Методы оценки состояния системы гемостаза: Система гемостаза — — Статьи

Содержание

Система гемостаза — — Статьи

Диагностика и методы исследования

Равновесие между свертывающими и противосвертывающими процессами в крови – необходимое условие существования нашего организма. Нарушение этого равновесия приводит к тяжелым последствиям: кровотечению или тромбообразованию. Поддерживается данный баланс системой гемостаза – одной из важнейших функциональных систем организма, которая решает две «противоположные» задачи:

• поддерживает жидкое состояние крови в обычных условиях;

• останавливает кровотечение при повреждении сосуда.

Свёртывающая система крови (гемостаз) нужна для остановки кровотечения, чтобы избежать значительных кровопотерь при повреждении сосудов. Механизмы гемостаза реализуются при любом повреждении эндотелия сосудистой стенки, вызванном физическими, гемодинамическими, химическими факторами, а также воспалительными процессами, действием иммунных комплексов, нарушением метаболизма (атеросклероз, коллагенозы) и др.

Свертывание крови является жизненно необходимым: мутации в генах основных белков свертывания, как правило, летальны. Система гемостаза удерживает абсолютное первенство среди множества систем нашего организма как главная непосредственная причина летальных исходов:

люди болеют разными болезнями, но умирают почти всегда от нарушений системы свертывания крови.

Если причина известна, почему же с ней нельзя бороться? Разумеется, бороться можно и нужно: постоянно создаются новые методы диагностики и терапии нарушений системы свертывания. Но проблема заключается в том, что свертывание крови — крайне сложный и во многом еще загадочный биохимический процесс, который запускается при повреждении кровеносной системы и ведет к превращению жидкой плазмы крови в студенистый сгусток, который как пробка затыкает рану и останавливает кровотечение.

Система гемостаза состоит из десятков белков, которые взаимодействуют в сотнях реакций друг с другом, со стенками сосудов, с клетками крови. Нарушения этой системы крайне опасны и могут привести к кровотечению, тромбозу или другим патологиям, которые совместно отвечают за львиную долю смертности и инвалидности в современном мире. Здесь мы рассмотрим устройство этой системы и расскажем о самых современных методах ее исследования.

I. Система свертываемости крови


По современным представлениям, в остановке кровотечения задействованы:
1) сосудисто-тромбоцитарный гемостаз (первичный), в котором принимают участие стенки сосудов, тромбоциты и, отчасти, эритроциты;

2) плазменный гемостаз (вторичный) — когда в процесс свертывания крови включаются белки плазмы (плазменные факторы свертывания крови).

Такое деление гемостаза достаточно условно, так как в организме эти два звена свертывающей системы крови тесно взаимосвязаны.

1. Первичный гемостаз (сосудисто-тромбоцитарный)
Обеспечивает остановку кровотечения из мелких сосудов и сосудов с низким артериальным давлением.

Триггер – повреждение сосудистой стенки и обнажение волокон коллагена — запускает события, которые следуют одно за другим следующим образом.

Реакция кровеносного сосуда
1) Спазм – моментальное рефлекторное сужение сосуда.

Реакция тромбоцитов
2) Адгезия – тромбоциты, благодаря наличию рецепторов к коллагену, прилипают к внутренней стенке сосуда в месте повреждения. Такая стабилизация не дает току крови смывать сгусток тромбоцитов со стенки сосуда. 

3) Активация — форма тромбоцитов изменяется, на их поверхности образуются отростки.

4) Агрегация — тромбоциты в большом количестве слипаются, набухают и образуют все более крупный агрегат — рыхлый тромбоцитарный сгусток.

Таким образом, место повреждения сосуда закрывается очень плотной многослойной пробкой (белый тромб), который формируется в течение 3-5 минут. Обычно этого достаточно, чтобы остановить кровотечение у здорового человека при повреждении мелких сосудов.  

Таким образом, первичный гемостаз обусловлен сужением сосудов и их механической закупоркой агрегатами тромбоцитов.

  Единичный тромбоцит в активированном состоянии с отростками
 
Тромбоцитарный сгусток
 

2. Вторичный гемостаз (плазменный, коагуляция)

Первичный белый тромб — это только временное решение, так как достаточно резкого движения или даже незначительных колебаний артериального давления (например, при физическом напряжении), чтобы сорвать тромбоцитарную пробку с места повреждения сосудистой стенки. Необходим дополнительный механизм, который укрепит скопление тромбоцитов и плотно свяжет его с краями раны. Начинается вторичный гемостаз, или собственно свертывание крови — коагуляция.

При свертывании крови запускается каскад реакций, превращающих растворенный в плазме белок фибриноген в нерастворимый фибрин, который формирует подобие тонкой сетки. Сеть фибрина захватывает находящиеся рядом лейкоциты и эритроциты, формирует красный тромб, уплотняет его и прикрепляет к краям раны. Коагуляция, или свертывание крови, останавливает кровотечение из крупных сосудов и предотвращает его возобновление. В коагуляционном каскаде реакций участвуют особые белки плазмы — факторы свертывания крови, которые обозначаются римскими цифрами в порядке их открытия (например, фактор II, VII и т.д.). Таким образом, в норме скорость свертывания крови зависит от взаимодействия целого ряда различных факторов.

 

3. Фибринолиз (растворение сгустка крови)
Система фибринолиза восстанавливает проходимость сосудов после ремонта места повреждения сосудистой стенки. Расщепление фибрина происходит под действием специального фермента — плазмина — с образованием продуктов деградации фибрина (ПДФ). Процесс фибринолиза длится от дней до недель, в зависимости от размера и выраженности повреждения сосуда.


 

II. Алгоритм диагностики нарушений системы гемостаза

Нарушения в системе свертываемости могут приводить к серьезным, с угрозой жизни, кровотечениям и тромбозам. 

Которые, в конечном итоге, являются прямой или косвенной причиной наступления более половины всех летальных исходов: например, тромбозы при травме, сепсисе, онкологическом заболевании, хирургическом вмешательстве и др. 

Поэтому своевременная точная оценка состояния системы гемостаза – одна из важнейших задач медицины.

Клиническая лабораторная диагностика решает эту задачу с помощью алгоритма:

от оценочных методов (скрининг) к специальным исследованиям (уточнение диагноза).

1. Скрининг


Первоначально выполняются исследования, отражающие состояние целых звеньев системы гемостаза.

Для этого существует стандартный набор тестов, традиционно называемых скрининговыми:
• время кровотечения

• протромбиновое время (ПВ)

• международное нормализованное отношение (МНО)

• активированное частичное тромбопластиновое время (АЧТВ)

• тромбиновое время (ТВ)

• концентрация фибриногена

• растворимые фибрин-мономерные комплексы (РФМК)

• Д-димер

Диагностическая значимость скрининга:
нормальные результаты – нет значительных изменений в системе гемостаза

аномальные результаты – показывают направленность нарушений в системе гемостаза

Протромбиновое время (ПВ) — один из основных базовых тестов в повседневной клинической практике; используется для определения времени свертывания и расчета МНО. Кровь собирают в пробирку с цитратом натрия, который действует как антикоагулянт: связывает ионы кальция, без которых кровь не свертывается. Избыток кальция возвращает цитратной плазме способность к свёртыванию. Далее к плазме с кальцием добавляется тканевой фактор (III фактор свертывания), и измеряется время образования сгустка.

 

Международное нормализованное отношение (МНО) — результаты ПВ зависят от активности используемого в тесте реагента тромбопластина. Чтобы уйти от этой зависимости и стандартизовать измерения ПВ, был введён показатель МНО, который рассчитывается как отношение (ПВ пациента/ПВ норма)МИЧ. Где МИЧ – это международный индекс чувствительности тромбопластина, показывающий его активность для данной партии реагента.

 

 

Активированное частичное тромбопластиновое время (АЧТВ) – представляет собой время, за которое формируется сгусток в образце плазмы крови, после добавления к ней специальных активаторов этого процесса. Таким образом, оценивается степень воздействия факторов свертывания крови на образование тромба.

 

Фибриноген (по Клаусу) — количественный анализ фибриногена — базовый тест оценки системы гемостаза. Фибриноген (I фактор свертывания) в крови находится в растворенном состоянии и под воздействием тромбина превращается в нерастворимый фибрин (полимеризация). Наиболее распространенный метод определения фибриногена — определение по Клаусу. Он основан на измерении времени, необходимого для образования нерастворимого полимера фибрина в разведенной плазме после добавлении большого количества тромбина. Показатель превращения фибриногена в фибрин: чем фибриногена больше, тем интенсивнее свертывание; если его слишком мало, то сгусток (тромб) образуется недостаточного размера и не может остановить кровотечение.
Тромбиновое время (ТВ) – используется для определения времени превращения фибриногена в фибрин и оценки антикоагулянтной активности крови. Превращение фибриногена в фибрин происходит в цитратной плазме после добавления в неё тромбина и кальция. При этом скорость образования фибринового сгустка зависит, главным образом, от количества и функциональной полноценности фибриногена и присутствия в крови антикоагулянтов.

III. Методы исследования системы свертывания

Клоттинговый (англ. «сlot» – сгусток) – в пробе запускается процесс
свертывания, и определяется время образования сгустка
(механическим или оптическим способом).

Хромогенный – в пробу добавляются субстраты, специфичные
к определенному белку системы гемостаза. Когда в процессе
свертывания нарабатывается искомый белок, он отщепляет
от субстрата хромогенную часть, и по интенсивности
хромогенного излучения определяют
концентрацию и кривую наработки искомого белка.
Доступно только для оптического способа измерения.
  Иммунотурбидиметрический – анализируемый белок
связывается с взвешенными в пробе частицами,
после чего по интенсивности светорассеяния взвеси
определяют концентрацию искомого белка.
Доступно только для оптического способа измерения.

Прибор для оценки системы гемостаза — коагулометр

Работа любого коагулометра основывается на способе регистрации времени образования фибринового сгустка — механическом или оптическом.

IV. Способы исследования системы свертывания

1) Механический способ – время образование сгустка определяется по изменению вязкости реакционной смеси:
• в реакционную кювету помещается металлический шарик;

• вокруг кюветы создаётся вращающееся магнитное поле;

• шарик вращается в магнитном поле со строго фиксированной скоростью или совершает колебательные движения с фиксированной амплитудой;

• при формировании сгустка вязкость пробы растет, движение шарика замедляется;

• прибор регистрирует изменение скорости движения шарика;

• остановка шарика приводит к автоматической остановке секундомера коагулометра.

ВАЖНО! Результат механического измерения не зависит от оптической плотности пробы, поэтому в качестве образца можно использовать как цитратную плазму, так и цельную кровь, в том числе, капиллярную.

ВАЖНО! Благодаря тому, что оптическая плотность пробы не влияет на результат механического измерения, можно исследовать «сложные» пробы (иктеричные, липемичные и гемолизные), без их отбраковки и повторных назначений. Доступно только для механического способа измерения.
Механика прощает ошибки преаналитического этапа.

Что такое иктеричность?
Иктеричная проба окрашена в ярко-желтый цвет из-за высокой концентрации билирубина в крови, которая чаще всего обусловлена различными заболеваниями печени, а также приемом некоторых лекарственных препаратов. Высокая концентрация билирубина в пробе может исказить значение лабораторного показателя. Предсказать иктеричность образца, как правило, невозможно. При этом не всегда возможно и скорректировать повышенный уровень билирубина в крови пациента. Чтобы выполнить анализ иктеричной пробы и получить достоверный результат, необходимо использовать соответствующие способы и оборудование, которые позволяют исследовать иктеричную пробу без определения оптической плотности – на механических коагулометрах.

Что такое липемия?
Липемичная проба имеет желтовато-белый цвет из-за высокой концентрации липидов (жиров) в крови. Чаще всего липемия обусловлена приемом жирной пищи незадолго до сдачи крови, а также некоторыми нарушениями обмена веществ, в частности, обмена жиров. Высокая концентрация жиров в крови может исказить значение лабораторного показателя. Как избежать влияния липемии на результат? Если нарушены правила подготовки к сдаче анализов, кровь можно пересдать. Но если липемия обусловлена нарушениями метаболизма, «улучшить» образец невозможно в принципе. Чтобы выполнить анализ такой пробы и получить корректный результат, необходимо использовать соответствующие способы и оборудование (без определения оптической плотности), которые позволяют исследовать мутную пробу.

ВАЖНО! Если аномальная окраска плазмы обусловлена, например, приемом лекарств, то новое взятие образца ситуацию с качеством пробы не улучшит. Для таких пациентов получение результата возможно только механическим способом. Таким образом, только механика даст корректный результат для «сложной» пробы, качество которой улучшить слишком затратно или вообще невозможно.

ВАЖНО! Особенности механических коагулометров
позволяют успешно применять их для оценки гемостаза
как в рутинном скрининге, так и в педиатрической практике
и при контроле лечения непрямыми антикоагулянтами.

 

2) Оптический способ — детекция сгустка по изменению оптической плотности пробы:

• Исходная плазма прозрачна

• Формирование сгустка уменьшает
светопропускание через кювету

• Уменьшение светопропускания фиксируется
оптической системой прибора

ВАЖНО! Результат оптического измерения зависит от оптической плотности пробы, поэтому в качестве образца нельзя использовать цельную кровь, можно использовать только плазму. По этой же причине сложные пробы отбраковываются, а используемые реагенты должны быть прозрачными.

Оптический способ имеет лучшую чувствительность при замедленном образовании сгустка, при низком уровне фибриногена, на фоне антикоагулянтной терапии и в случае, если колебания шарика рвут слабые нити фибрина. С другой стороны, при скрининговых исследованиях (область использования полуавтоматических коагулометров) доля пациентов с такими особенностями свертывающей системы очень мала. Они обычно наблюдаются в специализированных клиниках, с другим парком оборудования и набором тестов. Поэтому вышеупомянутая особенность оптического метода не дает какого-либо ключевого преимущества в сравнении с механическим методом в области применения полуавтоматических коагулометров.

 

Механика

Оптика

Физические характеристики плазмы (мутность, желтушность)

Не влияют на результат

Влияют на результат

Анализ цельной крови

Возможен

Не возможен

Короткое время сворачивания

Всегда фиксируется

Не всегда фиксируется

Методы исследования

Клоттинговый

Клоттинговый, хромогенный, турбидиметрический

Определение сгустка при низком фибриногене

Затруднена

Возможна

Графическое отображение хода реакции

Нет

Да

II. Рациональный подход к анализатору гемостаза

Анализаторы для оценки гемостаза можно разделить две группы: полуавтоматические коагулометры и полностью автоматизированные аналитические системы. 

Полуавтоматические коагулометры — наиболее востребованные и распространенные в практике лабораторной службы в современной России, особенно в условиях чрезвычайной ситуации с распространением новой коронавирусной инфекции. 

Рассмотрим значимые характеристики полуавтоматического коагулометра на примере анализатора TS4000+ производства HTI.

Количество определяемых параметров

Современные полуавтоматические анализаторы гемостаза, в том числе TS4000+, имеют на борту уже предустановленные коагулологические методики (тесты). Как правило, это не менее 12 определяемых параметров гемостаза: основные скрининговые тесты и факторы свертывания.

В меню коагулометра TS4000+ запрограммированы 12 тестов: АЧТВ, ПВ, ТВ, Фибриноген и факторы свертывания II, V, VII, VIII, IX, X, XI, XII.


    

Метод исследования

Анализаторы гемостаза подразделяют, по способу регистрации момента образования сгустка, на оптические и механические. При этом надо помнить, что нет оптико-механического способа определения сгустка: выпускаются коагулометры оптико-механического типа, в которых технически осуществлена возможность проводить оценку гемостаза механическим или оптическим методом, который выбирает оператор. 

Коагулометр TS4000+ использует механический способ регистрации сгустка и не зависит от оптической плотности пробы.  Это делает TS4000+ универсальным – он может работать как с цельной кровью, в том числе капиллярной, так и с плазмой, в различных разбавлениях и с применением любых реагентов, даже непрозрачных. Благодаря тому, что оптическая плотность пробы не влияет на измерения TS4000+, на нем возможно тестировать «сложные» пробы (мутные и окрашенные), без их отбраковки и избыточных затрат на повторное выполнение анализа. 

Механика TS4000+ прощает ошибки преаналитического этапа.  

Напомним, что на рынке РФ представлены также оптические коагулометры, позволяющие проводить исследование гемостаза хромогенными методами. Однако, трудоемкость выполнения, низкая селективность хромогенных субстратов (которые могут реагировать с другими продуктами реакции), высокая стоимость анализа, а также небольшое количество выполняемых соответствующих тестов накладывают ограничения на массовое применение данного метода.

Производительность коагулометра

Анализатор гемостаза выбирают, ориентируясь  на  прогнозируемое количество коагулологических тестов. Предлагаемые на рынке полуавтоматические коагулометры можно  разделить  на две группы по  производительности: 2-канальные (10–20 проб в день) и 4-канальные (20–40 проб  в день). КДЛ неспециализированных лечебных учреждений обычно выполняет стандартную коагулограмму, в среднем, 4 скрининговых теста на пациента. 

Соответственно, в таких лабораториях востребованы 4-канальные полуавтоматические коагулометры, такие как TS4000+, которые способны полностью закрыть потребность в рутинных коагулограммах.

Одноканальные коагулометры не  следует  даже рассматривать, так как их функционал  ограничен,  а  производительность крайне мала.

Объем пробы 

Объем пробы для анализа – важный критерий выбора анализатора. Экономичный объем образца позволяет использовать приборы в педиатрии или при скрининговых исследованиях, а также дает возможность выполнять повторные исследования. Малый  объем  пробы существенно — в 2 раза — снижает  потребление реагентов, по сравнению с ручными  способами. Например, TS4000+ использует для анализа не более 100 мкл плазмы и 50–200 мкл реагентов.

Стоимость эксплуатации, адаптация к реагентам

При выборе коагулометра большое значение имеет как его первоначальная стоимость и комплектация, так и последующие расходы в течение всего срока эксплуатации (регулярные закупки расходных материалов к нему — кювет, шариков-мешалок и реагентов).  

Полуавтоматические коагулометры являются открытыми системами, что позволяет использовать реагенты любого производителя, без специальных адаптаций и аттестаций. 

Однако на некоторых коагулометрах производители устанавливают специальные защитные системы, не позволяющие использовать реагенты и расходные материалы сторонних компаний. В таких приборах предусмотрено использование специальных информационных карт, которые поставляются с наборами реагентов. Цель введения таких карт – защитить анализатор от несанкционированного использования не предназначенных для данного прибора реагентов. Например, полуавтоматический коагулометр «КоаТест-4» (НПЦ Астра, Россия) имеет закрытую систему по кюветам и реагентам. На сегодняшний день он адаптирован под реагенты фирмы РЕНАМ. Такая «закрытость» неудобна для лаборатории как с точки зрения привязанности к одному производителю (задержки поставок реагентов), так и с экономической точки зрения (невозможно перейти на менее затратные материалы). В целом, цена закрытого коагулометра ниже, но стоимость «родных» реагентов обычно достаточно высокая.

В отличие от «закрытых» полуавтоматических коагулометров, TS4000+ является полностью открытым бюджетным прибором как по первоначальной цене и комплектации, так и по стоимости использования в течение всего срока эксплуатации. Он открыт по реагентам, работает с наборами любых производителей, а также характеризуется низким энергопотреблением.

Удобство эксплуатации

На выбор оборудования также влияет такой фактор как эргономичность. Простота и удобство работы с прибором могут стать решающими при прочих равных характеристиках. 

Например, наличие у TS4000+ дозатора шариков, 7 позиций для реагентов с подогревом и без, 16 ячеек для предварительного прогрева образцов, возможность перепрограммирования тестовых протоколов, кнопочная клавиатура, встроенный термопринтер, интерфейс RS232 для передачи  информации на отдельный компьютер или во внутреннюю лабораторную сеть – свидетельствуют о том, что данный прибор будет эффективен и удобен в работе.


При выборе коагулометра следует тщательно изучить все его особенности, рассчитать стоимость эксплуатации в соответствии с объемом коагулологических исследований, а также поинтересоваться мнением коллег.

И сделать правильный выбор!

 


Вернуться

Лабораторные методы оценки системы гемостаза

Взятие крови

Кровь из вены следует брать иглой с широким просветом желательно без шприца. Если кровь вытекает медленно (у больных с гипотонией, в терминальном состоянии, при взятии тонкой иглой у детей), забор крови можно осуществлять с использованием шприца. Игла должна быть сухой и силиконированой, шприц и пробирки также должны быть сухими и силиконироваными (или пластиковыми), чтобы максимально снизить контактную активацию факторов свертывания. После наложения жгута и прокола вены первые 0,5 — 1,0 мл вытекающей крови не используют для коагулологических исследований, т.к. в нее попадают тканевая жидкость и фрагменты тканей и клеточных элементов, которые значительно искажают результаты коагулограммы. Эту кровь можно использовать для других исследований (определение группы крови, биохимические тесты и т.д.). Чтобы избежать венозного застоя и тканевой гипоксии (они активируют процессы и свертывания крови, и фибринолиза), после взятия первой порции необходимо слегка расслабить жгут на 2-3 сек и вновь затянуть его. В результате застоявшаяся в венах предплечья кровь сразу же заменяется новой (без тканевых примесей). Время взятия крови не должно превышать одной минуты, так как в медленно вытекаюшей крови изменяется соотношение между коагуляционными и фибринолитическими компонентами.

В качестве антикоагулянта используют забуференный раствор 3,8%-го цитрата натрия в соотношении 1:9. Это соотношение изменяется в зависимости от показателя гематокрита. Уменьшение количества антикоагулянта может спровоцировать ускорение свертывание крови, увеличение его количества, соответственно, увеличение ПТВ, АЧТВ и т.д.

Исследование должно быть выполнено тотчас после центрифугирования, плазму можно хранить не более 2-х часов при температуре +40С. Если при исследовании гемостаза используют иммуннологичекие или колориметрические ( с применением хромогенных субстратов) методы, плазму можно хранить в замороженном состоянии при -20 0С до 14-ти суток.

Комплекс лабораторных тестов, характеризующих вторичный гемостаз называется коагулограммой. Комплекс лабораторных тестов, характеризующих и первичный, и вторичный гемостаз называется гемостазиограмма. Она кроме показателей свертывания крови, включает лабораторные тесты, отражающие состояние сосудистой стенки, количество и качество тромбоцитов.

1 Исследование начальных этапов коагуляционного гемостаза Время свертывания по Ли-Уайту

Принцип: определяют время свертывания цельной нестабилизированной венозной крови при 37 оС с поправкой на то, что перемешивание крови в пробирке искусственно ускоряет гемостаз.

Hормальные величины: 5-7 мин.

Активированное частичное тромбопластиновое время (АЧТВ)

Hорма: 35-45 сек.

Принцип: определяют время свертывания бедной тромбоцитами цитратной плазмы при добавлении оптимального количества кальция коалина и кефалина.

Протромбиновое время (протромбиновый индекс – ПИ)

ПТВ – это показатель внешней системы активации протромбиназы. Оно зависит от содержания в плазме факторов VII, V, Х, а также протромбина и фибриногена.

Принцип: определяют время свертывания плазмы бедной тромбоцитами при добавлении избытка тромбопластина и хлорида кальция. Согласно международным требованиям, тромбопластин должен быть стандартизован фирмой-изготовителем и иметь следующие характеристики:

1. В нормальной контрольной плазме протромбиновое время должно быть в пределах 11-15 сек (в среднем около 12 сек).

2. Препарат тромбопластина должен быть хорошо растворимым, он готовится простым разведение дистиллированной водой или раствором хлорида кальция (0,277%).

3.На маркировке тромбопластин должен иметь международный индекс чувствительности – МИЧ (Internacional Sensitivy Index, ISI). МИЧ характеризует степень чувствительности тромбопластина к дефициту факторов протромбинового комплекса.

Способы выражения ПТВ

1. Протромбиновый индекс (ПТИ)

протромбиновое время референтное

ПТИ = ————————————————— х 100% (Норма= 80-120%)

протромбиновое время пациента

протромбиновое время пациента

R = ———————————————— (Норма = 0,8-1,2)

протромбиновое время референтное

4. Международный нормализационный индекс (МНО) или Internacional Normalised Index (INR)

INR учитывает качество используемого тромбопластина. Активность применяемого тромбопластина характеризует международный индекс чувствительности (Internacional Sensitivy Index, ISI). Референтный препарат человеческого мозгового тромбопластина имеет ISI=1,0.

INR = (Ratio)N, где N = ISI (Норма = 1,0-1,4)

Соотношение показателей следующее:

ПТВ увеличено, R увеличен ,INR увеличен, ПТИ снижен.

Исследования свертывающей системы

Свертывающая система – одна из многих систем, обеспечивающих нормальную жизнедеятельность организма, его целостность. Система гемостаза принимает участие не только в поддержании жидкого состояния крови в сердечно-сосудистой системе, резистентности стенки сосудов и в остановке кровотечения из поврежденного сосуда, но и оказывает влияние на гемореологию, гемодинамику и проницаемость сосудов, участвует в заживлении ран, воспалении, иммунологической реакции, имеет отношение к неспецифической резистентности организма.  Активация системы гемостаза под влиянием физиологических и экстремальных факторов является защитной реакцией организма. При активации коагуляционного звена системы создаются благоприятные условия для образования гемостатического тромба и остановки кровотечения у места повреждения кровеносных сосудов, а при одновременной активации фибринолитического звена – условия, препятствующие распространению тромба в сосуде от места его образования и обеспечивающие фибринолизис.

Содержание в крови отдельных факторов свертывания, естественных антикоагулянтов и активность  фибринолиза отражается показателями тестов, совокупность которых называют коагулограммой. 

Расстройства гемостаза могут быть причинами самостоятельных заболеваний, но чаще всего они играют очень серьёзную роль в течении, а иногда и в исходе других заболеваний.  Нет такой медицинской дисциплины, где бы врач не сталкивался с тромбозом, диссеминированным внутрисосудистым свертыванием крови или кровотечением.

Определение показателей свертывающей системы является очень информативным для оценки состояния, прогноза и эффективности терапии многих заболеваний.

В клинической практике НМИЦ онкологии им. Н.Н. Петрова чаще всего используются  следующие показатели коагулограммы:

— протромбиновое время
— процент протромбина по Квику
— МНО
— АПТВ (активированное парциальное тромбопластиновое время)
— тромбиновое время
— фибриноген
— антитромбин  III

— D-димер

Исследования  свертывающей системы выполняются на автоматическом  коагулогическом анализаторе в Отделении лабораторной диагностики.

В НМИЦ онкологии возможно проведение такого вида исследования, как тромбоэластография (ТЭГ).  Этот метод исследования позволяет выявить не только нарушения в отдельных звеньях системы гемостаза, но и проанализировать клеточно-плазменные взаимодействия посредством изучения физических свойств тромба с получением интегративных графических  данных.

Прием антикоагулянтов пациентами – важный факт, о котором необходимо сообщать перед исследованием, т.к. наличие их в крови искажает результаты коагулограммы.

Результаты исследования готовы в день сдачи анализов.

Оценка состояния системы гемостаза: цена, записаться на прием

Гемостаз обеспечивает защиту от тромбоза и кровотечения.
 
Оценка системы гемостаза показана:
— на этапе планирования беременности с целью профилактики осложнений беременности и предотвращения ранних эмбриональных потерь;
— на этапе подготовки к ЭКО с целью повышения эффективности процедуры;
— при наличии сердечно-сосудистых заболеваний;
— при плохой свертываемости крови;
— при обильных менструациях;
— перед проведением операций, гормональной терапии;
— в случаях, когда регулярно принимаются гормональные контрацептивы;
— во время беременности.

Исследование системы гемостаза позволяет выявить малейшие отклонения от нормы, а своевременно принятые меры помогут избежать серьезных проблем. Первичный анализ системы гемостаза называется коагулограмма или гемостазиограмма.

Способность организма останавливать кровотечение – это одна из жизненно-важных его реакций. Отвечает за неё система гемостаза. Если в ней происходит сбой, то появляется риск тромбоза, а значит – здоровье под угрозой. Тромбы запечатывают сосуды, нарушается циркуляция крови, клетки организма лишаются необходимых для жизни питательных веществ и кислорода. Последствиями тромбоза могут быть инфаркт миокарда или ишемический инсульт. По данным ВОЗ, эти заболевания занимают первое место в мире.

Факторы гемостаза, принимают участие в процессах заживления тканей, влияют на состояние стенки сосудов, регулируют обмен веществ через капилляры, обеспечивают процесс имплантации плодного яйца в полости матки, формировании плаценты.

Полноценное функционирование системы гемостаза зависит от многих факторов: состояния стенок сосудов, достаточного количества и полноценности тромбоцитов в крови, состояния плазменных факторов свертывания и компонентов противосвертывающей системы.

Патология этой системы обычно обнаруживается в критических ситуациях: при операциях, травмах, тяжелых физических нагрузках, истощении, при проведении процедур ЭКО, при беременности, а часто становится и причиной осложнений беременности — плацентарная недостаточность, привычное невынашивание, гестоз, отслойка плаценты, гибель плода.

Факторами, которые провоцируют развитие приобретенных изменений гемостаза, являются: хронические инфекции, травмы, стрессы, ожирение, онкологические и эндокринные заболевания, употребление некоторых лекарственных средств, курение. Но есть и врожденные нарушения системы гемостаза – мутации.

Роль тромбоэластографии в трансфузионной терапии посттравматической коагулопатии

А. Ю. Буланов

Федеральное государственное бюджетное учреждение Гематологический научный центр Минздравсоцразвития РФ, г. Москва

 

Трансфузиология № 4, 2011

 

 

Одним из наиболее частых и тяжелых осложнений травмы является коагулопатия. Основой терапии этого состояния является трансфузия свежезамороженной плазмы. Представленная статья обобщает информацию о патогенезе посттравматической коагулопатии и принципах коррекции, основанных на тромбоэластографическом мониторинге гемостаза.

Ключевые слова: травма, коагулопатия, тромбоэластография, свежезамороженная плазма.

 

В число наиболее тяжелых осложнений травмы входит коагулопатия, крайним выражением которой является ДВС-синдром. Нарушения гемостаза развиваются в 25-35% случаев и являются частой причиной смертности пациентов с тяжелой травмой. Патогенез посттравматической коагулопатии и ДВС-синдрома многогранен. К числу ведущих патогенетических факторов относится потребление компонентов системы гемостаза на остановку кровотечения и их потеря с истекающей кровью, активация коагуляционного каскада и фибринолиза в связи с повреждением тканей, изменения, обусловленные шоком, ацидозом, гипотермией.

Основным компонентом трансфузионной терапии постравматической коагулопатии на современном этапе является СЗП. Необходимость ее применения не вызывает сомнений у специалистов. Жаркие дебаты посвящены определению показаний и срокам назначения плазмы, критериям ее эффективности. Подходы к назначению СЗП в настоящее время можно разделить на три группы: клинические (основа — наличие и выраженность клинических проявлений коагулопатии, в первую очередь геморрагического синдрома), ситуационные — исходя из тяжести травмы, объема кровопотери (чаще всего назначение СЗП в этом случае соотносят с потребностью в эритроцитах) и лабораторные (основа — наличие лабораторных признаков коагулопатии). Экстраполируя современную классификацию методов диагностики перечисленные подходы можно определить как качественные, полуколичественные и количественные соответственно.

Чаще всего при травме и острой кровопотере в качестве критерия для назначения плазмы используется потребность в трансфузии эритроцитов. Представители отечественной трансфузиологической Школы являются сторонниками раннего и высокообъемного использования СЗП в соотношении с эритроцитами 3:1. В Европе в 90-е годы прошлого века использовался протокол компонентной терапии острой кровопотери, содержащий практически диаметрально противоположные принципы: позднее (при достижении объема кровопотери более 80% ОЦК) назначение СЗП в соотношении с эритроцитами 1:4. В последние годы больше сторонников появилось у принципа «золотой середины». Чаще всего специалистами обсуждается соотношение основных трансфузионных сред 1:1. К такому выводу приходят J.L. Kashuk с соавт. на основании опыта работы с хирургическими больными. P.I. Johansson на основании анализа 15 исследований, включающих более 4500 больных и данных собственной исследовательской группы демонстрирует целесообразность раннего объемного использования плазмы.

J.C. Duchesne с соавт. показали снижение смертности, связанное с трансфузиями СЗП в соотношении 1:1 с эритроцитами против 1:4 на 20-65% при боевой травме и на 11,8-21,2% при травмах мирного времени. Но мнения ученых далеко неоднозначны. Так, T.M. Scalea с соавт. неувидели улучшения исходов, связанного с ранним агрессивным использованием СЗП при травме. К выводу об эффективности трансфузии СЗП при посттравматической коагулопатии в меньшем объеме и, соответственно, в меньшем соотношении с эритроцитами пришли R. Davenport и соавт. 

В целом, анализ современной литературы демонстрирует отсутствие тенденции к разрешению противоречий вокруг оптимального соотношения основных трансфузионных сред при травме и кровопотере. Напрашивается вывод о несовершенстве обсуждаемого «полуколичественного» подхода к назначению плазмы. Очевидно, он вполне оправдан как исходная точка. Но требует вслед за собой обязательного контроля, желательно максимально объективного, эффективности выполненной трансфузии.

Следует учесть и такой фактор, как нестандартизованность СЗП как лекарственного средства. На всех этапах, начиная от производственного сырья до разморозки и непосредственного использования, она тесно связана с «человече-ским фактором». Следуя стандартнымпринципам терапии, мы далеко не всегдаможем быть уверены в стандартности ис-пользуемых нами трансфузионных сред,в частности плазмы, что так же говорито необходимости объективных критериевее назначения.

Современная медицина имеет в своем арсенале широкий спектр лабораторных тестов контроля гемостаза, применимых и для контроля эффективности трансфузионной терапии. Из традиционных коагулологических тестов для оценки показанийи эффективности СЗП чаще используют хронометрические показатели свертывания АЧТВ и МНО (форма представления протромбинового времени) и содержание фибриногена, реже XIIa-зависимый фибринолиз и активность антитромбина III. Следует отметить, что перечисленные тесты ни в наборе, ни, тем более, в изолированном виде не позволяют полноценно оценить характер изменений гемостаза при большинстве критических состояний. Более объективны в этом плане функциональные методы оценки гемостаза, из которых на сегодняшний день на первый план выходит тромбоэластография.

Метод не нов. Впервые ТЭГ была предложена H. Harter’ом в 1948 г.. Ссередины 90-х годов прошлого века наблюдается ренессанс метода, связанный с использованием современных компьютерных технологий. Суть ТЭГ состоит в оценке состояния системы гемостаза путем исследования вязко-эластическихсвойств тромба. После компьютерной обработки процесс тромбообразованияи фибринолиза принимает вид характерной кривой (рис 1). Для ее описания предложено порядка 20 показателей, основные из которых это интервалы r иk, угол α, МA (максимальная амплитуда ТЭГ), 30LY. Первые три показателя характеризуют главным образом состояние системы свертывания. Причем отмечается четкое их соответствие фазам тромбообразования, описанным в клеточной (cell-base) модели свертывания крови (рис. 2). Интервал r отражает инициацию тромбообразования (initiation), k -фазу усиления (amplification), а уголα — фазу распространения (рropagation). Максимальная амплитуда в основном зависит от функции тромбоцитов (на 80%), в меньшей степени от фибриногена. При необходимости можно выделить вклад каждого из компонентов в МA. Для этого существует относящийся к специальным методикам ТЭГ тест на активный фибриноген (functional fibrinogen). Вклад фибриногена, выявленный этим тестом в высокой степени коррелирует с концентрацией фибриногена, определенной по Клаусу, что можно учитывать при отсутствии возможности выполнить данный тест. Показатель 30-минутного лизиса характеризует активность фибринолиза. Ошибкой было бы обойти вниманием еще один показатель — коагуляционный индекс (CI). Он является расчётным, исходя из r, k, α и МA и характеризует направленность изменений гемостаза и степень их компенсации.

Рис. 1.

Тромбоэластограмма — графическое представление процессатромбообразования и фибринолиза


А — Принципиальная схема тромбоэластограммы

Б — пример нормальной тромбоэластограммы

Рис. 2.

Клеточная модель (cell-base) свертывания крови


TF — тканевой фактор; II, X — факторы свертывания крови; Va, Xa, VIIa — активированные факторы свертывания. Стандартные стрелки обозначают превращения, каплевидные — стимулирующее влияние. Согласно современным представлениям о гемостазе, в биохимическом процессе свертывания крови существенная роль отводится и клеткам, в первую очередь тромбоцитам, что отражено в так называемой «клеточной» (cell-base) модели свертывания крови. Согласно ей, в процессе свертывания выделяют три фазы. Как известно, в кровотоке постоянно циркулирует небольшое количество активированного VII фактора свертывания, но это не сопровождается активацией коагуляционного каскада. Для запуска процесса свертывания необходим контакт VIIa с тканевым фактором,что происходит при разрушении эндотелия сосудов. Комплекс TF-VIIa активирует X фактор, который в свою очередь в комплексе с активным V фактором стимулирует появление небольшого количества тромбина. Этот комплекс процессов составляет фазу иницации (initiation). Задачей тромбина на данном этапе является активация тромбоцитов, и только на это хватает его концентрации в этот момент. Работа X фактора по поверхности активированных тромбоцитов отличается существенно большей производительностью (фаза усиления или amplification). Результат — генерация огромного количества тромбина («тромбиновый взрыв»), которого уже становится достаточно для выполнения основной функции- стимуляции главного этапа тромбообразования — перехода фибриногена в фибрин (фаза пролонгации — prolongation).

В настоящее время в мире существуют две основные модификации тромбоэластографии: это классическая ТЭГ и тромбоэластометрия (РОТЭМ). Методики имеют определенные технологические различия, но объединены общим принципиальным устройством. Присутствует аналогия и в основных показателях ТЭГ иРОТЭМ (табл. 1).

Таблица 1

Основные показатели ТЭГ и РОТЭМ

Параметры ТЭГ Параметры РОТЭМ
r (reaction time) CT (clotting time)
k (kinetics) CFT (clot formation time)
α α
mA (maximum amplitude) MCF (maximum clot firmness)
LY30 (amplitude reduction 30 min after mA) CL30 (amplitude reduction 30 min after MCF)

 

Суть тромбоэластографии в интегральной оценке состояния системы гемостаза. Принципиальное отличие ТЭГ от стандартных коагулологических тестов состоит в том, что из известных компонентов системы гемостаза ТЭГ одновременно оценивает четыре основных (коагуляционный каскад, тромбоциты, против освертывающие механизмы и систему фибринолиза), причем оценивает их во взаимодействии. За пределами нашего внимания остается только сосудистая стенка. Другими словами, ТЭГ позволяет, не вдаваясь в тонкие подробности, оценить состояние гемостаза в целом, наличие и степень компенсации расстройств в этой системе, общую динамику при критических состояниях и ответ на лечебные мероприятия.

ТЭГ имеет ряд существенных преимуществ перед стандартными гемостазиологическими тестами. К ним относится: работа с цельной кровью, быстрота выполнения (с целью ускорения теста возможна активация процесса свертывания каолином либо комплексом каолина и тканевого фактора), оценка гемостаза при реальной температуре пациента, возможность выявления гиперфибринолиза.

Область клинического применения ТЭГ можно очертить следующим образом:

• скрининг гемостаза в предоперационном периоде, перед инвазивными процедурами;

• дифференциальная диагностика хирургических и нехирургических кровотечений;

• динамический контроль гемостаза при кровопотере и критических состояниях;

• динамический контроль гемостатической терапии;

• динамический контроль антиагрегантной и антикоагулянтной терапии.

Большинство из вышеперечисленных пунктов, без сомнения, актуально для пациентов с тяжелой травмой. Основная функция тромбоэластографии при этой патологии — «отсечь» необоснованные трансфузии и отследить эффективность проводимой терапии и необходимость ее коррекции при наличии значимой коагулопатии. Нагляднее всего это можно проиллюстрировать на примере кровотечений. Так в одной из ранних работ по тромбоэластографии наша исследовательская группа продемонстрировала возможность безопасного снижения частоты интраоперационных трансфузий СЗП при использовании данной методики более чем в 2 раза. Специалисты из нейрохирургической клиники показали, что применение тромбоэластографии для оценки системы гемостаза при операциях со значительной по объему кровопотерей позволяет снизить частоту использования донорской СЗП практически в 4 раза без ухудшения результатов лечения. P.I. Johansson’оми соавт. опубликован анализ результатов 20 клинических исследований об использовании ТЭГ в хирургической клинике. Авторами выявлено снижение частоты трансфузий СЗП на основании данных ТЭГ за счет перераспределения «гемостатических обязанностей». Как причина нарушений гемостаза в периоперационном периоде ТЭГ нередко выявляла избыточный фибринолиз, остаточную гепаринизацию, изолированную гипофибриногенемию, для коррекции которых использовались более специфичные меры воздействия. Применялись ингибиторы фибринолиза, нейтрализация гепарина, введение концентрата фибриногена или криопреципитата. В другой работе того же автора, основанной на аудите собственной трансфузионной практики и ее изменения на основе широкого внедрения ТЭГ, продемонстрировано, напротив, увеличение объема трансфузий СЗП. Существенно увеличилась и частота трансфузий концентрата тромбоцитов. При этом значимо улучшились исходы лечения больных с кровотечениями, о чем можно судить по снижению смертностис 31,5 до 20,4%. По результатам исследования сформирован так называемый «стандартный транфузионный пакет» для лечения кровотечений, состоящий из 5 доз эритроцитов (как определяющей величины), 5 доз СЗП и 2 концентратов тромбоцитов. Ряд других авторов говорят об изменении трансфузионной тактики в связи с использованием ТЭГ. Хотя чаще звучит снижение трансфузионной нагрузки, как эффект применения данного метода мониторинга гемостаза, правильнее было бы назвать этот процесс оптимизацией трансфузионной терапии.

Предлагать клинические рекомендации, основанные только на лабораторных методах дело сложное и не благодарное. Тем не менее, нельзя не упомянуть существующие алгоритмы трансфузионной терапии, основанные непосредственно на данных ТЭГ. В качестве иллюстрации приведем один из них (табл. 2).

Таким образом, мультифакторность патогенеза посттравматической коагулопатии, недостаточная стандартизованность СЗП, как основного трансфузионного средства ее коррекции, обуславливают необходимость мониторинга системы гемостаза при этой патологии. Оптимальным методом такого мониторинга на сегодняшний день является тромбоэластография.

Таблица 2

Алгоритм лечения продолжающегося кровотечения на основании данных ТЭГ

Параметр ТЭГ* Терапия
r 11-14 мин Трансфузия СЗП 10 мл/кг
r > 14 мин Трансфузия СЗП 20 мл/кг
mA 46-50 мм Трансфузия 1 концентрата тромбоцитов
mA < 46 мм Трансфузия 2 концентратов тромбоцитов
Угол α < 52 Трансфузия СЗП 10 мл/кг или концентрат
фибриногена (или криопреципитат)
LY30 > 8% Антифибринолитики (транексам 10 мг/кг)

* Приведены показатели для ТЭГ, активированной каолином.

Эксперт: тромбодинамика позволяет полнее оценить изменения в свертывающей системе крови — Пресс-центр

Портфельная компания РОСНАНО «ГемаКор» и Белгородская областная клиническая больница реализуют пилотный проект по использованию метода тромбодинамики

Российский инновационный метод тромбодинамики в отличие от других методов исследования свертываемости крови дает возможность более полно оценивать изменения в свертывающей системе крови, сообщила ТАСС профессор кафедры внутренних болезней Московского государственного медико-стоматологического университета имени А. И. Евдокимова Светлана Бернс.

«Принципиальное отличие теста „Тромбодинамика“ от большинства лабораторных методов оценки плазменного гемостаза заключается в возможности оценки работы системы гемостаза не локально, с изучением отдельных звеньев, а более масштабно. Такой интегральный подход позволяет выявить изменения не просто одного или нескольких факторов свертывания, что не всегда адекватно отражает патологию, а дает возможность существенно более полно оценить картину происходящих изменений в свертывающей системе крови», — рассказала Бернс.

Ранее в лабораторной практике использовались и в настоящее время применяются тесты, реализующие подобный подход, добавила эксперт. «Это тромбоэластография и тест генерации тромбина — так называемые глобальные тесты. Однако и в том, и в другом случае имеются определенные недостатки, что и продиктовало появление теста „Тромбодинамика“», — указала Бернс.

Портфельная компания РОСНАНО «ГемаКор» и Белгородская областная клиническая больница реализуют пилотный проект по использованию метода тромбодинамики. Исследование станет доступно на бесплатной основе, по направлению врача и при предъявлении полиса ОМС. Компания установит в больнице оборудование, поставит расходные материалы, а также обучит сотрудников лаборатории постановке соответствующего теста. По итогам проекта стороны определят потребность в таком тесте и разработают программу по его внедрению в здравоохранение в Белгородской области в 2021 году.

По словам эксперта, внедрение метода тромбодинамики в практику государственной системы здравоохранения и систему ОМС представляется обоснованным, однако этот метод не должен использоваться по отношению «абсолютно ко всем» пациентам.

»Принимая во внимание увеличение популяций пациентов с повышенным риском тромбообразования, принимающих различные антикоагулянты, внедрение метода в практику государственной системы здравоохранения и систему ОМС представляется логичным и обоснованным. Безусловно, использование данного метода не должно осуществляться рутинно, абсолютно всем пациентам, без определенных показаний. Накопление опыта по применению этого теста должно реализоваться в формирование определенных групп пациентов, у которых использование теста „Тромбодинамика“ окажется полезным в плане раннего выявления тромботических рисков, что в итоге отразится на прогнозе заболевания и позволит улучшить качество жизни наших пациентов», — резюмировала Бернс.

Назначение теста

Тест «Тромбодинамика» предназначен для оценки состояния системы гемостаза у пациентов с онкогематологическими заболеваниями, после больших хирургических вмешательств, а также у пациенток с осложненным акушерским анамнезом. Кроме того, показанием для проведения тромбодинамики будут другие патологии с высоким процентом тромботических и геморрагических осложнений по усмотрению врачей.

В основе разработки лежит многолетняя фундаментальная работа по исследованию механизмов свертывания крови. В 2010 году разработку инновационного теста поддержала РОСНАНО. В настоящее время тест доступен более чем в 130 клиниках России, с 2012 года в стране проведено более 250 тыс. тестов.

Оценка плазменного гемостаза у больных с послеоперационным венозным тромбозом

Сердечно-сосудистые заболевания являются ведущей причиной смертности во многих странах мира, и, по прогнозам ВОЗ, их доля в структуре смертности будет возрастать. В отличие от экономически развитых стран в развивающихся странах, в том числе в РФ, люди от сердечно-сосудистых заболеваний умирают на 15-25 лет раньше [1].

Роль системы гемостаза в обеспечении жизнедеятельности организма заключается в нормальном восполнении и циркуляции кровеносного русла, обеспечении нормального кровоснабжения органов, сохранении необходимого объема циркулирующей крови и поддержании жидкого агрегатного состояния крови [2].

Триада Вирхова гласит о том, что активация процесса свертывания крови происходит в результате изменения ее свойств (гиперкоагуляция), повреждения сосудистой стенки, замедления тока крови (стаз).

Развитие операционных технологий современной сосудистой хирургии позволяет восстановить работу кровотока при значительных патологических процессах на нижней конечности. Значимую роль при хирургических вмешательствах на магистральных сосудах нижней конечности играет использование аутовенозного шунтирования [3]. На восстановление функции конечности в послеоперационном периоде влияет также развитие тромботического процесса в венах. Венозные тромбозы — одна из наиболее частых причин смерти у больных после хирургических вмешательств [4]. Высокая распространенность этих осложнений диктует необходимость поиска средств обнаружения первых признаков тромбоза [5].

Актуальность этой проблемы требует изучения процессов, лежащих в основе рабочих функций системы гемостаза, включающиx необходимоe взаимодействие клеток крови для нормального обеспечения функционирования организма.

Цель исследования — изучение системы плазменного гемостаза у больных с послеоперационными венозными тромбозами после аутовенозного шунтирования по поводу окклюзионно-стенотических поражений артерий нижних конечностей.

Объект исследования — показатели плазменного гемостаза у больных с послеоперационными венозными тромбозами.

Материал и методы

На базе отделения сосудистой хирургии ФГУ «Российский геронтологический научно-клинический центр Росздрава» Москвы и ФГУ «1586 окружной военный клинический госпиталь МВО МО РФ» были обследованы 99 больных, перенесших аутовенозное шунтированиe по поводу окклюзий артерий нижних конечностей. Пациенты были разделены на группы в зависимости от возраста больных и локализации окклюзии (табл. 1). Возраст больных колебался от 25 до 74 лет (средний возраст 54,6±4,8 года). Все пациенты были мужского пола, 83 (83%) находились в трудоспособном возрасте (от 25 до 60 лет).

В послеоперационном периоде больным выполняли ультразвуковое ангиосканирование с цветовым допплеровским кодированием. Для оценки плазменного гемостаза были исследованы следующие параметры: АЧТВ — активированное частичное тромбопластиновое время; ПТВ — протромбиновое время; MHO — международное нормализованное отношение; ТВ — тромбиновое время; ФГ — фибриноген.

Статистическая обработка данных проведена с использованием критерия Манна-Уитни.

Венозный тромбоз после операции был диагностирован методом ультразвукового ангиосканирования с цветовым допплеровским картированием, флебографией. Локализация тромбоза распределилась следующим образом: 9 случаев — тромбоз вен голени, 4 — тромбоз подколенной вены; 4 — тромбоз поверхностной бедренной вены. По распространению процесса во всех случаях был диагностирован восходящий тромбоз, когда тромб зарождался в венах голени.

Результаты и обсуждение

По данным ультразвукового сканирования, у 23 (23,2%) пациентов от общего числа всех оперированных развился венозный тромбоз, причем в 1-й группе процент осложнений составил 26,09, во 2-й — 30,43, в 3-й — 43,48. Столь высокий процент осложнений в 3-й группе, вероятно, связан с инволютивными возрастными изменениями, снижением защитных свойств организма, слабой реакцией на проводимое лечение. Сопутствующая патология также существенно увеличивает риск появления венозного тромбоза у пациентов в возрасте 60-74 лет.

Результаты лабораторных исследований показали, что большинство параметров плазменного гемостаза у обследованных больных выходили за пределы нормальных значений (табл. 2).

Наиболее чувствительный параметр свертываемости крови — АЧТВ. Уменьшение этого параметра ниже нормальных значений свидетельствует о склонности к тромбообразованию; показатели по группам составили 30,6±0,77; 31,58±1,03; 28,43±1,12 соответственно.

Величина ТВ была снижена во 2-й (9,68±0,11 с) и 3-й (9,04±0,26 с) группах, что свидетельствовало о риске тромбообразования. В 1-й группе данный показатель (10,02±0,17 с) находился на нижней границе нормы.

Исследование количества основного компонента кровяного сгустка при гемостазе — ФГ продемонстрировало его повышенный уровень. Показатели ФГ во всех группах достоверно различались от нормальных значений (p <0,05).

Снижение величины ПТВ во всех группах указывало на наличие гиперкоагуляции (повышенное свертывание крови). Нами отмечена статистическая значимость различий между величиной ПТВ во всех группах в сравнении с нормой (p<0,05).

Величины МНО свидетельствовали о недостаточном эффекте противосвертывающих средств и указывали на сохраняющийся повышенный риск тромбообразования.

Инициирующими факторами при развитии послеоперационного венозного тромбоза являются повреждение стенки сосуда, изменение функционального состояния системы гемостаза и замедление кровотока. При этом нарушается питание эндотелия сосудов, создаются условия для оседания и прилипания к стенке сосуда тромбоцитов, задержки тромбина и фибрина, образующихся при активации системы гемостаза.

Изучение системы гемостаза является дополнительным методом диагностики венозных тромбозов при обследовании в послеоперационном периоде больных с окклюзией крупных магистральных сосудов после хирургического вмешательства. Больные, перенесшие вмешательство на магистральных сосудах нижних конечностей, должны находиться под наблюдением у сосудистого хирурга с целью мониторинга состояния кровообращения в конечности и раннего выявления осложнений.

Конфликт интересов отсутствует.

Участие авторов:

Концепция и дизайн исследования — Т.П., Р.Ш.

Сбор и обработка материала — Т.П., Р.Ш.

Статистическая обработка — Т.П., Р.Ш., О.Л.

Написание текста — Т.П., Р.Ш.

Редактирование — Р.Ш., О.Л.

Анализы различных аспектов гемостаза — что они измеряют?

Abstract

Гемостаз — это сложный процесс, на который влияет множество факторов, включая как клеточные, так и плазменные компоненты. Это многоступенчатый процесс, который начинается с прилипания тромбоцитов к поврежденному эндотелию и заканчивается фибринолизом сгустка. Существует несколько доступных методов для изучения различных аспектов гемостаза, включая адгезию, агрегацию, коагуляцию и фибринолиз. В этом обзоре описаны различные методы, измеряемые аспекты гемостаза и их ограничения.Обсуждаемые методы включают методы исследования адгезии (например, PFA-100, анализатор конусов и тромбоцитов (let) и перфузионные камеры) и агрегации (например, Multiplate, VerifyNow и Plateletworks). Кроме того, представлены принципы вязкоупругих гемостатических анализов, а также методы, которые могут анализировать аспекты гемостаза в образцах плазмы или богатой тромбоцитами плазмы (образование тромбина, общий потенциал гемостаза и анализатор тромбодинамики).

Ключевые слова: Коагуляция, гемостаз, тромбоциты, анализы коагуляции, тестирование функции тромбоцитов

Введение

Гемостаз — это сложный процесс, включающий адгезию тромбоцитов к поврежденному эндотелию, образование тромбоцитарной пробки (агрегацию), формирование фибриновой сети для стабилизации пробки, ретракции сгустка и, наконец, фибринолиза.Кроме того, все эти процессы протекают в потоке и контролируются и регулируются факторами, высвобождаемыми из окружающего эндотелия. Хирургическое вмешательство может вызвать коагулопатию из-за ацидоза, гипотермии и гемодилюции и связано с повышенной фибринолитической активностью, что требует мониторинга для определения направления трансфузионной терапии [1,2].

Таким образом, «идеальный» анализ гемостаза должен предпочтительно измерять все эти процессы при соответствующих условиях сдвига и своевременно давать результаты. Действительно, существует множество различных методов для измерения одного или нескольких из множества различных событий гемостатического процесса и функции тромбоцитов.Однако ни один из доступных в настоящее время методов не позволяет измерить все эти процессы, и все они имеют свои плюсы и минусы. В этом обзоре будет описан ряд анализов, используемых для оценки различных аспектов гемостаза с технической точки зрения, с выделением их методологии и того, что они могут и не могут измерять, с выводами, обобщенными в таблице.

Таблица 1

Аспекты глобальных анализов гемостаза

Анализ Тип образца Адгезия Агрегирование Коагуляция Эндотелий Сдвиг №цитат
Плазма PRP WB Нач. Опор. Эласт. Лизис
Многопластинчатый + + + 250
VerifyNow + + 476
Plateletworks + + 26
Удар-R + + + + 121
PFA-100 + + + + 745
Перфузионные камеры + + + (+) (+) (+) + 630
ТЭГ (+) + + + + + 4016
ROTEM (+) + + + + + 3932
ReoRox (+) + + + + + + 28
Sonoclot (+) + + + + + + 113
Образование тромбина + + + + 118
OHP + + (+) + 23
Тромбодинамика + + + + + 11

Тесты первичного гемостаза

Агрегометрия

В дополнение к классической светопропускающей агрегометрии, которая требует подготовки богатой тромбоцитами плазмы, что ограничивает ее полезность в острых клинических условиях, коммерческие тесты для оценки агрегации в цельной крови.В целом, тесты были разработаны для мониторинга реакции на лечение распространенных классов антитромбоцитарных препаратов, аспирина, P2Y 12 (АДФ-рецептор) — антагонистов и антагонистов GPIIb / IIIa путем добавления арахидоновой кислоты, АДФ или сильных тромбоцитов. агонист, такой как пептид, активирующий рецептор PAR1 тромбина (TRAP, аминокислотная последовательность SFLLRN) или коллаген, соответственно.

В Multiplate® (Roche, Швейцария) [3] образец крови (антикоагулированный цитратом или гирудином) добавляется в одноразовую кювету, содержащую электроды, к которым тромбоциты прилипают и объединяются после добавления коллагена, TRAP, ADP, арахидоновой кислоты или ристоцетин.Это вызывает зарегистрированное изменение импеданса. Multiplate предназначен для измерения агрегации в цельной крови, но может использоваться для суспензий тромбоцитов [4].

VerifyNow® (Accumetrics, США) — это полностью автоматизированный прибор на основе картриджей для оценки антитромбоцитарных препаратов с тремя типами тестовых картриджей, содержащих АДФ, арахидоновую кислоту или TRAP. Цитрированная цельная кровь смешивается с агонистом тромбоцитов и гранулами, покрытыми фибриногеном. Активированные тромбоциты будут связываться с гранулами и агглютинировать, и увеличение светопропускания, связанное с этим, будет регистрироваться [5].

Наборы для агрегации Plateletworks® (Helena Laboratories, США) основаны на сравнении количества тромбоцитов в контрольной пробирке с ЭДТА и после агрегации с АДФ, арахидоновой кислотой или коллагеном в цитратных пробирках. Результаты выражаются в% агрегации или% ингибирования [6].

За последние годы в ряде исследований была предпринята попытка установить оптимальный тест и диапазон реактивности тромбоцитов, связанный с максимальной защитой от тромбоза и минимальным риском кровотечения.Сообщенная корреляция между реактивностью тромбоцитов во время лечения и исходом также предполагала использование тестирования функции тромбоцитов для персонализации антиагрегантной терапии. В этой области также было проведено несколько исследований, но основные клинические испытания не смогли продемонстрировать преимущества такой стратегии в улучшении клинических исходов (недавно обзор [7,8]).

Анализы адгезии

Классический тест на адгезию заключается в подсчете тромбоцитов до и после прохождения гепаринизированной крови через колонку, заполненную стеклянными шариками.Коммерчески доступные инструменты включают анализатор функции тромбоцитов 100 (PFA-100®, Siemens Healthcare Diagnostics Inc., США) и анализатор конуса и планшета (let) (CPA) под названием Impact-R® (DiaMed, Швейцария). Оба этих теста измеряют адгезию и агрегацию тромбоцитов в условиях высокого сдвига и требуют цельной крови с антикоагулянтом [9,10]. PFA-100 измеряет время до окклюзии (CT, время закрытия) кровотока через покрытую коллагеном мембрану в присутствии адреналина или АДФ.В системе CPA образец добавляется в лунку из полистирола, и белки плазмы прилипают к поверхности лунки. Напряжение сдвига прикладывается путем вращения конического устройства, погруженного в образец, что приводит к адгезии и агрегации тромбоцитов. Тромбоциты визуализируются и количественно оцениваются путем окрашивания. Результаты выражаются как процент поверхности, покрытой агрегатами (SC), и средний размер агрегатов (AS) [11]. Было показано, что PFA-100 и CPA обнаруживают нарушения wWF [3,9,12] и ингибиторы GPIIb / IIIa [6,10].Существуют также другие инструменты, в которых может применяться сдвиг, либо с использованием технологии «конус и пластина», либо с помощью кокетки соосного цилиндра, где кровь помещается между двумя соосными цилиндрами, причем внутренний цилиндр вращается для создания сдвига [13].

Адгезия тромбоцитов также может быть проанализирована с помощью перфузионных камер [14]. Система перфузии состоит из двух параллельных пластин. Одна из пластин принимает покровное стекло, которое может быть покрыто белками, например фибриноген, коллаген, vWF, ламинин или эндотелиальные клетки.Покрытие поверхности тромбоцитов, размер агрегатов и скорость прокатки тромбоцитов можно оценить с помощью видеомикроскопии или конфокальной микроскопии. Сдвиг можно варьировать, что позволяет изучать процесс коагуляции в физиологических условиях потока. Готовые проточные камеры, иногда также предлагающие интегрированные насосные системы, системы визуализации и / или анализа, теперь выходят на рынок [15]. Использование анализов на основе потока для оценки гемостаза недавно было рассмотрено подкомитетом ISTH SSC по биореологии [13,16].Поскольку адгезия тромбоцитов в проточных устройствах требует наличия эритроцитов, суспензии тромбоцитов, такие как концентраты тромбоцитов для переливания, не могут быть легко оценены. Поэтому мы недавно предложили новый анализ, в котором активацию тромбоцитов при адгезии к покрытым белком шарикам можно изучить с помощью проточной цитометрии [17].

Тесты вторичного / глобального гемостаза

Вязкоупругие гемостатические тесты (VHA)

Вязкость крови увеличивается по мере формирования фибриновой сети во время свертывания крови.Анализы вязкоупругости позволяют анализировать образование сгустка, его эластичность и процесс фибринолиза в режиме реального времени. Эластичность сгустка зависит от нескольких факторов; сократительная сила, проявляемая тромбоцитами во время ретракции сгустка, концентрация тромбоцитов [18-20], гематокрит [18,21], концентрация фибриногена [18-20,22], FXIII [23,24] и образование тромбина во время коагуляции [25] ]. Однако важно подчеркнуть, что основной сигнал исходит от сократительных сил тромбоцитов, а не от фибриновой сети [26,27].

Тромбоэластография была впервые описана Hartert в 1948 г. [28]. Существует два коммерческих тромбоэластографа: TEG® (Haemonetics, США) и ROTEM® (Pentapharm, Швейцария). Измерительный блок обоих приборов представляет собой цилиндрическую чашку из одноразового пластика. В чашку подвешивается штифт, и штифт подключается к детектору. Чашка и штифт будут совершать вынужденные колебания друг относительно друга под углом 4,75 ° (рисунок) [25,29]. Невозможно измерить вязкость крови или обнаружить начало коагуляции, поскольку первые сигналы появляются, когда игла соединяется через первые фибриновые волокна, охватывающие все расстояние до стенки чашки.Эластичность сгустка выражена в миллиметрах на начертании (рисунок). Основное различие между инструментами заключается в колебании. В приборе TEG чаша колеблется, а в приборе ROTEM колеблется штифт. В приборе ROTEM есть электронная пипетка, подключенная к прибору, чтобы упростить дозирование различных реагентов, а программное обеспечение предоставляет точные пошаговые инструкции, упрощающие использование прибора.

Принцип измерения TEG (A), ROTEM (B) и ReoRox FOR (C). В приборе TEG стержень подвешивается на проволоке в чашку с образцом крови. Чашка поворачивается вперед и назад на 4,75 ° каждые 10 секунд. Во время коагуляции образца между иглой и стенкой чашки образуются нити фибрина, которые будут влиять на движение чашки, которое постепенно передается на иглу. В приборе ROTEM чашка неподвижна, а штифт шарикоподшипника вращается вперед и назад на 4,75 °. Движение штифта приводится в движение упругой пружиной. Также здесь во время коагуляции между стенкой чашки и штифтом образуются нити фибрина, и прочность нитей будет влиять на движение штифта.В ReoRox чашка поднимается каждые 2,5 секунды, а затем отпускается, обеспечивая вращательные колебания вокруг продольной оси. Оптический датчик регистрирует частоту и затухание колебаний. Штифт (боб) погружается в чашку через вал. Волокна фибрина, образующиеся во время коагуляции, будут соединять чашку с бобом, а количество и активность тромбоцитов, связанных с фибриновой сеткой, будут влиять на частоту и затухание колебаний.

Кривые от TEG (A), ROTEM (B) и ReoRox (C, D) с отображенными переменными анализа. Время свертывания по данным TEG и ROTM (R, CT, соответственно) и ReoRox (COT1 и COT2). Переменная распространения эластичности инструментами (alfa от TEG и ROTEM и Slope от ReoRox). Максимальная прочность сгустка (MA от TEG, MCF от ROTEM и G’max от ReoRox). Переменными фибринолиза являются LY30 по TEG, LI30 по ROTEM и Clot SR и начало лизиса и завершение Т (полный фибринолиз) с помощью ReoRox.

Реометрия со свободными колебаниями (FOR) (MediRox AB, Швеция) — это новая технология, которая позволяет измерять изменения вязкости и эластичности свертывающейся цельной крови и растворенных сгустков и получать результаты в единицах СИ.В этом приборе (ReoRox®) колебания инициируются принудительным поворотом чашки для образца каждые 2,5 секунды (рисунок). После непродолжительной выдержки чашка для образца освобождается, позволяя свободно вращаться вокруг продольной оси. Оптический датчик угла регистрирует частоту и затухание колебаний как функцию времени. Анализ FOR включает одновременное измерение вязкости крови и, таким образом, позволяет обнаруживать даже начальные фазы коагуляции до соединения чашки и боба волокнами фибрина.Золочение цилиндрической чашки и боба, погруженного в центр, используется для обеспечения прочного ковалентного связывания фибриногена с чашкой и бобом. Это предотвращает отслоение при увеличении сократительной силы тромбоцитов во время ретракции сгустка, что было предложено как потенциальная проблема в TEG и ROTEM [30]. Возможное отслоение, а также различия в стратегиях осцилляции и обнаружения могут быть частичным объяснением того, почему разница между плазмой без тромбоцитов и цельной кровью меньше в ROTEM, чем в FOR (см. Рисунок).

Вклад тромбоцитов и фибринолиза в снижение кривых ROTEM® или FOR. У нормальных людей уменьшение амплитуды кривой ROTEM (слева) или FOR G ‘(справа) происходит даже в присутствии транексамовой кислоты (Циклокапрон®) в дозах, способных предотвратить фибринолиз, вызванный добавлением t-PA (светло-серая кривая) . Напротив, снижение было зависимым от тромбоцитов, так как оно полностью отсутствовало в плазме, свободной от тромбоцитов (PFP, темно-серая кривая).

Все системы VHA имеют набор различных тестов, посвященных различным аспектам процесса коагуляции (таблица).В тестах, имеющихся в продаже для ТЭГ, используется каолин или комбинация каолина и тканевого фактора (ТФ) для активации внутреннего или внешнего пути коагуляции соответственно [31]. У ROTEM также есть реагенты, которые могут активировать внутренний или внешний путь. Обе системы имеют тесты для мониторинга лечения гепарином и протамином [32], а также для оценки вклада фибрина в прочность сгустка [31,33]. Ни один из вышеперечисленных тестов не может быть использован для мониторинга лечения антитромбоцитами ингибиторами АДФ-рецептора или аспирином.Тест PlateletMapping ™ был введен для мониторинга антитромбоцитарной терапии с помощью ТЭГ. Образец нативной крови, активированный каолином, сравнивается с образцами, обработанными гепарином, где фибриновая сеть формируется путем добавления рептилазы и FXIIIa, а тромбоциты активируются АДФ или арахидоновой кислотой [34]. Этот тест предсказал первое ишемическое событие после планового стентирования у пациентов с ишемической болезнью сердца, получавших клопидогрель и аспирин [35]. ТЭГ использовался для мониторинга терапии компонентами крови у пациентов, перенесших операцию на сердце, печени или при травмах [36–39].Были разработаны алгоритмы лечения для интерпретации результатов и руководства лечением с использованием компонентов крови [31,33,40]. Низкая прочность тромба у пациентов с травмами связана с повышенной смертностью [39]. Для FOR существует панель тестов, включая тесты для мониторинга лечения гепарином и для оценки вклада фибрина в прочность сгустка. Коагуляция активируется внешним путем или добавлением специфического пептида, активирующего PAR1, в тесте TRAP для активации тромбоцитов через рецептор тромбина PAR1.Инструмент в основном использовался для изучения вклада тромбоцитов в свертывание цельной крови и контроля качества концентратов тромбоцитов [18,41-44]. Количество опубликованных клинических исследований ограничено [45–48]. FOR сообщает о более широком диапазоне измерения эластичности по сравнению с тромбоэластографией [18,49]. Например, во время беременности повышение эластичности сгустка было значительным уже в первом триместре с использованием FOR, с постепенным увеличением до 52% в третьем триместре [47], в то время как никаких значительных изменений максимальной амплитуды между триместрами с использованием TEG не было обнаружено. а максимальное увеличение во время беременности было менее 8% [50].

Таблица 2

Анализы TEG, ROTEM и ReoRox

ТЭГ РОТЕМ ReoRox
КаолинТЭГ ИНТЕМ HepScreen1
Каолин (активация внутреннего пути) Активация внутреннего пути, чувствительный к гепарину TP (внешний путь, чувствительный к гепарину)
HepTEG HepTEM HepScreen2
Чашка для нейтрализации гепарина Активация внутреннего пути + нейтрализация гепарина TP (внешний путь + нейтрализация гепарина)
RapidTEG ExTEM FibScreen1
Каолин + активация TF Активация TF (внешний путь) TP (внешний путь)
ТЭГ функционального фибриногена (FFTEG) FibTEM FibScreen2
Активация ТФ + ингибирование тромбоцитов абциксимабом Активация ТФ + ингибирование тромбоцитов цитохалазином Активация ТР + ингибирование тромбоцитов абциксимабом)
FibTEM +
Активация ТФ + ингибирование тромбоцитов цитохалазином и тирофибаном (в разработке)
Набор для картирования тромбоцитов ApTEM ReoTrap
(ADP, AA) (активация TF + апротинин, проверка фибринолиза) Активация PAR-1

TEG и ReoRox используют абциксимаб, который блокирует связывание фибриногена с рецептором GPIIb, чтобы оценить вклад фибрина в прочность сгустка, тогда как ROTEM использует цитохалазин D, который ингибирует реорганизацию цитоскелета тромбоцитов.Однако было показано, что сами по себе эти вещества не могут полностью блокировать вклад тромбоцитов в прочность сгустка [26] и что комбинация цитохалазина D и абциксимаба или тирофибана (механизм действия аналогичен абциксимабу) более эффективно блокирует тромбоциты [51]. .

Приборы VHA обычно работают при 37 ° C, но температуру можно регулировать. Это позволяет контролировать коагуляцию у пациентов с гипотермией, что важно, поскольку гипотермия влияет на коагуляцию [24].Гиперфибринолиз во время травмы или обширного хирургического вмешательства является важной терапевтической целью при лечении кровотечения. VHA можно использовать для обнаружения фибринолиза путем измерения снижения эластичности (рисунок). Однако важно понимать, что в нормальных условиях параметр «лизиса» в этих инструментах не отражает текущую фибринолитическую активность в образце, а вместо этого отражает снижение сократительной силы тромбоцитов, вероятно, из-за истощения, поскольку это уменьшение также наблюдается в образцах, обработанных препаратом транексамовая кислота, ингибирующим фибринолиз (рисунок).Кроме того, тест, используемый в VHA, может влиять на способность VHA обнаруживать фибринолиз [52,53]. Например, было показано, что RapidTEG менее чувствителен, чем каолиновый TEG, к низкой фибринолитической активности [52]. Было указано, что доступных в настоящее время анализов на TEG и ROTEM недостаточно для обнаружения низкого повышения фибринолитической активности [54]. FOR может также обнаруживать повышение фибринолитической активности путем измерения изменений вязкости, когда кровь возвращается в жидкую форму (рисунок) [53].VHA использовались для оценки эффектов гемодилюции актетатом Рингера, гидроксилэтилкрахмалом (HES) и альбумином на коагуляцию и лечение фибриногеном и концентратами FXIII in vitro [23,24,27,55,56].

Анализатор Sonoclot® (Sienco, Inc., США) имеет трубчатый зонд, который колеблется вверх и вниз в образце цельной крови. Сопротивление движению измеряется и регистрируется в процессе коагуляции [57]. С момента появления в 70-х годах [58] использование Sonoclot® было относительно ограниченным по сравнению с TEG и ROTEM.

Другие анализы цельной крови

Был описан и коммерциализирован ряд других подходов к оценке «глобального гемостаза», но не вызвал широкого интереса. Однако, поскольку может быть интересно обсудить их методологию, мы кратко опишем их в этом разделе.

Clot Signature Analyzer ™ (CSA ™; Xylum Corporation, США) — это глобальный прибор для скрининга гемостаза, предназначенный для использования с нативной цельной кровью [59]. Кровь проходит через тонкую пластиковую трубку под давлением.Затем в трубке проделываются два отверстия, что приводит к падению давления. Тромбоциты и фибриновый сгусток закупоривают отверстия, и это время регистрируется как «время гемостаза тромбоцитов» (PHT). CSA также регистрирует время свертывания (CT) по мере того, как коагуляция распространяется по просвету пробирки. Часть крови также проходит через вторую трубку с фибриллами коллагена, и время, необходимое для достижения 50% снижения давления в этой трубке, называется временем образования тромба, индуцированного коллагеном (CITF). Несмотря на относительно хорошую чувствительность при выборе пациентов с известными нарушениями свертываемости крови в многоцентровом исследовании [60], этот тест не мог помочь в различении дефектов тромбоцитов и факторов свертывания крови.

Тест на тромбоз Горога (GTT) [61] или анализатор тромботического статуса (TSA) [62] (Montrose Diagnostics, UK) добавляют нативную кровь в вертикальную коническую пробирку с отверстием в дне. Трубка также содержит два стальных шарика. Тромбоциты активируются напряжением сдвига (175 дин / см 2 ), когда они проходят первый большой шар, а затем агрегируют и инициируют коагуляцию в области между шариками. Световой датчик регистрирует время между каплями крови, покидающими конец трубки, чтобы определить время окклюзии, и время тромболизиса, когда кровоток возобновляется.

Система анализа гемостаза (HAS; Hemodyne, Inc., США) измеряет силу, развиваемую тромбоцитами, когда они подвергаются клеточному сокращению («сократительная сила тромбоцитов», PCF ™), и скорость образования сгустка в цельной крови между чашками. и параллельная верхняя пластина при 37 ° C [63]. Время между началом анализа и началом ПКФ называется временем образования тромбина (TGT ™) и используется в качестве суррогатного маркера образования тромбина [64].

Тест HemoSTATUS ™ или «время свертывания при активации тромбоцитов» (Medtronic Blood Management, США) измеряет ускорение времени свертывания, активируемого каолином (ACT), за счет различных концентраций фактора активации тромбоцитов (PAF).Тест в основном использовался для оценки пациентов во время кардиохирургических операций [65,66], хотя его полезность для прогнозирования кровопотери подвергалась сомнению [67,68].

Тесты, проводимые в плазме или плазме, богатой тромбоцитами

Образование тромбина (анализ CAT)

Тромбиноскоп (Thrombinoscope BC, Нидерланды) можно использовать для измерения переменных генерации тромбина (TG) в присутствии или в отсутствие тромбоцитов. ТГ проводят на флуориметре 96-луночного планшета. Флуоресценция образца сравнивается с калибратором.Переменные TG включают время задержки, максимальную концентрацию тромбина (Cmax), время, необходимое для достижения Cmax (Tmax), и потенциал эндогенного тромбина (ETP). На TG влияет дефицит факторов свертывания II, V, VIII, IX и X, но в меньшей степени — фибриноген, FXIII и FVII [69], а гемодилюция не влияет на анализ [55].

Общий потенциал гемостаза (OHP)

Общий потенциал гемостаза (OHP) — это анализ на основе плазмы, основанный на повторной спектрофотометрической регистрации кривой агрегации фибрина в бедной тромбоцитами плазме, содержащей небольшие количества экзогенного тромбина, тканевой типа активатора плазминогена и кальция.Общий коагуляционный потенциал и общий фибринолитический потенциал являются дополнительными параметрами ОНР, и сообщается об исследованиях ряда состояний гипер- и гипокоагуляции, а также во время лечения антикоагулянтами (недавний обзор в [70]).

Распространение коагуляции

Коммерческий прибор для обнаружения распространения коагуляции в плазме с поверхности, покрытой ТФ, был недавно представлен и описан в нескольких статьях [71-73] (Thrombodynamics Analyzer ™, HemaCore, Россия).Коагуляция обнаруживается в кювете путем захвата покадрового изображения рассеяния света фибриновой сеткой. Посредством обработки и анализа изображений в одном эксперименте можно измерить как начало (время задержки в минутах), так и фазу распространения (начальная скорость роста сгустка; мкм / мин) процесса коагуляции. В обновленной версии также будет измеряться образование тромбина в растущем сгустке с использованием хромогенного субстрата.

Обсуждение

Некоторые из описанных анализов зависят от концентрации тромбоцитов (например,грамм. PFA-100, CPA, VHA’s и VerifyNow) [5,9,10,18-20]. Было также показано, что на многопластинную терапию влияет концентрация тромбоцитов [74], но в другом исследовании сообщается только о слабой корреляции в пределах нормального диапазона [3]. Также гематокрит влияет на результат нескольких методов, включая VHA [18,21]. Однако тесты на агрегацию показали разную чувствительность к гематокриту. Было показано, что на VerifyNow влияет гематокрит [75,76], тогда как влияние на многопланшетный анализ было менее выраженным и зависело от агониста, использованного в анализе [21,77], а на работу тромбоцитов это не влияло вообще [6].Перфузионные камеры и устройства CPA требуют наличия эритроцитов, что затрудняет анализ суспензий тромбоцитов или образцов с низким гематокритом [11,78,79]. Также PFA-100 требует гематокрита> 10% [80].

Еще одно различие между методами заключается в использовании и выборе антикоагулянта, который может повлиять на результаты. В нескольких методах, включая PFA-100, CPA и VerifyNow, используется цитратная антикоагулированная кровь, и, таким образом, коагуляция ингибируется хелатированием ионов кальция [5,75,81].В перфузионных камерах можно использовать несколько антикоагулянтов, что может дать разные результаты в зависимости от выбора антикоагулянта [14]. Преимущество VHA заключается в том, что в анализе можно использовать как цельную кровь без антикоагуляции, так и цитратную кровь, а в цитратных образцах допускается коагуляция путем добавления кальция. Однако, если используются реагенты, обеспечивающие более длительное время свертывания, важно учитывать и избегать непреднамеренной активации контакта в пробирках для забора крови, поскольку в противном случае это могло бы повлиять на результаты теста [82].На PFA-100 также влияет группа крови, что еще больше затрудняет интерпретацию данных [3]. Рекомендуемое максимальное время от взятия пробы крови до анализа варьируется в зависимости от метода и может также влиять на результаты, и каждый производитель установил рекомендации относительно стабильности пробы.

VHA (TEG, ROTEM и ReoRox) имеют то преимущество, что они могут одновременно измерять коагуляцию, функцию тромбоцитов, ретракцию сгустка и фибринолиз. Однако, в отличие от анализов агрегации, VHA в целом нечувствительны к антитромбоцитарной терапии аспирином и ингибиторами АДФ-рецепторов, за исключением анализа тромбоцитов [34].PFA-100 также показал переменную чувствительность к аспирину и переменную чувствительность к клопидогрелу с картриджем ADP [80], но новый картридж, названный INNOVANCE PFA P2Y, показал многообещающие результаты в обнаружении устойчивости к клопидогрелу [83]. Однако все анализы агрегации, VHA, CPA и PFA-100 чувствительны к ингибиторам GPIIb / IIIa. Несмотря на свою чувствительность к антитромбоцитарной терапии, агрегометрические тесты выборочно измеряют функцию тромбоцитов, а не образование сгустков или фибринолиз, а Multiplate, как было показано, нечувствителен к дефициту факторов [84].Доказано, что как Multiplate, так и Plateletworks нечувствительны к фибриногену [6,74]. На CPA, напротив, влияет концентрация фибриногена [12]. ТГ можно использовать для выявления дефицита нескольких факторов свертывания крови, но он менее чувствителен к дефициту фибриногена и FXIII [69]. На VHA влияет концентрация фибриногена [18-20,22], а также FXIII [23,24], что позволяет контролировать лечение фибриногеном и концентратами FXIII [23,24,55,56], хотя другие методы по-прежнему являются стандартным выбором. в клинических условиях.Коагулопатия, связанная с гемодилюцией, может быть обнаружена с помощью VHA [23,24,27,55,56] и агрегометрии [85], но не обнаруживается с помощью анализа TG [55].

Основной проблемой, которую следует учитывать, является отсутствие потока во многих анализах (например, агрегометрии и VHA) [15]. Также те, которые работают с потоком, различаются по скорости сдвига, такие как CPA и PFA-100 [11,12,80]. Сдвиг можно варьировать в проточных камерах и, таким образом, имитировать условия in vivo [14]. Однако перфузионные камеры и CPA имеют низкую пропускную способность, отнимают много времени, сложны в использовании и оценке результатов и требуют больших объемов проб, хотя в настоящее время появляется ряд новых коммерческих проточных камер и систем, позволяющих преодолеть некоторые из этих проблем [15] .

Многие методы, включая анализы агрегации и PFA-100, имеют недостаток, заключающийся в том, что они не подходят для образцов с низкой концентрацией тромбоцитов, таких как пациенты с гематологическими злокачественными заболеваниями, и, следовательно, их нельзя использовать для проведения профилактических переливаний тромбоцитов и для оценки эффективности переливания у этих пациентов. VHA, CPA и проточные камеры были протестированы в этом контексте, но необходимы дальнейшие исследования [47,78,86-88].

Некоторые методы рекомендованы в руководствах, за исключением VHA в европейских рекомендациях «Многопрофильной целевой группы по расширенному лечению кровотечений при травмах» для лечения кровотечений и коагулопатии после серьезной травмы, где рекомендуются вязкоупругие методы (степень 1C) необходимо выполнить, чтобы помочь охарактеризовать коагулопатию и направить гемостатическую терапию [89].

В будущем станут доступны новые интересные возможности тестирования гемостаза. В разработке находится новый кассетный прибор для ТЭГ, а также лучший тест на фибриноген в ROTEM (FibTEM +). Другой тенденцией является коммерциализация устройств с проточными камерами в виде готовых проточных ячеек или интегрированных систем с камерами, специализированных насосов и программного обеспечения, таких как системы T-TAS, VenaFlux, BioFlux и Ibidi. Следующим шагом могут быть еще более миниатюрные устройства с многоканальными проточными ячейками, а также устройства с узорчатыми поверхностями для тестирования адгезии тромбоцитов.За последние годы эти устройства эволюционировали от возможности наблюдать активацию, вызванную напряжением сдвига, при различных скоростях сдвига [90] или изменяя геометрию [91], до устройств с узорчатым покрытием поверхности [92–97], а недавно и комбинации этих двух методов. [98]. Один из примеров даже включает простую оптическую систему для обнаружения начала коагуляции с использованием лазера и фотодиода [99]. Несмотря на то, что для этого устройства требовалось сложное внешнее оборудование, оно демонстрирует одну возможность обнаружения коагуляции в простой системе оказания медицинской помощи, и, вероятно, последуют другие.

Компонент, который отсутствует во всех современных коммерческих устройствах, — это эндотелий, который является важным компонентом гемостаза in vivo, но его сложно включить в анализы, подходящие для рутинного использования. Время покажет, улучшит ли добавление некоторых компонентов из этой оси предсказательную силу будущих «глобальных» анализов гемостаза.

Анализы различных аспектов гемостаза — что они измеряют?

Abstract

Гемостаз — это сложный процесс, на который влияет множество факторов, включая как клеточные, так и плазменные компоненты.Это многоступенчатый процесс, который начинается с прилипания тромбоцитов к поврежденному эндотелию и заканчивается фибринолизом сгустка. Существует несколько доступных методов для изучения различных аспектов гемостаза, включая адгезию, агрегацию, коагуляцию и фибринолиз. В этом обзоре описаны различные методы, измеряемые аспекты гемостаза и их ограничения. Обсуждаемые методы включают методы исследования адгезии (например, PFA-100, анализатор конусов и тромбоцитов (let) и перфузионные камеры) и агрегации (например, PFA-100).грамм. Multiplate, VerifyNow и Plateletworks). Кроме того, представлены принципы вязкоупругих гемостатических анализов, а также методы, которые могут анализировать аспекты гемостаза в образцах плазмы или богатой тромбоцитами плазмы (образование тромбина, общий потенциал гемостаза и анализатор тромбодинамики).

Ключевые слова: Коагуляция, гемостаз, тромбоциты, анализы коагуляции, тестирование функции тромбоцитов

Введение

Гемостаз — это сложный процесс, включающий адгезию тромбоцитов к поврежденному эндотелию, образование тромбоцитарной пробки (агрегацию), формирование фибриновой сети для стабилизации пробки, ретракции сгустка и, наконец, фибринолиза.Кроме того, все эти процессы протекают в потоке и контролируются и регулируются факторами, высвобождаемыми из окружающего эндотелия. Хирургическое вмешательство может вызвать коагулопатию из-за ацидоза, гипотермии и гемодилюции и связано с повышенной фибринолитической активностью, что требует мониторинга для определения направления трансфузионной терапии [1,2].

Таким образом, «идеальный» анализ гемостаза должен предпочтительно измерять все эти процессы при соответствующих условиях сдвига и своевременно давать результаты. Действительно, существует множество различных методов для измерения одного или нескольких из множества различных событий гемостатического процесса и функции тромбоцитов.Однако ни один из доступных в настоящее время методов не позволяет измерить все эти процессы, и все они имеют свои плюсы и минусы. В этом обзоре будет описан ряд анализов, используемых для оценки различных аспектов гемостаза с технической точки зрения, с выделением их методологии и того, что они могут и не могут измерять, с выводами, обобщенными в таблице.

Таблица 1

Аспекты глобальных анализов гемостаза

Анализ Тип образца Адгезия Агрегирование Коагуляция Эндотелий Сдвиг №цитат
Плазма PRP WB Нач. Опор. Эласт. Лизис
Многопластинчатый + + + 250
VerifyNow + + 476
Plateletworks + + 26
Удар-R + + + + 121
PFA-100 + + + + 745
Перфузионные камеры + + + (+) (+) (+) + 630
ТЭГ (+) + + + + + 4016
ROTEM (+) + + + + + 3932
ReoRox (+) + + + + + + 28
Sonoclot (+) + + + + + + 113
Образование тромбина + + + + 118
OHP + + (+) + 23
Тромбодинамика + + + + + 11

Тесты первичного гемостаза

Агрегометрия

В дополнение к классической светопропускающей агрегометрии, которая требует подготовки богатой тромбоцитами плазмы, что ограничивает ее полезность в острых клинических условиях, коммерческие тесты для оценки агрегации в цельной крови.В целом, тесты были разработаны для мониторинга реакции на лечение распространенных классов антитромбоцитарных препаратов, аспирина, P2Y 12 (АДФ-рецептор) — антагонистов и антагонистов GPIIb / IIIa путем добавления арахидоновой кислоты, АДФ или сильных тромбоцитов. агонист, такой как пептид, активирующий рецептор PAR1 тромбина (TRAP, аминокислотная последовательность SFLLRN) или коллаген, соответственно.

В Multiplate® (Roche, Швейцария) [3] образец крови (антикоагулированный цитратом или гирудином) добавляется в одноразовую кювету, содержащую электроды, к которым тромбоциты прилипают и объединяются после добавления коллагена, TRAP, ADP, арахидоновой кислоты или ристоцетин.Это вызывает зарегистрированное изменение импеданса. Multiplate предназначен для измерения агрегации в цельной крови, но может использоваться для суспензий тромбоцитов [4].

VerifyNow® (Accumetrics, США) — это полностью автоматизированный прибор на основе картриджей для оценки антитромбоцитарных препаратов с тремя типами тестовых картриджей, содержащих АДФ, арахидоновую кислоту или TRAP. Цитрированная цельная кровь смешивается с агонистом тромбоцитов и гранулами, покрытыми фибриногеном. Активированные тромбоциты будут связываться с гранулами и агглютинировать, и увеличение светопропускания, связанное с этим, будет регистрироваться [5].

Наборы для агрегации Plateletworks® (Helena Laboratories, США) основаны на сравнении количества тромбоцитов в контрольной пробирке с ЭДТА и после агрегации с АДФ, арахидоновой кислотой или коллагеном в цитратных пробирках. Результаты выражаются в% агрегации или% ингибирования [6].

За последние годы в ряде исследований была предпринята попытка установить оптимальный тест и диапазон реактивности тромбоцитов, связанный с максимальной защитой от тромбоза и минимальным риском кровотечения.Сообщенная корреляция между реактивностью тромбоцитов во время лечения и исходом также предполагала использование тестирования функции тромбоцитов для персонализации антиагрегантной терапии. В этой области также было проведено несколько исследований, но основные клинические испытания не смогли продемонстрировать преимущества такой стратегии в улучшении клинических исходов (недавно обзор [7,8]).

Анализы адгезии

Классический тест на адгезию заключается в подсчете тромбоцитов до и после прохождения гепаринизированной крови через колонку, заполненную стеклянными шариками.Коммерчески доступные инструменты включают анализатор функции тромбоцитов 100 (PFA-100®, Siemens Healthcare Diagnostics Inc., США) и анализатор конуса и планшета (let) (CPA) под названием Impact-R® (DiaMed, Швейцария). Оба этих теста измеряют адгезию и агрегацию тромбоцитов в условиях высокого сдвига и требуют цельной крови с антикоагулянтом [9,10]. PFA-100 измеряет время до окклюзии (CT, время закрытия) кровотока через покрытую коллагеном мембрану в присутствии адреналина или АДФ.В системе CPA образец добавляется в лунку из полистирола, и белки плазмы прилипают к поверхности лунки. Напряжение сдвига прикладывается путем вращения конического устройства, погруженного в образец, что приводит к адгезии и агрегации тромбоцитов. Тромбоциты визуализируются и количественно оцениваются путем окрашивания. Результаты выражаются как процент поверхности, покрытой агрегатами (SC), и средний размер агрегатов (AS) [11]. Было показано, что PFA-100 и CPA обнаруживают нарушения wWF [3,9,12] и ингибиторы GPIIb / IIIa [6,10].Существуют также другие инструменты, в которых может применяться сдвиг, либо с использованием технологии «конус и пластина», либо с помощью кокетки соосного цилиндра, где кровь помещается между двумя соосными цилиндрами, причем внутренний цилиндр вращается для создания сдвига [13].

Адгезия тромбоцитов также может быть проанализирована с помощью перфузионных камер [14]. Система перфузии состоит из двух параллельных пластин. Одна из пластин принимает покровное стекло, которое может быть покрыто белками, например фибриноген, коллаген, vWF, ламинин или эндотелиальные клетки.Покрытие поверхности тромбоцитов, размер агрегатов и скорость прокатки тромбоцитов можно оценить с помощью видеомикроскопии или конфокальной микроскопии. Сдвиг можно варьировать, что позволяет изучать процесс коагуляции в физиологических условиях потока. Готовые проточные камеры, иногда также предлагающие интегрированные насосные системы, системы визуализации и / или анализа, теперь выходят на рынок [15]. Использование анализов на основе потока для оценки гемостаза недавно было рассмотрено подкомитетом ISTH SSC по биореологии [13,16].Поскольку адгезия тромбоцитов в проточных устройствах требует наличия эритроцитов, суспензии тромбоцитов, такие как концентраты тромбоцитов для переливания, не могут быть легко оценены. Поэтому мы недавно предложили новый анализ, в котором активацию тромбоцитов при адгезии к покрытым белком шарикам можно изучить с помощью проточной цитометрии [17].

Тесты вторичного / глобального гемостаза

Вязкоупругие гемостатические тесты (VHA)

Вязкость крови увеличивается по мере формирования фибриновой сети во время свертывания крови.Анализы вязкоупругости позволяют анализировать образование сгустка, его эластичность и процесс фибринолиза в режиме реального времени. Эластичность сгустка зависит от нескольких факторов; сократительная сила, проявляемая тромбоцитами во время ретракции сгустка, концентрация тромбоцитов [18-20], гематокрит [18,21], концентрация фибриногена [18-20,22], FXIII [23,24] и образование тромбина во время коагуляции [25] ]. Однако важно подчеркнуть, что основной сигнал исходит от сократительных сил тромбоцитов, а не от фибриновой сети [26,27].

Тромбоэластография была впервые описана Hartert в 1948 г. [28]. Существует два коммерческих тромбоэластографа: TEG® (Haemonetics, США) и ROTEM® (Pentapharm, Швейцария). Измерительный блок обоих приборов представляет собой цилиндрическую чашку из одноразового пластика. В чашку подвешивается штифт, и штифт подключается к детектору. Чашка и штифт будут совершать вынужденные колебания друг относительно друга под углом 4,75 ° (рисунок) [25,29]. Невозможно измерить вязкость крови или обнаружить начало коагуляции, поскольку первые сигналы появляются, когда игла соединяется через первые фибриновые волокна, охватывающие все расстояние до стенки чашки.Эластичность сгустка выражена в миллиметрах на начертании (рисунок). Основное различие между инструментами заключается в колебании. В приборе TEG чаша колеблется, а в приборе ROTEM колеблется штифт. В приборе ROTEM есть электронная пипетка, подключенная к прибору, чтобы упростить дозирование различных реагентов, а программное обеспечение предоставляет точные пошаговые инструкции, упрощающие использование прибора.

Принцип измерения TEG (A), ROTEM (B) и ReoRox FOR (C). В приборе TEG стержень подвешивается на проволоке в чашку с образцом крови. Чашка поворачивается вперед и назад на 4,75 ° каждые 10 секунд. Во время коагуляции образца между иглой и стенкой чашки образуются нити фибрина, которые будут влиять на движение чашки, которое постепенно передается на иглу. В приборе ROTEM чашка неподвижна, а штифт шарикоподшипника вращается вперед и назад на 4,75 °. Движение штифта приводится в движение упругой пружиной. Также здесь во время коагуляции между стенкой чашки и штифтом образуются нити фибрина, и прочность нитей будет влиять на движение штифта.В ReoRox чашка поднимается каждые 2,5 секунды, а затем отпускается, обеспечивая вращательные колебания вокруг продольной оси. Оптический датчик регистрирует частоту и затухание колебаний. Штифт (боб) погружается в чашку через вал. Волокна фибрина, образующиеся во время коагуляции, будут соединять чашку с бобом, а количество и активность тромбоцитов, связанных с фибриновой сеткой, будут влиять на частоту и затухание колебаний.

Кривые от TEG (A), ROTEM (B) и ReoRox (C, D) с отображенными переменными анализа. Время свертывания по данным TEG и ROTM (R, CT, соответственно) и ReoRox (COT1 и COT2). Переменная распространения эластичности инструментами (alfa от TEG и ROTEM и Slope от ReoRox). Максимальная прочность сгустка (MA от TEG, MCF от ROTEM и G’max от ReoRox). Переменными фибринолиза являются LY30 по TEG, LI30 по ROTEM и Clot SR и начало лизиса и завершение Т (полный фибринолиз) с помощью ReoRox.

Реометрия со свободными колебаниями (FOR) (MediRox AB, Швеция) — это новая технология, которая позволяет измерять изменения вязкости и эластичности свертывающейся цельной крови и растворенных сгустков и получать результаты в единицах СИ.В этом приборе (ReoRox®) колебания инициируются принудительным поворотом чашки для образца каждые 2,5 секунды (рисунок). После непродолжительной выдержки чашка для образца освобождается, позволяя свободно вращаться вокруг продольной оси. Оптический датчик угла регистрирует частоту и затухание колебаний как функцию времени. Анализ FOR включает одновременное измерение вязкости крови и, таким образом, позволяет обнаруживать даже начальные фазы коагуляции до соединения чашки и боба волокнами фибрина.Золочение цилиндрической чашки и боба, погруженного в центр, используется для обеспечения прочного ковалентного связывания фибриногена с чашкой и бобом. Это предотвращает отслоение при увеличении сократительной силы тромбоцитов во время ретракции сгустка, что было предложено как потенциальная проблема в TEG и ROTEM [30]. Возможное отслоение, а также различия в стратегиях осцилляции и обнаружения могут быть частичным объяснением того, почему разница между плазмой без тромбоцитов и цельной кровью меньше в ROTEM, чем в FOR (см. Рисунок).

Вклад тромбоцитов и фибринолиза в снижение кривых ROTEM® или FOR. У нормальных людей уменьшение амплитуды кривой ROTEM (слева) или FOR G ‘(справа) происходит даже в присутствии транексамовой кислоты (Циклокапрон®) в дозах, способных предотвратить фибринолиз, вызванный добавлением t-PA (светло-серая кривая) . Напротив, снижение было зависимым от тромбоцитов, так как оно полностью отсутствовало в плазме, свободной от тромбоцитов (PFP, темно-серая кривая).

Все системы VHA имеют набор различных тестов, посвященных различным аспектам процесса коагуляции (таблица).В тестах, имеющихся в продаже для ТЭГ, используется каолин или комбинация каолина и тканевого фактора (ТФ) для активации внутреннего или внешнего пути коагуляции соответственно [31]. У ROTEM также есть реагенты, которые могут активировать внутренний или внешний путь. Обе системы имеют тесты для мониторинга лечения гепарином и протамином [32], а также для оценки вклада фибрина в прочность сгустка [31,33]. Ни один из вышеперечисленных тестов не может быть использован для мониторинга лечения антитромбоцитами ингибиторами АДФ-рецептора или аспирином.Тест PlateletMapping ™ был введен для мониторинга антитромбоцитарной терапии с помощью ТЭГ. Образец нативной крови, активированный каолином, сравнивается с образцами, обработанными гепарином, где фибриновая сеть формируется путем добавления рептилазы и FXIIIa, а тромбоциты активируются АДФ или арахидоновой кислотой [34]. Этот тест предсказал первое ишемическое событие после планового стентирования у пациентов с ишемической болезнью сердца, получавших клопидогрель и аспирин [35]. ТЭГ использовался для мониторинга терапии компонентами крови у пациентов, перенесших операцию на сердце, печени или при травмах [36–39].Были разработаны алгоритмы лечения для интерпретации результатов и руководства лечением с использованием компонентов крови [31,33,40]. Низкая прочность тромба у пациентов с травмами связана с повышенной смертностью [39]. Для FOR существует панель тестов, включая тесты для мониторинга лечения гепарином и для оценки вклада фибрина в прочность сгустка. Коагуляция активируется внешним путем или добавлением специфического пептида, активирующего PAR1, в тесте TRAP для активации тромбоцитов через рецептор тромбина PAR1.Инструмент в основном использовался для изучения вклада тромбоцитов в свертывание цельной крови и контроля качества концентратов тромбоцитов [18,41-44]. Количество опубликованных клинических исследований ограничено [45–48]. FOR сообщает о более широком диапазоне измерения эластичности по сравнению с тромбоэластографией [18,49]. Например, во время беременности повышение эластичности сгустка было значительным уже в первом триместре с использованием FOR, с постепенным увеличением до 52% в третьем триместре [47], в то время как никаких значительных изменений максимальной амплитуды между триместрами с использованием TEG не было обнаружено. а максимальное увеличение во время беременности было менее 8% [50].

Таблица 2

Анализы TEG, ROTEM и ReoRox

ТЭГ РОТЕМ ReoRox
КаолинТЭГ ИНТЕМ HepScreen1
Каолин (активация внутреннего пути) Активация внутреннего пути, чувствительный к гепарину TP (внешний путь, чувствительный к гепарину)
HepTEG HepTEM HepScreen2
Чашка для нейтрализации гепарина Активация внутреннего пути + нейтрализация гепарина TP (внешний путь + нейтрализация гепарина)
RapidTEG ExTEM FibScreen1
Каолин + активация TF Активация TF (внешний путь) TP (внешний путь)
ТЭГ функционального фибриногена (FFTEG) FibTEM FibScreen2
Активация ТФ + ингибирование тромбоцитов абциксимабом Активация ТФ + ингибирование тромбоцитов цитохалазином Активация ТР + ингибирование тромбоцитов абциксимабом)
FibTEM +
Активация ТФ + ингибирование тромбоцитов цитохалазином и тирофибаном (в разработке)
Набор для картирования тромбоцитов ApTEM ReoTrap
(ADP, AA) (активация TF + апротинин, проверка фибринолиза) Активация PAR-1

TEG и ReoRox используют абциксимаб, который блокирует связывание фибриногена с рецептором GPIIb, чтобы оценить вклад фибрина в прочность сгустка, тогда как ROTEM использует цитохалазин D, который ингибирует реорганизацию цитоскелета тромбоцитов.Однако было показано, что сами по себе эти вещества не могут полностью блокировать вклад тромбоцитов в прочность сгустка [26] и что комбинация цитохалазина D и абциксимаба или тирофибана (механизм действия аналогичен абциксимабу) более эффективно блокирует тромбоциты [51]. .

Приборы VHA обычно работают при 37 ° C, но температуру можно регулировать. Это позволяет контролировать коагуляцию у пациентов с гипотермией, что важно, поскольку гипотермия влияет на коагуляцию [24].Гиперфибринолиз во время травмы или обширного хирургического вмешательства является важной терапевтической целью при лечении кровотечения. VHA можно использовать для обнаружения фибринолиза путем измерения снижения эластичности (рисунок). Однако важно понимать, что в нормальных условиях параметр «лизиса» в этих инструментах не отражает текущую фибринолитическую активность в образце, а вместо этого отражает снижение сократительной силы тромбоцитов, вероятно, из-за истощения, поскольку это уменьшение также наблюдается в образцах, обработанных препаратом транексамовая кислота, ингибирующим фибринолиз (рисунок).Кроме того, тест, используемый в VHA, может влиять на способность VHA обнаруживать фибринолиз [52,53]. Например, было показано, что RapidTEG менее чувствителен, чем каолиновый TEG, к низкой фибринолитической активности [52]. Было указано, что доступных в настоящее время анализов на TEG и ROTEM недостаточно для обнаружения низкого повышения фибринолитической активности [54]. FOR может также обнаруживать повышение фибринолитической активности путем измерения изменений вязкости, когда кровь возвращается в жидкую форму (рисунок) [53].VHA использовались для оценки эффектов гемодилюции актетатом Рингера, гидроксилэтилкрахмалом (HES) и альбумином на коагуляцию и лечение фибриногеном и концентратами FXIII in vitro [23,24,27,55,56].

Анализатор Sonoclot® (Sienco, Inc., США) имеет трубчатый зонд, который колеблется вверх и вниз в образце цельной крови. Сопротивление движению измеряется и регистрируется в процессе коагуляции [57]. С момента появления в 70-х годах [58] использование Sonoclot® было относительно ограниченным по сравнению с TEG и ROTEM.

Другие анализы цельной крови

Был описан и коммерциализирован ряд других подходов к оценке «глобального гемостаза», но не вызвал широкого интереса. Однако, поскольку может быть интересно обсудить их методологию, мы кратко опишем их в этом разделе.

Clot Signature Analyzer ™ (CSA ™; Xylum Corporation, США) — это глобальный прибор для скрининга гемостаза, предназначенный для использования с нативной цельной кровью [59]. Кровь проходит через тонкую пластиковую трубку под давлением.Затем в трубке проделываются два отверстия, что приводит к падению давления. Тромбоциты и фибриновый сгусток закупоривают отверстия, и это время регистрируется как «время гемостаза тромбоцитов» (PHT). CSA также регистрирует время свертывания (CT) по мере того, как коагуляция распространяется по просвету пробирки. Часть крови также проходит через вторую трубку с фибриллами коллагена, и время, необходимое для достижения 50% снижения давления в этой трубке, называется временем образования тромба, индуцированного коллагеном (CITF). Несмотря на относительно хорошую чувствительность при выборе пациентов с известными нарушениями свертываемости крови в многоцентровом исследовании [60], этот тест не мог помочь в различении дефектов тромбоцитов и факторов свертывания крови.

Тест на тромбоз Горога (GTT) [61] или анализатор тромботического статуса (TSA) [62] (Montrose Diagnostics, UK) добавляют нативную кровь в вертикальную коническую пробирку с отверстием в дне. Трубка также содержит два стальных шарика. Тромбоциты активируются напряжением сдвига (175 дин / см 2 ), когда они проходят первый большой шар, а затем агрегируют и инициируют коагуляцию в области между шариками. Световой датчик регистрирует время между каплями крови, покидающими конец трубки, чтобы определить время окклюзии, и время тромболизиса, когда кровоток возобновляется.

Система анализа гемостаза (HAS; Hemodyne, Inc., США) измеряет силу, развиваемую тромбоцитами, когда они подвергаются клеточному сокращению («сократительная сила тромбоцитов», PCF ™), и скорость образования сгустка в цельной крови между чашками. и параллельная верхняя пластина при 37 ° C [63]. Время между началом анализа и началом ПКФ называется временем образования тромбина (TGT ™) и используется в качестве суррогатного маркера образования тромбина [64].

Тест HemoSTATUS ™ или «время свертывания при активации тромбоцитов» (Medtronic Blood Management, США) измеряет ускорение времени свертывания, активируемого каолином (ACT), за счет различных концентраций фактора активации тромбоцитов (PAF).Тест в основном использовался для оценки пациентов во время кардиохирургических операций [65,66], хотя его полезность для прогнозирования кровопотери подвергалась сомнению [67,68].

Тесты, проводимые в плазме или плазме, богатой тромбоцитами

Образование тромбина (анализ CAT)

Тромбиноскоп (Thrombinoscope BC, Нидерланды) можно использовать для измерения переменных генерации тромбина (TG) в присутствии или в отсутствие тромбоцитов. ТГ проводят на флуориметре 96-луночного планшета. Флуоресценция образца сравнивается с калибратором.Переменные TG включают время задержки, максимальную концентрацию тромбина (Cmax), время, необходимое для достижения Cmax (Tmax), и потенциал эндогенного тромбина (ETP). На TG влияет дефицит факторов свертывания II, V, VIII, IX и X, но в меньшей степени — фибриноген, FXIII и FVII [69], а гемодилюция не влияет на анализ [55].

Общий потенциал гемостаза (OHP)

Общий потенциал гемостаза (OHP) — это анализ на основе плазмы, основанный на повторной спектрофотометрической регистрации кривой агрегации фибрина в бедной тромбоцитами плазме, содержащей небольшие количества экзогенного тромбина, тканевой типа активатора плазминогена и кальция.Общий коагуляционный потенциал и общий фибринолитический потенциал являются дополнительными параметрами ОНР, и сообщается об исследованиях ряда состояний гипер- и гипокоагуляции, а также во время лечения антикоагулянтами (недавний обзор в [70]).

Распространение коагуляции

Коммерческий прибор для обнаружения распространения коагуляции в плазме с поверхности, покрытой ТФ, был недавно представлен и описан в нескольких статьях [71-73] (Thrombodynamics Analyzer ™, HemaCore, Россия).Коагуляция обнаруживается в кювете путем захвата покадрового изображения рассеяния света фибриновой сеткой. Посредством обработки и анализа изображений в одном эксперименте можно измерить как начало (время задержки в минутах), так и фазу распространения (начальная скорость роста сгустка; мкм / мин) процесса коагуляции. В обновленной версии также будет измеряться образование тромбина в растущем сгустке с использованием хромогенного субстрата.

Обсуждение

Некоторые из описанных анализов зависят от концентрации тромбоцитов (например,грамм. PFA-100, CPA, VHA’s и VerifyNow) [5,9,10,18-20]. Было также показано, что на многопластинную терапию влияет концентрация тромбоцитов [74], но в другом исследовании сообщается только о слабой корреляции в пределах нормального диапазона [3]. Также гематокрит влияет на результат нескольких методов, включая VHA [18,21]. Однако тесты на агрегацию показали разную чувствительность к гематокриту. Было показано, что на VerifyNow влияет гематокрит [75,76], тогда как влияние на многопланшетный анализ было менее выраженным и зависело от агониста, использованного в анализе [21,77], а на работу тромбоцитов это не влияло вообще [6].Перфузионные камеры и устройства CPA требуют наличия эритроцитов, что затрудняет анализ суспензий тромбоцитов или образцов с низким гематокритом [11,78,79]. Также PFA-100 требует гематокрита> 10% [80].

Еще одно различие между методами заключается в использовании и выборе антикоагулянта, который может повлиять на результаты. В нескольких методах, включая PFA-100, CPA и VerifyNow, используется цитратная антикоагулированная кровь, и, таким образом, коагуляция ингибируется хелатированием ионов кальция [5,75,81].В перфузионных камерах можно использовать несколько антикоагулянтов, что может дать разные результаты в зависимости от выбора антикоагулянта [14]. Преимущество VHA заключается в том, что в анализе можно использовать как цельную кровь без антикоагуляции, так и цитратную кровь, а в цитратных образцах допускается коагуляция путем добавления кальция. Однако, если используются реагенты, обеспечивающие более длительное время свертывания, важно учитывать и избегать непреднамеренной активации контакта в пробирках для забора крови, поскольку в противном случае это могло бы повлиять на результаты теста [82].На PFA-100 также влияет группа крови, что еще больше затрудняет интерпретацию данных [3]. Рекомендуемое максимальное время от взятия пробы крови до анализа варьируется в зависимости от метода и может также влиять на результаты, и каждый производитель установил рекомендации относительно стабильности пробы.

VHA (TEG, ROTEM и ReoRox) имеют то преимущество, что они могут одновременно измерять коагуляцию, функцию тромбоцитов, ретракцию сгустка и фибринолиз. Однако, в отличие от анализов агрегации, VHA в целом нечувствительны к антитромбоцитарной терапии аспирином и ингибиторами АДФ-рецепторов, за исключением анализа тромбоцитов [34].PFA-100 также показал переменную чувствительность к аспирину и переменную чувствительность к клопидогрелу с картриджем ADP [80], но новый картридж, названный INNOVANCE PFA P2Y, показал многообещающие результаты в обнаружении устойчивости к клопидогрелу [83]. Однако все анализы агрегации, VHA, CPA и PFA-100 чувствительны к ингибиторам GPIIb / IIIa. Несмотря на свою чувствительность к антитромбоцитарной терапии, агрегометрические тесты выборочно измеряют функцию тромбоцитов, а не образование сгустков или фибринолиз, а Multiplate, как было показано, нечувствителен к дефициту факторов [84].Доказано, что как Multiplate, так и Plateletworks нечувствительны к фибриногену [6,74]. На CPA, напротив, влияет концентрация фибриногена [12]. ТГ можно использовать для выявления дефицита нескольких факторов свертывания крови, но он менее чувствителен к дефициту фибриногена и FXIII [69]. На VHA влияет концентрация фибриногена [18-20,22], а также FXIII [23,24], что позволяет контролировать лечение фибриногеном и концентратами FXIII [23,24,55,56], хотя другие методы по-прежнему являются стандартным выбором. в клинических условиях.Коагулопатия, связанная с гемодилюцией, может быть обнаружена с помощью VHA [23,24,27,55,56] и агрегометрии [85], но не обнаруживается с помощью анализа TG [55].

Основной проблемой, которую следует учитывать, является отсутствие потока во многих анализах (например, агрегометрии и VHA) [15]. Также те, которые работают с потоком, различаются по скорости сдвига, такие как CPA и PFA-100 [11,12,80]. Сдвиг можно варьировать в проточных камерах и, таким образом, имитировать условия in vivo [14]. Однако перфузионные камеры и CPA имеют низкую пропускную способность, отнимают много времени, сложны в использовании и оценке результатов и требуют больших объемов проб, хотя в настоящее время появляется ряд новых коммерческих проточных камер и систем, позволяющих преодолеть некоторые из этих проблем [15] .

Многие методы, включая анализы агрегации и PFA-100, имеют недостаток, заключающийся в том, что они не подходят для образцов с низкой концентрацией тромбоцитов, таких как пациенты с гематологическими злокачественными заболеваниями, и, следовательно, их нельзя использовать для проведения профилактических переливаний тромбоцитов и для оценки эффективности переливания у этих пациентов. VHA, CPA и проточные камеры были протестированы в этом контексте, но необходимы дальнейшие исследования [47,78,86-88].

Некоторые методы рекомендованы в руководствах, за исключением VHA в европейских рекомендациях «Многопрофильной целевой группы по расширенному лечению кровотечений при травмах» для лечения кровотечений и коагулопатии после серьезной травмы, где рекомендуются вязкоупругие методы (степень 1C) необходимо выполнить, чтобы помочь охарактеризовать коагулопатию и направить гемостатическую терапию [89].

В будущем станут доступны новые интересные возможности тестирования гемостаза. В разработке находится новый кассетный прибор для ТЭГ, а также лучший тест на фибриноген в ROTEM (FibTEM +). Другой тенденцией является коммерциализация устройств с проточными камерами в виде готовых проточных ячеек или интегрированных систем с камерами, специализированных насосов и программного обеспечения, таких как системы T-TAS, VenaFlux, BioFlux и Ibidi. Следующим шагом могут быть еще более миниатюрные устройства с многоканальными проточными ячейками, а также устройства с узорчатыми поверхностями для тестирования адгезии тромбоцитов.За последние годы эти устройства эволюционировали от возможности наблюдать активацию, вызванную напряжением сдвига, при различных скоростях сдвига [90] или изменяя геометрию [91], до устройств с узорчатым покрытием поверхности [92–97], а недавно и комбинации этих двух методов. [98]. Один из примеров даже включает простую оптическую систему для обнаружения начала коагуляции с использованием лазера и фотодиода [99]. Несмотря на то, что для этого устройства требовалось сложное внешнее оборудование, оно демонстрирует одну возможность обнаружения коагуляции в простой системе оказания медицинской помощи, и, вероятно, последуют другие.

Компонент, который отсутствует во всех современных коммерческих устройствах, — это эндотелий, который является важным компонентом гемостаза in vivo, но его сложно включить в анализы, подходящие для рутинного использования. Время покажет, улучшит ли добавление некоторых компонентов из этой оси предсказательную силу будущих «глобальных» анализов гемостаза.

Тесты на коагуляцию | AACC.org

При повреждении мелких кровеносных сосудов и капилляров организм контролирует кровопотерю с помощью физиологических процессов, называемых гемостазом.In vivo гемостаз зависит от взаимодействия между плазменным каскадом свертывания крови, тромбоцитами и эндотелием кровеносных сосудов. В клинической лаборатории аналитические анализы in vitro способны измерять только первые два компонента этой системы. Следовательно, лабораторные измерения свертывания крови представляют собой лишь близкое приближение к гемостатической системе организма.

Клиницисты часто назначают тесты на коагуляцию, такие как протромбиновое время (PT), активированное частичное тромбопластиновое время (aPTT) и тромбиновое время (TT), для оценки функции свертывания крови у пациентов.Хотя эти лабораторные тесты могут быть полезны для выяснения причины необъяснимого кровотечения, они не помогают предсказать, произойдет ли кровотечение. Фактически, ни один тест не может предсказать кровотечение в периоперационном или послеоперационном периоде. Кроме того, эти общие лабораторные тесты мало помогают в прогнозировании свертывания крови или тромбоза при отсутствии повреждения сосудов. Доступны хорошо описанные анализы для проверки наследственной предрасположенности к тромбозам, но большинство тромбофилических состояний невозможно количественно определить с помощью каких-либо текущих лабораторных тестов.Очевидно, что лабораторная оценка гемостаза представляет множество проблем для лаборантов и клиницистов, интерпретирующих результаты. В этом обзоре кратко объясняются общие тесты, используемые для оценки гемостаза, а также их клинический контекст, а также приводится руководство для клинических химиков по оценке необъяснимых кровотечений.

Очевидно, что лабораторная оценка гемостаза представляет множество проблем для лаборантов и клиницистов, интерпретирующих результаты. В этом обзоре кратко объясняются общие тесты, используемые для оценки гемостаза, а также их клинический контекст, а также приводится руководство для клинических химиков по оценке необъяснимых кровотечений.

Азбука тестов на коагуляцию

Для лабораторных тестов гемостаза обычно требуется цитратная плазма, полученная из цельной крови. Образцы следует собирать в пробирки, содержащие 3,2% цитрата натрия (109 мМ) в соотношении 9 частей крови и 1 часть антикоагулянта. Цитрат предназначен для удаления ионов кальция, которые необходимы для свертывания крови; однако из-за недостаточного заполнения пробирки для забора крови конечная концентрация цитрата в образце пациента оказывается слишком высокой.Это важно, потому что тесты PT и aPTT требуют добавления кальция. Если образец содержит избыток цитрата, добавление кальция может быть недостаточным, а низкий уровень кальция в плазме приведет к искусственному продлению ПВ или АЧТВ.

Аналогичная, но более тонкая проблема может возникнуть, если гематокрит пациента необычно высок, обычно ≥55%. Обычно в 10 мл крови с гематокритом 40% содержится 6 мл плазмы. Если гематокрит ненормально повышен, например 65%, образец будет содержать только 3.5 мл плазмы, эффективно не заполняя пробирку для забора плазмы, что приводит к чрезмерному цитированию плазмы.

Для теста PT добавление реагента тромбопластина, содержащего тканевой фактор, кальций и фосфолипиды, инициирует коагуляцию предварительно нагретого образца по внешнему пути коагуляции (рис. 1). Точно так же тест АЧТВ инициируется добавлением отрицательно заряженной поверхности, такой как диоксид кремния, к плазме, а также экстракта фосфолипидов, не содержащего тканевого фактора. Путь коагуляции, который происходит в тесте aPTT, представляет собой внутренний путь коагуляции (Рисунок 1).

Рисунок 1
Каскад когуальтион

Каскад коагуляции — это серия ферментативных реакций, которые превращают неактивные предшественники в активные факторы. Конечным результатом каскада является производство фибрина, белка, который связывает тромбоциты и другие материалы в стабильный сгусток. У каскада есть два исходных пути: внешний (опосредованный тканевым фактором) и внутренний (инициированный контактной системой). Эти два пути сходятся, чтобы стать общим путем активации фактора X.Обозначены этапы каскада, которые измеряются с помощью трех распространенных анализов коагуляции: PT, aPTT и TT.

Если у пациента наблюдается аномально длительная ПВ или АЧТВ, лаборатории должны провести исследование смешивания образцов (таблица 1). Для выполнения теста технолог смешивает равный объем цитратной плазмы пациента с нормальной объединенной плазмой (NPP) и повторяет PT и / или aPTT. Если время анализа свертывания теперь попадает в референсные интервалы PT и / или aPTT, первоначальный аномальный результат был вызван недостатком одного или нескольких факторов свертывания.Напротив, присутствие ингибиторов в плазме крови пациента влияет на факторы свертывания в NPP, но результаты исследования смешивания не дадут нормального времени свертывания. Другой распространенный анализ, используемый для оценки гемостаза, — это TT (Рисунок 1). Этот тест измеряет способность фибриногена образовывать нити фибрина in vitro. Для проведения теста технолог добавляет экзогенный тромбин в предварительно подогретую плазму. Этот шаг гарантирует, что результат не зависит от эндогенного тромбина или каких-либо других факторов свертывания крови.ТТ особенно чувствителен к гепарину.

Таблица 1
Оценка длительного АЧТВ

В этой таблице показано, как можно комбинировать анализы коагуляции для выяснения возможных причин пролонгированного АЧТВ.

Клинические характеристики Повышенное кровотечение Повышенное кровотечение Повышенное кровотечение Нет проблем с гемостазом Тромбофилия, ТГВ, ПЭ
Исследование смешивания 1: 1 Исправляет Исправляет Без исправлений Исправляет Без исправлений
PT Нормальный Продлен Нормальный Нормальный Нормальный
Патология Дефицит факторов VIII, IX и некоторые случаи дефицита фактора XI

Дефицит факторов II, V, X, фибриногена

Варфарин Rx

Аутоантитела к фактору VIII (приобретенная гемофилия)

Дефицит фактора XII

Дефицит других контактных факторов, таких как прекалликреин

Некоторые случаи дефицита фактора XI

Антифосфолипидный синдром
Сокращения: ТГВ, тромбоз глубоких вен; ТЭЛА, тромбоэмболия легочной артерии; Rx, лечение.

Антифосфолипидный синдром. Аутоиммунное протромботическое приобретенное состояние, антифосфолипидный синдром (APLS), часто связан с заметно пролонгированным АЧТВ, что вызывает опасения, что у пораженного человека может быть риск серьезного кровотечения. Это не только маловероятно, но и как протромботическое состояние APLS обычно ассоциируется с венозной тромбоэмболией и / или артериальным тромбозом. Состояние также может проявляться потерей плода или мертворождением, что, вероятно, происходит в результате воспаления плаценты или тромбоза.

У людей с APLS есть антитела, известные как волчаночные антикоагулянты (LA). Эти антитела направлены на комплексы бета-2-гликопротеин I / фосфолипид или протромбин / фосфолипид, и они мешают и продлевают исследования свертывания крови in vitro. Однако в сосудистой системе организма присутствие эндотелиальных клеток и лейкоцитов, а также многих других компонентов, отсутствующих в упрощенном анализе свертывания крови in vitro, увеличивает вероятность свертывания.

Классические лабораторные данные у пациентов с APLS — пролонгированное АЧТВ, нормальное ПВ и отсутствие коррекции в исследовании смешивания АЧТВ 1: 1.Однако добавление избытка фосфолипида к анализу aPTT сокращает время свертывания. Это основа так называемого анализа LA. Одна из версий анализа LA — это время разбавленного яда гадюки Рассела (dRVVT). Компоненты анализа активируют только общий путь коагуляции через фактор X, и они не зависят от фактора VIII или антител к фактору VIII. Лаборатории также могут подтвердить APLS, обнаружив антитела IgG или IgM к кардиолипину или бета-2-гликопротеину I в анализе типа ELISA.

Фактор V Лейден. Вариант фактора V, фактор V Лейдена вызывает наследственное нарушение гиперкоагуляции. У людей с этим заболеванием есть точечная мутация в гене фактора V, которая вызывает переключение одной аминокислоты (аргинин на глутамин, R506Q), что делает белок устойчивым к инактивации активированным белком C. Гетерозиготность по фактору V Лейдена увеличивает риск венозной тромбоэмболии. примерно в два-три раза.

Лабораторные результаты этого генетического состояния включают ПВ и АЧТВ в пределах нормы.Кроме того, aPTT будет устойчивым к активированному протеину C, и у нормальных людей добавление активированного протеина C к свежему образцу плазмы вызовет удлинение aPTT. Этот эффект притупляется у лиц с фактором V Лейдена. Исследования ДНК окончательно подтверждают переключение нуклеотидов G1691A .

Протромбин G20210A. Другая наследственная тромбофилия, полиморфизм G20210A в гене протромбина, повышает плазменные концентрации протромбина (FII) без изменения аминокислотной последовательности белка.

Пациенты с этой мутацией имеют результаты PT и aPTT, которые находятся в пределах нормы, а также нормальные функциональные исследования на основе тромбов. Исследования ДНК покажут замену G на A в 3′-нетранслируемой области гена протромбина на нуклеотиде 20210.

Дефицит протеина C и S. Эти два витамин К-зависимых фактора нарушают активность факторов свертывания крови V и VIII. Активированный протеин C является протеолитическим ферментом, а протеин S — важным сопутствующим фактором.

Дефицит антитромбина. AT, ранее называвшийся AT III, представляет собой витамин K-независимый гликопротеин, который является основным ингибитором тромбина и других сериновых протеаз свертывания, включая факторы Xa и IXa. AT образует конкурентный комплекс 1: 1 со своей мишенью, но только в присутствии отрицательно заряженного гликозаминогликана, такого как гепарин или сульфат гепарина.

Пациенты с недостаточностью AT будут иметь незначительную активность AT III, как измерено с помощью хромогенного анализа.

Интерпретация тестов на коагуляцию

Как и в случае с любым другим лабораторным тестом, наша цель как лаборанта — помочь клиницистам в использовании и интерпретации тестов, оценивающих гемостаз. В отличие от повышенного уровня креатинина в сыворотке или тиреотропного гормона, которые указывают на нарушение функции почек и гипотиреоз соответственно, тесты гемостаза должны интерпретироваться в контексте клинических данных, а также других лабораторных данных. Учитывая ужасные последствия необъяснимого кровотечения, клинические лаборатории должны активно консультировать врачей по использованию и интерпретации тестов на коагуляцию.Подход с дробовиком к нарушениям гемостаза редко бывает успешным и может привести к поздней диагностике и лечению пациентов.

ПРЕДЛАГАЕМЫЕ ЧТЕНИЯ

Eby CS. Дозирование варфарина. Должны ли лаборатории предлагать фармакогенетическое тестирование? CLN 2009; 35 (6).

Харрис Н.С., Зима, WE. Международное нормализованное соотношение. Инструмент для мониторинга терапии варфарином. CLN 2010; 36 (11).

Harris NS, Winter WE, Ledford-Kraemer MR. Гемостаз: обзор и методы оценки в клинической лаборатории.Глава 21, стр. 265–283. IN: Contemporary Practice in Clinical Chemistry 2nd Edition, Clarke, W. 2011 (AACC Press, Вашингтон, округ Колумбия).

Хоффбранд А.В., Мосс ПАУ. Эссенциальная гематология. 6-е издание. Главы 26 (Нарушения свертывания крови) и 27 (Тромбоз и антитромботическая терапия). Wiley-Blackwell 2011.

Hoffman M, Монро DM. Коагуляция 2006: современный взгляд на гемостаз. Hematol Oncol Clin N Am 2007; 21: 1–11.

Kroll MH. Теория и практика тромбоэластографии в измерении гемостаза.CLN 2010; 36 (12).


Нил С. Харрис, MBChB, MD, клинический адъюнкт-профессор и содиректор основной диагностической лаборатории кафедры патологии, иммунологии и лабораторной медицины Медицинского колледжа Университета Флориды в Гейнсвилле. Электронная почта

Линдси А.Л. Базидло, доктор философии, является доцентом и директором клинической химии кафедры патологии, иммунологии и лабораторной медицины Медицинского колледжа Университета Флориды в Гейнсвилле.Email

Уильям Э. Винтер, доктор медицины, профессор патологии и педиатрии Университета Флориды в Гейнсвилле. Email

Специализированные тесты на гемостаз | Наблюдатель в медицинской лаборатории

Скрининговые тесты на дефекты свертывания крови можно проводить в большинстве клинических лабораторий. После обнаружения дефекта часто необходимо, чтобы специализированная лаборатория свертывания крови проводила нестандартные тесты для определения конкретного дефекта. В этой статье обсуждаются некоторые из этих менее распространенных тестов.

Фон

Гемостаз описывает сложный процесс, посредством которого кровотечение прекращается самопроизвольно после травмы, и кровь поддерживается в жидком состоянии. Этот процесс включает в себя как клеточные, так и биохимические процессы, которые действуют вместе, чтобы поддерживать кровь в жидком состоянии в сосудистой системе. В процессе гемостаза образуется тромб, и кровоток восстанавливается во время процесса заживления
. 1, 2 Сохраняется полный баланс склонности организма к свертыванию и кровотечению.Гемостаз достигается за счет взаимодействия нескольких систем, в том числе сосудистой системы, системы свертывания, фибринолитической системы и тромбоцитов, а также кининовой системы, ингибиторов сериновой протеазы и системы комплемента. 3,4 Различные системы работают вместе, когда эндотелиальные оболочки кровеносных сосудов повреждены механической травмой, физическими агентами или химической травмой. Фибринолитический процесс связан с растворением сгустков, которые производятся для остановки кровотечения.Следовательно, существует тонкий баланс между образованием и растворением сгустка во время гемостатического процесса. Когда этот баланс в системе гемостаза нарушен, может возникнуть тромбоз или кровотечение из-за гиперкоагуляции или гипокоагуляции соответственно. 1,4

Гемостаз состоит из двух компонентов, называемых первичным и вторичным гемостазом. Первичный гемостаз предполагает прилипание тромбоцитов к поврежденным сосудам. Первичный ответ опосредуется гликопротеином Ib мембраны тромбоцитов и фактором фон Виллебранда (vWF). 2 Взаимодействие между тромбоцитами и эндотелием сосудов приводит к серии реакций, которые завершаются образованием тромба. Вторичный гемостаз включает реакцию процесса свертывания на повреждение посредством активации белков свертывания, что приводит к образованию фибринового сгустка. 4

Большинство клинических лабораторий способны провести первую линию скрининговых тестов, чтобы определить, есть ли дефект коагуляции, и приблизительно классифицировать его тип.Однако необходимо передать проблему в специализированную лабораторию свертывания крови для менее распространенных тестов. Это связано с тем, что необходимы специальные системы реагентов или потому, что тесты должны проводить люди со специальными знаниями и опытом.

Специализированные тесты факторов свертывания крови

Одноэтапный количественный анализ факторов II, V, VII и X. Тест включает использование абсорбированной плазмы и состарившейся сыворотки в протромбиновом времени (ПВ). Состаренная сыворотка содержит факторы VII, IX, X, XI и XII.Абсорбированная плазма содержит факторы V, VIII, XI и XIII. ПК является основой этой тест-системы, в которой к плазме пациента добавляют плазму с дефицитом определенного фактора. Процент активности фактора определяется величиной коррекции, обнаруживаемой при добавлении определенных разведений плазмы пациента к плазме с дефицитом фактора. Результаты получают из кривой активности, построенной с использованием времени свертывания разведений нормальной эталонной плазмы и плазмы с дефицитом специфического фактора. 2

Одноэтапный количественный анализ факторов VIII, IX, XI и XII. APTT является основой этой тестовой системы. Он основан на способности плазмы пациента корректировать плазму с дефицитом определенного фактора, и результаты в процентах активности получают из кривой активности. 2 Метод ELISA был разработан для измерения антител к фактору VIII у пациентов с гемофилией. В анализе используется связывание антител в плазме с твердофазным антигеном, которое впоследствии обнаруживается поликлональным IgG человека, меченным субстратной системой щелочная фосфатаза-п-нитрофенилфосфат. 5

Тест на образование фибрина

Анализ фибриногена. Анализ фибриногена используется для измерения концентрации фактора в плазме. Фибриноген был определен как независимый фактор риска сердечно-сосудистых заболеваний и связан с традиционными факторами риска сердечно-сосудистых заболеваний. Кроме того, роль повышенного фибриногена в тромбозе предполагает, что это может быть причинно-следственным путем, по которому определенные факторы риска оказывают свое влияние. Эти ассоциации остаются не полностью охарактеризованными.Более того, оптимальный анализ фибриногена для стратификации риска не определен. 6

Статус коагуляции у младенцев и детей может быть серьезно нарушен во время искусственного кровообращения, главным образом из-за гемодилюции и гипотермии. Уровень фибриногена является одним из источников информации, необходимой для оценки статуса свертывания крови пациента. Точный и целесообразный метод определения уровня фибриногена позволит раньше начать коагуляционную терапию для предотвращения чрезмерного послеоперационного кровотечения. 7

Фибриноген можно количественно определить различными методами, включая методы осаждения или денатурации, турбидиметрический метод или метод плотности фибринового сгустка, анализы свертываемого белка, а также иммунологические анализы, в которых используются антитела к фибриногену в анализах, таких как радиальная иммунодиффузия, измерение мутности или ракетный иммуноэлектрофорез и модифицированное время свертывания тромбина, которое является наиболее широко применяемым клиническим анализом фибриногена. 4 Время свертывания разбавленной плазмы, к которой была добавлена ​​высокая концентрация тромбина, обратно пропорционально концентрации фибриногена.Количественное определение достигается за счет использования стандартов с известными концентрациями фибриногена.

Тромбиновое время

Тромбиновое время — это время, необходимое тромбину для преобразования фибриногена в нерастворимый фибриновый сгусток. Он запускается добавлением тромбина к образцу и, таким образом, обходит предыдущие этапы в каскаде коагуляции
. 2 Тест не измеряет дефекты внутренних или внешних путей. На него влияют аномальный фибриноген, дисфибриногенемия и наличие циркулирующих антикоагулянтов, включая гепарин и FDP. 2 Операция вызывает немедленную гиперкоагуляцию за счет прямого изменения сосудистого русла, высвобождения прокоагулянтных веществ из внесосудистых пространств и уменьшения кровотока, а также замедленной гиперкоагуляции в ответ на повреждение ткани, что вызывает воспалительные реакции. Таким образом, послеоперационный период представляет собой время высокого риска тромбоза. Выявление лиц из группы высокого риска позволит улучшить профилактику тромбоэмболии. 9 Время генерации тромбина, индуцированного тромбоцитами — это недавно разработанный глобальный анализ коагуляции, в котором небольшое количество частично антикоагулированной плазмы, богатой тромбоцитами, вращается в дискообразной кювете внутри светового луча фотометра.Регистрируют интервалы времени от начала вращения до агрегации и коагуляции образца. 10

Время рептилазы

Этот тест аналогичен тромбиновому времени; однако последовательность свертывания крови инициируется ферментом змеиного яда, рептилазой. Фермент является тромбиноподобным по своей природе и гидролизует фибринопептид A из интактной молекулы фибриногена, в отличие от тромбина, который гидролизует фибринопептид A и B из фибриногена. 2 Образовавшийся сгусток хрупок по сравнению с тромбином.Рептилаза не ингибируется гепарином, и влияние FDP на рептилазу минимально. 2 Тест на рептилазу используется для скрининга дисфибриногенемии.

Дисфибриногенемия — это нарушение свертывания крови, вызванное множеством структурных аномалий в молекуле фибриногена, которые приводят к нарушению функции фибриногена. Он может быть передан по наследству или приобретен. Наследственная форма связана с повышенным риском кровотечения, тромбоза или того и другого у одного и того же пациента или семьи. Традиционно дисфибриногенемию диагностируют с помощью аномальных тестов на образование фибринового сгустка; тромбиновое время и время рептилазы являются скрининговыми тестами, а соотношение активность свертывания фибриногена и антиген является подтверждающим тестом.Унаследованная форма диагностируется путем демонстрации аналогичных отклонений лабораторных тестов у членов семьи и, при необходимости, путем анализа белка фибриногена или генов фибриногена у пациента. Приобретенная форма диагностируется путем выявления аномальных функциональных тестов печени и исключения дисфибриногенемии у членов семьи. 11

Тест на болезнь Виллебранда

Более двух десятилетий анализ кофактора ристоцетина (RCo), который измеряет опосредованную vWF агглютинацию тромбоцитов в присутствии антибиотика ристоцетина, был наиболее распространенным методом измерения функциональной активности vWF.12 Однако клинические аналитики в целом согласны с тем, что этот метод имеет серьезные практические недостатки с точки зрения производительности и воспроизводимости.

Сегодня анализы связывания коллагена, основанные на методе ELISA, которые измеряют взаимодействие vWF и коллагена, являются альтернативной аналитической процедурой, основанной на более физиологической функции, чем процедура RCo. 12 Циркулирующий плазменный антиген vWF является маркером генерализованной эндотелиальной дисфункции и
атеротромбоза. 13 Антиген vWF можно количественно определить с помощью ELISA, ракетного электрофореза Лаурелла или иммуноферментного латексного анализа. Недавно был рекомендован анализ связывания коллагена в качестве нового метода определения активности vWF. Анализ основан на измерении количества молекул vWF, связанных с коллагеном, аналогично процедуре ELISA. 14 Фактор определяется количественно, независимо от его функциональности. Наиболее распространенным методом является ОВОС с использованием сэндвич-метода. Планшет для микротитрования покрывают специфическим кроличьим античеловеческим vWF, и антитело захватывает vWF, подлежащий измерению.Кроличьи антитела против WF, связанные с пероксидазой, связываются с оставшимися свободными антигенными детерминантами vWF, образуя сэндвич. Связанный фермент затем определяется по его активности на субстрате ортофенилендиамина в присутствии перекиси водорода. 2 Интенсивность окрашивания прямо пропорциональна концентрации vWF в образце плазмы.

Регуляторные анализы белка

Антитромбин-III. Антитромбин-III (AT-III) является естественным ингибитором свертывания крови и играет важную роль в поддержании крови в жидком состоянии.Антитромбин-III синтезируется в печени и циркулирует в плазме. Он отвечает за нейтрализацию активности тромбина, факторов IXa, Xa, XIa и XIIa, а также плазмина. Ингибирование тромбина AT-III значительно ускоряется гепарином
. 2 Анализы антитромбина-III выполняются для оценки ответа на терапию гепарином и эффективности терапии концентратом антитромбина-III, а также для диагностики наследственной тромбофилии, тромбоза глубоких вен, тромбоэмбола легочной артерии и ДВС-синдрома.Методами выбора являются анализы синтетического субстрата на антитромбин-III; однако большинство существующих систем анализа являются полуавтоматическими. 15 Наследственный дефицит AT-III — хорошо известная причина рецидивирующего венозного тромбоза. Перекрестная реактивность кофактора гепарина II в анализах AT-III может в некоторых случаях мешать диагностике наследственной недостаточности AT-III. 16

Белок C. Белок C представляет собой витамин K-зависимую сериновую протеазу, которая функционирует как главный регуляторный белок, контролирующий коагуляцию. 2 Это мощный антикоагулянт, инактивирующий факторы Va и VIIIa, а также усиливающий фибринолитическую активность в плазме. Дефицит протеина С является фактором риска тромбоэмболической болезни. Активированная устойчивость к протеину C является результатом мутации в гене фактора V, известного как фактор V Leiden, и делает молекулу фактора V устойчивой к протеолитической активности активированного протеина C. Диагноз дефицита протеина C определяется иммунологическими и функциональными анализами. Иммунологические методы измерения протеина C включают метод иммуноэлектрофореза Laurell, метод радиоиммуноанализа или ELISA.

Белок S. Белок S действует как кофактор протеина С, а также может быть измерен иммунологически или функционально. Белок S в циркуляции находится в динамическом равновесии со связывающим белком C4b (C4bBP), что влияет на определение свободного антигена белка S. 17 Tsuda, et al, 17 изучили вопрос о переоценке концентрации свободного белка S с помощью современных иммуноанализов из-за динамического равновесия и предложили новый метод для его точного определения.

Они протестировали свою систему анализа при различных температурах реакции, используя очищенный свободный протеин S, комплексы протеин S-C4bBP, образцы плазмы и коммерчески доступный набор для анализа свободного протеина S. Они обнаружили, что при температуре реакции 37 ° C фракция свободного белка S увеличивалась с 0,5 нг / мл (при 4 ° C) до 7,8 нг / мл и с 4,5 нг / мл (при 4 ° C) до 56 нг / мл, когда концентрация анализируемые белковые комплексы S-C4bBP составляли 20 нг / мл и 200 нг / мл соответственно. В образцах плазмы уровни свободного белка S были приблизительно равны 0.На 8 мг / мл и 6 пг / мл выше при 25 ° C и 37 ° C, соответственно, по сравнению с измерениями при 4 ° C.

Они пришли к выводу, что измерения свободного протеина S в плазме с использованием имеющегося в продаже набора для анализа были примерно на 0,6 мг / мл выше при 25 ° C, чем измерения, выполненные при 4 ° C. Динамическое равновесие между белком S и C4bBP влияет на определение свободного антигена белка S. Измерение свободного антигена протеина S следует проводить в условиях, когда протеин S не диссоциирует от комплексов протеина S-C4bBP, как показано на примере анализа при низкой температуре.

Тесты на фибринолитический путь

Фибринолитический путь связан с растворением сгустка после высвобождения плазмина из плазминогена. Образцы компонентов фибринолитической системы должны быть получены в стандартизованное время, предпочтительно рано утром после ночного голодания и как минимум 15-минутного отдыха. 4 Образец следует обработать сразу после сбора, центрифугировать, чтобы не было тромбоцитов, и, если анализ не был проведен немедленно, поместить в пластиковые флаконы и заморозить при 70 ° C.

Анализ плазминогена

Плазминоген следует анализировать как иммунологическими, так и функциональными методами, чтобы обнаружить нефункциональные молекулы. Могут использоваться иммунологические анализы посредством радиальной иммунодиффузии. Плазма пациента добавляется в лунку, вырезанную в агарозной матрице, содержащей антитела к плазминогену. Плазма может диффундировать из лунки, и взаимодействие плазминогена пациента с антителом приводит к реакции иммунопреципитации. Диаметр измеряется и сравнивается с диаметром контрольной плазмы.Тест занимает около 48 часов. 4 В функциональном анализе к образцу плазмы добавляется избыток активатора плазминогена, такого как стрептокиназа. Результирующий комплекс плазминоген-стрептокиназа генерирует активность плазмина, который вступает в реакцию с синтетическим хромогенным субстратом. Это вызывает изменение цвета, пропорциональное уровню плазминогена в плазме. 4

Тканевые активаторы плазминогена

Уровень тканевых активаторов плазминогена (TPA) может быть определен с использованием сэндвич-метода иммуноферментного анализа.Тестируемый образец добавляется в лунку для микротитрования, покрытую антителами против ТРА, меченными пероксидазой. Лунки промывают для удаления несвязавшегося конъюгата, после чего добавляют окрашенный субстрат пероксидазы. Количество желтого цвета прямо пропорционально количеству TPA, присутствующего в образце. 4

Ингибитор активатора плазмина-1

Эндотелиальные клетки, гепатоциты и мегакариоциты синтезируют ингибитор активатора плазминогена-1 (PAI).Повышенный уровень PAI связан с тромботическими расстройствами. 4 Для измерения PAI доступен двухэтапный ферментный анализ. Стандартное количество TPA добавляется к образцу плазмы и инкубируется в течение определенного времени, а TPA образует комплексы с PAI. Ингибиторы плазмина удаляются путем подкисления, и количество несвязанного TPA определяется путем добавления образца к смеси PAI-дефицитной плазмы, содержащей плазминоген и хромогенный субстрат. Произведенное изменение цвета измеряется, и количество полученного цвета обратно пропорционально количеству PAI. 4

Заключение

Клиническое обследование дает полезную информацию, которая может помочь в диагностике нарушений гемостаза. Однако точный диагноз гемостатического заболевания в конечном итоге зависит от лабораторных исследований. Доступны различные лабораторные тесты для диагностики проблем, связанных с гемостазом. Многие из этих тестов специфичны для различных компонентов системы гемостаза и требуют опыта лаборатории коагуляции, которая видит большой объем проблем коагуляции.Клиническая лаборатория по-прежнему будет играть очень важную роль в диагностике и лечении гемостатических заболеваний. Понимание тех тестов, которые должны быть переданы, необходимо для соответствующего направления тестов.

Генри Угедегбе, доктор философии, BB (ASCP), C (ASCP) SC, CLS (NCA), NRCCCC и Halcyon St. Hill, EdD, MS, MT (ASCP), CLS (NCA), связаны с Колледжем медицинских специальностей, Университет побережья Мексиканского залива Флориды, Форт Майерс, Флорида.

Список литературы

  1. Родак БФ.Гематология, клинические принципы и применение. 2-е изд. Филадельфия: Компания У. Б. Сондерса; 2002: 609-753.
  2. Харменнинг DM. Клиническая гематология и основы гемостаза.
    4-е изд. Филадельфия: Компания Ф. Д. Дэвиса; 2002 471-494.
  3. Hoffmeister HM. Обзор соответствующих аспектов фокуса системы свертывания крови и сердечно-сосудистого гемостаза. Kongressbd Dtsch Ges Chir Kongr. 2001; 118: 572-575.
  4. Stiene-Martin EA, Lotspeich-Steininger CA, Koepke JA.Клиническая гематология. Принципы, процедуры, взаимосвязи. 2-е изд. Филадельфия: Липпинкотт; 1998 599-611.
  5. Шетти С., Гош К., Моханти Д. Анализ ELISA для обнаружения антител к фактору VIII — сравнение с обычным анализом Bethesda в большой когорте образцов гемофилии. Acta Haematol. 2003; 109 (1): 18-22
  6. Stec JJ, Silbershatz H, Tofler GH, Matheney TH, Sutherland P, Lipinska I, Massaro JM, Wilson PF, Muller JE, DAgostino RB Sr. Ассоциация фибриногена с факторами риска сердечно-сосудистых заболеваний и сердечно-сосудистыми заболеваниями в популяции потомков Фрамингема. Тираж. 2000; 102 (14): 1634-1638.
  7. Matthews DR, Ecklund JM, Hennein H. Клиническое сравнение анализа фибриногена на стороне пациента и обычного лабораторного анализатора в педиатрическом искусственном кровообращении. J Extra Corpor Technol .1995; 27 (3): 126-131.
  8. Ferreira CN, Vieira LM, Dusse LM, Reis CV, Amaral CF, Esteves WA, Fenelon LM, Carvalho MG. Оценка механизма свертывания крови и агрегации тромбоцитов у лиц с механическими или биологическими протезами сердца. Фибринолиз свертывания крови. 2002; 13 (2): 129-134.
  9. Freyburger G, Dubreuil M, Audebert A, Labrouche S, Pistre JC, Molinari I, Dubecq F, Laville C, Villanove X. Изменения гемостаза после лапароскопической операции в гинекологии: вклад теста на образование тромбина. Гемостаз. 2001; 31 (1): 32-41.
  10. Radziwon P, Boczkowska-Radziwon B, Schenk JF, Wojtukiewicz MZ, Kloczko J, Giedrojc J, Breddin HK. Активация тромбоцитов и ее роль в образовании тромбина во время индуцированного тромбоцитами образования тромбина. Thromb Res. 2000; 100 (5): 419-26.
  11. Каннингем М. Т., Брандт Дж. Т., Лапосата М., Олсон Дж. Д.. Лабораторная диагностика дисфибриногенемии. Arch Pathol Lab Med. 2002; 126 (4): 499-505.
  12. Turecek PL, Siekmann J, Schwarz HP. Сравнительное исследование иммуноферментного анализа, связывающего коллаген-связывающий фермент, и анализов активности кофактора ристоцетина для определения функциональной активности фактора фон Виллебранда. Semin Thromb Hemost. 2002; 28 (2): 149-160.
  13. Rabbani LE, Seminario NA, Sciacca RR, Chen HJ, Giardina EG.Конъюгированный конский эстроген перорально увеличивает плазменный фактор Виллебранда у женщин в постменопаузе. J Am Coll Cardiol. 2002; 40 (11): 1991–1999.
  14. Пачуски Р. Определение активности фактора фон Виллебранда с помощью анализа связывания коллагена и диагностика болезни фон Виллебранда: влияние источника коллагена и условий покрытия. J Lab Clin Med. 2002; 140 (4): 250-254.
  15. Бик Р.Л., Уиллер А. Полностью автоматизированный анализ антитромбина-III с использованием синтетического субстрата на Multistat III. Am J Clin Pathol. 1987; 88 (2): 192-197.
  16. Hortin GL, Tollefsen DM, Santoro SA Оценка влияния кофактора гепарина II в тесте DuPont aca на антитромбин-III. Am J Clin Pathol. 1988; 89 (4): 515-517.
  17. Цуда Т., Цуда Х., Йошимура Х., Хамасаки Н. Динамическое равновесие между белком S и связывающим белком C4b важно для точного определения антигена свободного белка S. Clin Chem Lab Med. 2002; 40 (6): 563-567.

© 2003 Nelson Publishing, Inc.Все права защищены.

Гемостаз — обзор | Темы ScienceDirect

I. Введение

Гемостаз — это хорошо организованный защитный механизм, который приходит на помощь в случае повреждения сосудистой сети у позвоночных организмов (Jagadeeswaran et al ., 2005, 2007). У млекопитающих при разрыве стенки сосуда тромбоциты прикрепляются к субэндотелиальному матриксу через коллаген и фактор фон Виллебранда (vWF). Эти белки активируют тромбоциты, которые инициируют секрецию трех агонистов АДФ, тромбоксана и серотонина, и эти агонисты дополнительно активируют и усиливают агрегацию тромбоцитов.Эти агонисты действуют через свои соответствующие рецепторы и инициируют множество сигнальных путей, которые в конечном итоге приводят к активации αIIbβ3, что вызывает агрегацию тромбоцитов вместе с фибриногеном в качестве мостиковой молекулы. Активация αIIbβ3 впоследствии приводит к «внешней передаче сигналов» и инициирует ретракцию тромбоцитов. Наряду с этими событиями тканевый фактор на поверхности клеток в субэндотелиальном матриксе связывается с ранее существовавшим фактором VIIa и инициирует коагуляцию путем расщепления фактора X на Xa, который затем расщепляет протромбин с образованием мизерного количества тромбина.Затем это преобразует фактор XI в XIa; XIa затем расщепляет фактор IX до IXa; фактор IXa вместе с кофактором VIIIa затем расщепляет большее количество фактора X до Xa, таким образом образуя взрывное количество тромбина из протромбина. Образовавшийся тромбин расщепляет фибриноген до фибрина, образуя сгусток, который плотно закупоривает разорванный сосуд и останавливает кровотечение. Интересно, что эти реакции происходят на поверхности тромбоцитов. Вновь образованный тромбин также усиливает активацию тромбоцитов. Образовавшийся фибрин будет стабилизирован за счет сшивания мономеров фибрина фактором XIIIa, образующегося при расщеплении фактора XIII тромбином.Образовавшиеся сгустки впоследствии лизируются ферментом плазмин. Каскад свертывания и система плазмина регулируются ингибиторами, которые поддерживают баланс. Сама стенка сосуда участвует в ингибировании неблагоприятной коагуляции и агрегации тромбоцитов внутри сосуда, обеспечивая слой эндотелиальных клеток, которые секретируют антикоагулянтные, фибринолитические и ингибирующие тромбоциты факторы, такие как тромбомодулин, тканевый активатор плазминогена и оксид азота, соответственно.

Когда этот механизм гемостаза и правильный баланс реакций нарушаются, это является патологией, приводящей либо к кровотечению, либо к тромбозу.Несмотря на обширные исследования, некоторые пути остаются неуловимыми, например механизмы, участвующие в инициации гемостаза. Поэтому мы ввели рыбок данио в качестве модели для изучения этого процесса, потому что эта рыба использовалась в качестве генетической модели для изучения развития. Более того, в сообществе людей, занимающихся гемостазом, существовало мнение, что гемостаз у рыб может быть примитивным и что рыбы не несут фрагменты клеток, называемые тромбоцитами, как у млекопитающих, и поэтому рыбки данио не могут быть подходящей моделью для изучения гемостаза млекопитающих (Jagadeeswaran et al ., 2007). По этим причинам мы охарактеризовали гемостаз у рыбок данио и предоставили доказательства того, что эти рыбы несут большинство факторов, регулирующих гемостаз, которые обнаруживаются у млекопитающих. Кроме того, несмотря на то, что тромбоциты рыб несут ядро, мы показали, что тромбоциты являются эквивалентами тромбоцитов у млекопитающих, а также несут ядерные факторы, подобные мегакариоцитам. Хотя тромбоциты являются ядросодержащими, сигнальные пути хорошо законсервированы, и поэтому нет причин, по которым эти тромбоциты нельзя использовать для моделирования активации тромбоцитов; после того, как все функциональные молекулы передачи сигналов тромбоцитов находятся в цитоплазме и на поверхности мембраны, все из которых присутствуют в тромбоцитах.Поэтому мы использовали рыбок данио для моделирования гемостаза у млекопитающих и для выявления новых факторов, управляющих гемостазом, используя силу генетики. Для этого нам нужны методы генетического скрининга. Несмотря на то, что мы разработали несколько тестов для измерения гемостатической функции, ни один из этих методов не затрагивает все факторы гемостаза, такие как факторы, присутствующие в плазме, тромбоцитах или эндотелии. Поэтому мы разработали глобальный метод, позволяющий анализировать все эти компоненты.Ниже мы описываем принцип метода и один из разработанных нами инструментов скрининга, называемый лазерно-индуцированным тромбозом (Gregory et al ., 2002).

Практика гемостаза: по последнему слову техники — Lippi

Введение

Физиологический гемостаз условно определяется как сложный биологический путь, направленный на остановку утечки крови из поврежденных венозных и артериальных сосудов и одновременное предотвращение чрезмерного или нежелательного свертывания крови, когда эти структуры неповреждены (1).Хотя подробное описание физиологического гемостаза здесь не приводится из-за нехватки места, необходимо описать некоторые важные элементы. Вкратце, гемостаз обычно делится на: первичная и вторичная, первая в основном включает в себя сужение сосудов и образование предварительной и лабильной тромбоцитарной пробки, а вторая представляет собой «свертывание крови» (2). Третий биологический механизм, обычно называемый фибринолизом, интегрируется в гемостаз за счет растворения сгустков крови, когда они больше не нужны (т.е., как только кровотечение было окончательно остановлено) (1) ( Рисунок 1 ).

Рисунок 1 Схематическое изображение физиологического гемостаза. а, активирован; F, коэффициент; ТФ, тканевой фактор.


Физиологический гемостаз

Повреждение кровеносного сосуда внезапно сопровождается началом сужения сосудов артерии, направленного на уменьшение размера сосудов и, следовательно, потенциального количества крови, которая может вытечь за пределы самого сосуда, после чего последовал процесс. за счет активации тромбоцитов крови, окружающих травму.Тромбоциты могут быть активированы либо прямым контактом с субэндотелиальными поверхностями (то есть коллагеном), которые становятся обнаженными после повреждения эндотелия, либо тромбином, вырабатываемым кровью. коагуляция, как описано в другом месте в этой статье. После активации тромбоциты претерпевают ряд биохимических и структурных изменений, в основном влекущих за собой изменения формы (для облегчения взаимодействия тромбоцитов с тромбоцитами), адгезию к субэндотелиальной оболочке. структуры и агрегацию (то есть связывание тромбоцитов с тромбоцитами) (1) ( Рисунок 1 ).При условии сохранения количества и функции тромбоцитов этот прежний механизм позволяет генерировать предварительная пробка, которая способствует замедлению или полному прекращению вытекания крови за пределы сосуда. Тем не менее, стабильность этой пробки сильно зависит от кровотока и напряжения сдвига, которые могут способствовать для постепенного растворения сгустка, подвергая пациента риску последующего кровотечения (3).

Стабилизация тромбоцитарной пробки, которая, следовательно, необходима для эффективного противодействия кровотечению, опосредуется активацией свертывания крови, конечной целью которой является создание достаточного количества нитей фибрина, которые действуют как строительный раствор. для кирпичей (т.э., тромбоциты). В отличие от прежних теорий, современное и «единое» видение свертывания крови больше не охватывает три различных пути (т. Е. Так называемые внутренние, внешние и общие пути), а рассматривает свертывание крови как интегрированная биологическая система, в основном собранная на клеточных структурах, начиная с высвобождения тканевого фактора (ТФ) из поврежденного эндотелия и продолжая далее с последовательной активацией многих неактивных процессов свертывания крови. белки, вплоть до поколения фибрина1) ( Рисунок 1 ).ТФ быстро после попадания в кровоток связывается с фактором (F) VII, образуя димерный белковый комплекс, который является автокаталитическим, но также способен активировать FX, следующий фактор в каскаде свертывания крови. В сочетании с активированным (а) FV с образованием так называемого протромбиназного комплекса, FXa катализирует превращение протромбина (FII) в тромбин (FIIa), который, следовательно, катализирует превращение фибриногена в фибрин. Хотя этот прямой биологический путь фактически эффективен для образования фибрина, общее количество продуцируемого здесь фибрина в значительной степени неэффективно для обеспечения стабильности сгустка (т.е.е., от 3 до 5% от общей необходимой суммы). Именно в этот момент в игру вступают факторы свертывания крови из ранее известного «внутреннего» пути (1). Тромбин не только способен активировать тромбоциты и преобразовывать фибриноген в фибрин ( Рисунок 1 ), но также катализирует превращение FXI в FXIa. Этот последний белок, в свою очередь, активирует FIX в FIXa, который в сочетании с его кофактором FVIIIa способствует превращению FX в FXa, тем самым замыкая «круг» и возвращая путь к протромбиназному комплексу.Этот специфический механизм, который долгое время считался «внутренним» путем, теперь более удобно известен как «тромбин». взрыв », который позволяет (при условии сохранения концентрации и активности всех факторов свертывания) генерировать необходимое количество фибрина для более эффективной стабилизации тромбоцитарной пробки после полимеризации, опосредованной FXIIIa. растворимого фибрина ( Рисунок 1 ) (1). Затем в физиологических условиях сгусток крови постепенно растворяется под действием фибринолитической системы (т.е. плазмином, превращенным из плазминогена тканевым активатором плазминогена), с высвобождением в кровоток так называемых продуктов деградации фибрина / фибриногена (FDP), включая D-димер (1).

Затем гемостатический баланс тонко модулируется рядом эндогенных ингибиторов, которые способны нейтрализовать один или несколько факторов свертывания крови и в основном представлены антитромбином (функция которого значительно усиливается гепарином. и другие гликозаминогликаны), путь белок C-белок S, ингибитор пути TF (TFPI, ранее известный как ингибитор внешнего пути), активируемый тромбином ингибитор фибринолиза (TAFI) и ингибитор активатора плазминогена-1 (PAI-1) ( Таблица 1 ) (4).

Таблица 1 Основные эндогенные ингибиторы свертывания крови и фибринолиза
Полная таблица

Комплексный подход к нарушениям гемостаза

В соответствии с более ранним определением гемостаза, нарушения этой биологической системы обычно классифицируются как геморрагические (т. Е. Относительно недостаточное свертывание крови) или тромботические (т.е., относительно непропорциональное свертывание). Независимо от природы и основных причин, диагностический подход к пациентам с нарушениями гемостаза неизбежно должен включать точный сбор истории болезни, физикальное обследование и результаты соответствующего количества. и вид лабораторных исследований ( Рисунок 2 ) (1,4-7). Клинический анамнез действительно является основой для точного диагноза, поскольку во многих случаях он обеспечивает: важная информация, чтобы различать наследственный или приобретенный характер кровотечения или тромбоза.Признаки и симптомы также имеют решающее значение. Хотя клиническое различие между нарушениями первичного и вторичного гемостаза не проводится. всегда так просто, особенно при определенных состояниях, таких как болезнь фон Виллебранда (БВ), дефекты первичного гемостаза чаще сопровождаются мгновенным и более поверхностным кровотечением, в то время как дефекты вторичного гемостаза гемостаз, как правило, задерживается и включает глубокие кровотечения (например, в мышцах, суставах, головном мозге, внутренних органах) (5).Что касается венозной тромбоэмболии (ВТЭ), даже в таких случаях клиника является фундаментальной, поскольку как тромбоз глубоких вен (ТГВ), так и тромбоэмболия легочной артерии (ТЭЛА) могут характеризоваться калейдоскопом предполагаемых симптомов, которые также могут привести к крайне неблагоприятным последствиям (вплоть до смерти) при отсутствии лечения (8). Тогда может быть полезна диагностическая визуализация, особенно для выявления наличия тромбов в периферических венах или легочных артериях, но также для определения места и тяжести кровотечений, особенно когда они затрагивают внутренние органы.И последнее, но не менее важное: лабораторный гемостаз теперь неизбежен для скрининга (то есть дооперационного тестирования), диагностики и терапевтического мониторинга как геморрагических, так и тромботических нарушений (9).

Рисунок 2 Практический алгоритм диагностики нарушений гемостаза.


Иерархическая классификация лабораторных исследований

Клинические лаборатории, находящиеся между постоянно растущим объемом тестов и все более частой нехваткой государственного финансирования (10,11), полностью привержены обеспечению качества и соответствия требованиям. которые не только будут способствовать устойчивости систем здравоохранения, но и предотвратят нанесение пациентам потенциально предотвратимого вреда (т.е. ложноположительные результаты теста, вызванные ненужными или необоснованными тестирование) (12). Поскольку список потенциально полезных тестов гемостаза постоянно расширяется, наиболее надежная стратегия сдерживания несоответствия предполагает разработку разумного приоритета подходящих тестов, которые Следовательно, их можно условно классифицировать как анализы первой линии (т. е. скрининг), второй линии (т. е. для этиологического диагноза) и третьей линии (т. е. для биохимической или даже молекулярной характеристики) анализов.Надежный пример того, как гемостаз тесты могут быть классифицированы для оптимизации ресурсов и улучшения диагностических и терапевтических соображений, обобщенные в , Таблица 2 . Эта возможная классификация фактически отражает классификацию лабораторных услуг, которые теперь все чаще организуются в «спицах» (т.е. периферийных), «хабах» (т. е. ядрах) и справочных объектах в пределах одной географической области (13), а также получают большие преимущества от калейдоскопа технологических инновации произошли в этой специфической области лабораторных испытаний (14-16).

Таблица 2 Иерархическая классификация тестов для скрининга, диагностики и терапевтического мониторинга геморрагических и тромботических нарушений
Полная таблица

В отличие от других областей лабораторной медицины (17), стандартизация и даже гармонизация не всегда выполняются для тестирования гемостаза (18). Точнее, хотя и с приемлемой степенью гармонизации в настоящее время достигнуто для некоторых тестов, таких как PT и APTT, все еще есть доказательства того, что другие тесты, такие как тестирование D-димера и фактора фон Виллебранда (VWF), все еще страдают серьезным несоответствием.Многие текущие наднациональные инициативы в настоящее время, с очевидным ожиданием того, что вскоре будет достигнута лучшая степень гармонизации (19,20).


Выводы

В настоящее время имеются неопровержимые доказательства того, что лабораторные тесты являются неотъемлемой частью диагностической аргументации и управляемой помощи пациентам с нарушениями гемостаза, как геморрагическими, так и тромботическими. Тем не менее, несколько важных вопросов все еще преследуют эту важную отрасль лабораторной медицины (, таблица 3, ), в том числе относительно скромные знания, которые многие лабораторные специалисты имеют о гемостазе при здоровье и болезни, неприемлемых неоднородность доступных диагностических алгоритмов как для диагностики (21), так и для лечения гемостатических заболеваний (22), точное определение референтных диапазонов (23), идентификация и передача критических значений (24), а также все еще неудовлетворительная гармонизация некоторых преаналитических (25), аналитических (18) и постаналитических ( 26) процедуры.

Таблица 3 Основные нерешенные проблемы при тестировании гемостаза
Полная таблица

Благодарности

Нет.


Конфликт интересов: Авторы не заявляют о конфликте интересов.


Список литературы

  1. Липпи Г., Фавалоро Э.Лабораторный гемостаз: вехи клинической химии и лабораторной медицины. Clin Chem Lab Med 2013; 51: 91-7. [Crossref] [PubMed]
  2. Lippi G, Favaloro EJ. Лабораторный гемостаз: от биологии к стенду. Clin Chem Lab Med 2018; 56: 1035-45. [Crossref] [PubMed]
  3. Lippi G, Favaloro EJ. Венозный и артериальный тромбозы: две стороны одной монеты? Семин Тромб Хемост 2018; 44: 239-48. [Crossref] [PubMed]
  4. Lippi G, Franchini M, Guidi GC.Диагностический подход к наследственным нарушениям свертываемости крови. Clin Chem Lab Med 2007; 45: 2-12. [Crossref] [PubMed]
  5. Lippi G, Franchini M, Favaloro EJ. Диагностика наследственных нарушений свертываемости крови при вторичном гемостазе: простое руководство для повседневных клинических лабораторий. Семин Тромб Хемост 2016; 42: 471-7. [Crossref] [PubMed]
  6. Lippi G, Pasalic L, Favaloro EJ. Выявление легких наследственных нарушений свертывания крови: актуальные варианты и личные рекомендации.Эксперт Рев Гематол 2015; 8: 527-42. [Crossref] [PubMed]
  7. Lippi G, Danese E, Favaloro EJ, et al. Диагностика венозной тромбоэмболии: от истоков к перспективам. Семин Тромб Хемост 2015; 41: 374-81. [Crossref] [PubMed]
  8. Lippi G, Franchini M, Targher G, et al. Помогите мне, доктор! Мой D-димер повышен. Энн Мед 2008; 40: 594-605. [Crossref] [PubMed]
  9. Bonar RA, Lippi G, Favaloro EJ.Обзор гемостаза и тромбоза и вклад лабораторных исследований в диагностику и лечение нарушений гемостаза и тромбоза. Методы Мол Биол 2017; 1646: 3-27. [Crossref] [PubMed]
  10. Липпи Г., Плебани М. Дополнительные преимущества лабораторной диагностики: множество причин, по которым лицам, принимающим решения, действительно стоит заботиться. Журнал J Lab Precis Med 2017; 2: 100. [Crossref]
  11. Липпи Г. Оценка эффективности здравоохранения и имеющихся ресурсов: ценность — это цель.Диагноз (Берл) 2018; 5: 39-40. [Crossref] [PubMed]
  12. Lippi G, Bovo C, Ciaccio M. Несоответствие в лабораторной медицине: слон в комнате? Ann Transl Med. 2017; 5: 82. [Crossref] [PubMed]
  13. Lippi G, Bassi A, Bovo C. Будущее лабораторной медицины в эпоху точной медицины. J Lab Precis Med 2016; 1: 7. [Crossref]
  14. Lippi G, Bovo C, Favaloro EJ. Размышления о новом поколении инструментов для гемостаза.Взгляд в будущее? J Lab Med 2016; 40: 1-7.
  15. Lippi G, Plebani M, Favaloro EJ. Меняющийся облик тестирования гемостаза в современных лабораториях: консолидация, автоматизация и многое другое. Семин Тромб Хемост 2015; 41: 294-9. [Crossref] [PubMed]
  16. Lippi G, Plebani M, Favaloro EJ. Технологические достижения в лаборатории гемостаза. Семин Тромб Хемост 2014; 40: 178-85. [Crossref] [PubMed]
  17. Plebani M, Graziani MS, Tate JR.Гармонизация в лабораторной медицине: Дует ветер. Clin Chem Lab Med 2018. [Epub перед печатью]. [Crossref] [PubMed]
  18. Favaloro EJ, Lippi G. О сложности гемостаза и необходимости гармонизации тестовой практики. Clin Chem Lab Med 2018. [Epub перед печатью]. [PubMed]
  19. Фавалоро Э.Дж., Дженнингс И., Олсон Дж. И др. На пути к гармонизации внешней оценки качества / проверки квалификации в области гемостаза. Clin Chem Lab Med 2018; 57: 1670-80.[PubMed]
  20. Фавалоро Э. Дж., Госселин Р., Олсон Дж. И др. Недавние инициативы по гармонизации практики гемостаза. Clin Chem Lab Med 2018. [Epub перед печатью]. [PubMed]
  21. Thachil J, Lippi G, Favaloro EJ. Тестирование D-димера: лабораторные аспекты и текущие проблемы. Методы Мол Биол 2017; 1646: 91-104. [Crossref] [PubMed]
  22. Lippi G, Favaloro EJ. Последние руководящие принципы и рекомендации по лабораторной оценке пероральных антикоагулянтов прямого действия (DOAC): есть ли консенсус? Clin Chem Lab Med 2015; 53: 185-97.[Crossref] [PubMed]
  23. Favaloro EJ, Lippi G. Контрольные диапазоны при тестировании гемостаза: необходимо, но несовершенно. Журнал J Lab Precis Med 2017; 2:18. [Crossref]
  24. Lippi G, Adcock D, Simundic AM и др. Критические лабораторные значения в гемостазе: к консенсусу. Энн Мед 2017; 49: 455-61. [Crossref] [PubMed]
  25. Lippi G, Favaloro EJ. Преаналитические вопросы тестирования гемостаза и тромбоза. Методы Мол Биол 2017; 1646: 29-42.[Crossref] [PubMed]
  26. Favaloro EJ, Lippi G. Постаналитические вопросы гемостаза и тестирования на тромбоз. Методы Мол Биол 2017; 1646: 545-59. [Crossref] [PubMed]

doi: 10.21037 / jlpm.2018.07.07
Цитируйте эту статью как: Lippi G, Favaloro EJ. Практика гемостаза: по последнему слову техники. Журнал J Lab Precis Med 2018; 3:67.

Нарушения гемостаза у животных — сердечно-сосудистая система

Была представлена ​​клеточная модель гемостаза, которая объясняет физиологический гемостаз через сложный процесс, в котором взаимодействие сосудистого тонуса, кровотока, эндотелиальных клеток, тромбоцитов, лейкоцитов, факторов свертывания крови и фибринолитических факторов и их кофакторов и ингибиторов приводит к сбалансированный гемостаз и образование сгустка на месте повреждения.Эта динамическая модель включает клеточную регуляцию коагуляции в трех фазах: инициация, амплификация и распространение.

ТФ-несущие клетки инициируют гемостаз. TF представляет собой трансмембранный гликопротеиновый рецептор, обнаруживаемый во внесосудистых тканях, включая капсулы органов и адвентицию стенок кровеносных сосудов. Он конститутивно экспрессируется на фибробластах, а при клеточной активации — на гладкомышечных клетках сосудов, моноцитах и ​​нейтрофилах. Клетки, несущие ТФ, и поверхности тромбоцитов действуют как основные клеточные поверхности для сборки прокоагулянтных комплексов.Любое повреждение сосуда приводит к воздействию ТФ. Связывание фактора VII с TF приводит к активации фактора VIIa. Фактор VIIa, связанный с TF на поверхности клетки, активирует фактор IX до фактора IXa и фактор X до фактора Xa. Первоначально образующийся Фактор Ха ограничен клеткой, несущей ТФ, потому что Фактор Ха, который диффундирует из клетки, быстро ингибируется ингибитором пути ТФ (TFPI) или антитромбином.

Вместе с образующимся фактором Va, фактор Ха собирается в протромбиназный комплекс на поверхности клетки, несущей ТФ.Начальное небольшое количество тромбина рядом с клеткой, независимо от присутствия тромбоцитов, генерируется и отвечает за активацию тромбоцитов, высвобождение фактора V из тромбоцитов, активацию фактора V, активацию фактора VIII и высвобождение фактора VIII из фоновой ткани. Фактор Виллебранда и активация фактора XI. Тромбоциты также активируются другими механизмами, включая коллаген сосудистой стенки и фактор фон Виллебранда, что приводит к адгезии и агрегации на поврежденном участке.

В качестве важной части процесса активации тромбоцитов становится доступным прокоагулянтный фосфолипид фосфатидилсерин.Первоначально созданный фактор IXa связывается с активированными поверхностями тромбоцитов, способствуя образованию комплекса «теназа»; это приводит к образованию основного фактора Ха и усилению процесса свертывания.

Написать ответ

Ваш адрес email не будет опубликован.