на 5% (17,8 против 18.6 кПа). Однако концепция единой скорости деформации не подходит для сравнения здесь, поскольку условия нагружения были разными.

Второе упрощение заключалось в том, что микроструктура была идеализирована как единая сеть коллагеновых волокон одинакового диаметра, а другие компоненты ECM были исключены. Сканирующая электронная микроскопия, проведенная на бесклеточных коллагеновых гелях, выявила гетерогенную популяцию волокон диаметров. Измеренные диаметры волокна находились в диапазоне от 42 до 255 нм при среднем диаметре 69 нм.Крестообразные культивировали в течение 4 дней для ограничения синтеза ВКМ, но, вероятно, это не была чистая коллагеновая сеть. Механика на уровне волокна была определена с использованием экспоненциального материального уравнения, и были созданы поперечные связи между волокном, чтобы позволить волокнам вращаться, но не изгибаться или скользить друг мимо друга. В предыдущем исследовании (21) мы оценили чувствительность модели к форме материального уравнения волокна и не обнаружили качественной разницы между экспоненциальным или линейным уравнением. Предположения, которые мы сделали относительно поперечных связей волокон, являются приближением, которое согласуется с экспериментальными наблюдениями, сделанными в предыдущем исследовании (19).Однако необходимо провести дополнительную работу, чтобы выяснить детали этих взаимодействий. Нелинейный отклик материала, зафиксированный в модели, возникает в первую очередь из свойств сети, где волокна приспосабливаются к макроскопическому растяжению за счет вращения поперечных связей перед растяжением вдоль оси волокна. Наконец, предполагалась связь между измеренным запаздыванием образца и смоделированной силой выравнивания сети. Хотя все эти вопросы важны и каждый из них является предметом потенциального будущего исследования, текущая модель все еще была эффективна при описании как микроскопического, так и макроскопического поведения крестообразной формы.

Величина перекрытия областей между моделью и экспериментом использовалась для оценки точности модели, но также давала оценку важности уточнения сетки и микроструктуры сети. Увеличение количества элементов с 64 до 134 не привело к значительному улучшению перекрытия, что указывает на то, что более крупная сетка в достаточной мере объясняет масштаб микроструктурной неоднородности в крестообразной форме. При максимальном растяжении ( d = 2,00 мм) в испытании на удержание вне оси параметр перекрытия (OP) в уточненной модели составлял 2.9 против 3,0 в грубой модели. Спецификация микроструктуры волоконной сети явно была важна для точности моделирования. Для теста удержания вне оси модель, не основанная на изображении, состоит из одной, почти изотропной сети с недооцененным расширением области вдоль криволинейной поверхности крестообразной формы с OP = 4,4 и OP = 7,9 при d, = 1,00 мм и d. = 2,00 мм соответственно. Когда использовался набор сетей, которые соответствовали основным направлениям крестообразной формы, но имели искусственно повышенное выравнивание (〈δ * = 0.927 ± 0,019〉) область была завышена на OP = 7,3 и OP = 13,8 при d = 1,00 мм и d = 2,00 мм. Большое изменение ошибки перекрытия при использовании неправильного распределения волокон демонстрирует необходимость структурного представления крестообразной формы, если необходимо выполнить подробный механический анализ.

Последствия для механотрансдукции.

Механические сигналы являются важным компонентом гомеостаза и роста тканей (22). Важность механической передачи сигналов как источника стимуляции роста и ремоделирования в сконструированных соединительных тканях была четко продемонстрирована (23–26).В этих исследованиях сконструированные ткани подвергались различным протоколам нагрузки, и наблюдался ряд клеточных ответов, которые улучшили механические свойства конструкции, включая повышенную пролиферацию клеток и отложение ECM. Выделить сигнальные механизмы, которые привели к этим изменениям в активности клеток, сложно, потому что ассоциированные события, помимо того, что они динамические, охватывают несколько масштабов длины и проводятся через гетерогенный ECM. Даже для относительно простых протоколов внешней нагрузки, таких как одноосное удлинение, передача нагрузки и реструктуризация ECM, создается сложный массив потенциальных механических сигналов.Мультимасштабные модели, основанные на микроструктуре ткани, обеспечивают концептуальную основу для характеристики микросреды клетки и определения механических сигналов для конкретной клеточной активности.

Хотя клетки не были включены в эту модель, некоторые идеи о видах механических сигналов, которые клетка может воспринимать при нагрузке, возможны. Сети в модели представляют собой длину края бокса ≈8 мкм в физической области, масштаб сравнимый с масштабом ячейки в трехмерной среде (20 мкм).Ячейка, прикрепленная к этим оптоволоконным сетям, будет ощущать диапазон волоконных сил (ограниченный от -11,3 до 437,7 нН, с 〈 F 〉 = 9,86 ± 10,02 нН в этих симуляциях), выраженный по-разному по ячейке и способом, зависящим от клеточно-волоконные связи и расположение в крестообразной форме.

Существует множество различных способов моделирования биополимерных сетей (например, ссылки 27–29). В будущих механобиологических исследованиях будет важно признать не только универсальные особенности таких сетей, но и уникальные особенности каждой биополимерной системы (см.30). Включение этих биополимерных моделей, моделей молекулярного уровня (Бюлер), моделей клеток (32) и дополнительных экспериментальных данных (33), которые потенциально могут быть включены в эту теоретическую основу, прояснило бы механические причины и следствия этих клеток. события на уровне, такие как взаимосвязь между транскрипцией гена и передачей силы в ECM, цитоскелете и ядре (34). Другие явления, которые могут быть рассмотрены, включают повреждение волокна и эффекты предварительного кондиционирования, как видно из этого эксперимента.

Многомасштабные модели на основе изображений, такие как представленная здесь, предоставляют средства для интеграции больших объемов данных из нескольких масштабов длины. Такие модели являются лишь частью важного набора инструментов, необходимых для раскрытия и определения связей между составом и организацией внеклеточного матрикса, макроскопическим механическим поведением ткани и активностью клетки в ответ на ее структурное и механическое микроокружение.

Материалы и методы

Подготовка проб.

Коллагеновые гели были приготовлены путем смешивания дермальных фибробластов новорожденных человека с растворимым в кислоте коллагеном I типа (органогенез) и отлиты в тефлоновой форме в форме креста (крестообразной формы) для получения конечной концентрации коллагена 1,5 мг / мл и концентрации клеток 1 × 10 ⁶ клеток на миллилитр. Геометрия кристаллизатора состояла из вертикального канала шириной 4 мм и горизонтального канала шириной 8 мм. Эта конфигурация обеспечивает четкое выравнивание рычагов и немного большее выравнивание по горизонтали в центре (16).Крестообразные культивировали в течение 4 дней, чтобы обеспечить уплотнение, которое делает гель более жестким и выравнивает его, не допуская значительного ремоделирования. Гели культивировали в среде DMEM (Gibco) с добавлением 10% FBS (HyClone), 100 единиц / мл пенициллина, 2 мкг / мл инсулина, 50 мкг / мл аскорбиновой кислоты, 2,5 мкг / мл амфотерицина-β, 1 нг / мл TGF-β. ₂ .

Механические испытания и поляриметрия.

Механические испытания проводились на планарной двухосной испытательной установке Instron. Плечи для образцов прикрепляли с помощью компрессионных зажимов к тензодатчикам 5 Н и испытывали в PBS при комнатной температуре.Образцы сначала подвергали испытанию на удержание вне оси, в котором горизонтальные рычаги (8 мм) оставались неподвижными, а вертикальные рычаги (4 мм) смещались до степени растяжения 1,29. Затем образцы подвергали испытанию на равноосное растяжение, при котором оба плеча были смещены до степени растяжения 1,21. Оба теста были проведены за 15 секунд, чтобы обеспечить возможность захвата видео. PFAI использовался для измерения в реальном времени изменения направления волокна локальной сети и силы выравнивания волокна во время механических испытаний (см.17).

Мультимасштабная модель.

Используемые здесь методы моделирования на основе изображений основаны на теории объемного усреднения и описаны в ссылках. 14 и 15 и SI Приложение и рис. S1. В модели использовался метод конечных элементов Галеркина для макроскопической задачи, но вместо использования определяющего уравнения для связи деформации с напряжением был решен набор микроскопических сетевых задач в тех местах, где напряжение необходимо для решения методом конечных элементов.В рамках этой структуры для решения задачи необходимы три уравнения: уравнение баланса макроскопических напряжений, уравнение усреднения объема, которое связывает баланс микроскопических сил на волокнах сети с макроскопическим напряжением в точках интегрирования конечных элементов, и определяющее уравнение который описывает механику волокна. Мы использовали феноменологическое определяющее уравнение (35) F = A / B [exp ( B ε _f ) — 1], где F — сила волокна, A и B — определяющие константы, а ε — деформация Грина, равная 0.5 (λ _f ² — 1), где λ _f — степень растяжения волокна.

Микроскопические волоконно-оптические сети.

Была создана сетка конечных элементов (КЭ), содержащая 64 гексагональных трилинейных элемента (один элемент по толщине), которые соответствовали геометрии образца. В предположении симметрии был смоделирован только один квадрант. Для каждого элемента была создана уникальная трехмерная коллагеновая сеть. Среднее замедление и угол, связанные с каждым элементом, были получены с использованием спроецированной области FE в качестве маски для данных PFAI.Поскольку данные измерений PFAI представляют собой значения, спроецированные из трехмерной микроструктуры, сети были созданы таким образом, чтобы их проекции совпадали. Ориентация волоконно-оптической сети количественно оценивалась с помощью взвешенного по длине тензора ориентации второго ранга, задаваемого формулой где l _i — длина волокна i , а θ _i — угол, который образует волокно i по отношению к горизонтали, и сумма берется по всем волокнам в сети. .Сети были созданы с помощью алгоритма стохастического роста и выбраны так, чтобы их главный собственный вектор соответствовал направлению волокна PFAI (θ), а разница в их собственных значениях соответствовала масштабированному запаздыванию (δ *) в пределах заданного допуска. Необработанное запаздывание PFAI (δ) было преобразовано в анизотропию сетки через δ * = δ / C = ω ₂ — ω ₁ . где C — сосредоточенная константа пропорциональности (здесь C = 75 °), а ω ₂ и ω ₁ — главное и второстепенное собственные значения Ω соответственно. C учитывает влияние концентрации коллагена, состава, толщины образца и других факторов, влияющих на пропускание поляризованного света, которые считаются однородными по всему образцу. Это предположение действительно при условии, что количество замедлителей схватывания в данном месте не меняется. В результате допустимы вариации толщины образца и концентрации коллагена, если они связаны таким образом. Согласно этому соглашению, для изотропной сети δ * = 0 и для полностью выровненной сети δ * = 1.Сети были приняты, если скалярное произведение главного направления сети и главного угла PFAI превышало 0,99. Не было явных ограничений на соответствие δ и δ *, потому что средняя разница между моделью и экспериментом составляла всего 0,06 ± 0,04.

Вычислительная реализация и требования.

Мультимасштабный код был составлен на языке C и выполнен на кластере IBM BladeCenter Linux в Миннесотском институте суперкомпьютеров. Проблема заключалась в ≈500000 ° свободы.Вычислительные требования возникли в основном из-за микроскопических сетевых проблем, каждая из которых содержала ≈325 перекрестных связей ( x , y , z положение перекрестных связей), восемь сетей на элемент и 64 элемента. Для сравнения, макроскопическая задача содержала 182 узла и только 546 ° свободы ( x , y , z положение узла). Чтобы улучшить время выполнения, микроскопическая проблема была распараллелена с помощью интерфейса передачи сообщений (MPI). Для этих симуляций 12 процессоров Opteron 2218 (двухъядерные 2.6 ГГц), время на стене чуть менее 1 часа.

Перекрытие доменов модели.

Величина перекрытия пикселей между моделью и экспериментом была рассчитана для оценки прогностических возможностей модели. Крестообразные изображения были импортированы в Matlab, обработаны пороговыми значениями и сегментированы с помощью алгоритма обнаружения краев Кэнни, чтобы найти крестообразную границу и удалить фоновые пиксели. Операция исключающего ИЛИ (XOR) над крестообразной областью и областью модели дала количество неперекрывающихся пикселей, которые затем нормализовались на количество пикселей, составляющих границу изогнутой поверхности в модели.Это значение, которое мы называем OP, соответствует среднему количеству пикселей за криволинейной границей в модели. OP = 0, когда области модели и эксперимента полностью перекрываются, и увеличивается по мере ухудшения прогнозов модели.

Благодарности

Эта работа была поддержана грантами Национального института здравоохранения R01 EB005813 и F32 EB007433 и выполнена частично с использованием вычислительных ресурсов в Институте суперкомпьютеров Университета Миннесоты.