Пигментный обмен

В Клинико-диагностической лабораторий производится определение следующих показателей пигментного обмена:

• Билирубин общий.
• Билирубин прямой.

Что такое пигментный обмен?

Под пигментным обменом понимается совокупность сложных превращений различных окрашенных веществ в организме человека. Наиболее изученным является пигмент крови – гемоглобин. Промежуточным этапом его метаболизма является образование билирубина, превращения которого в основном происходят в печени.

В печени происходит его связывание с глюкуроновой кислотой и называется конъюгированным (прямым), а свободный билирубин – непрямым (неконъюгированным). В таком виде (свыше 97% конъюгированного, остальное – неконъюгированный билирубин) билирубин поступает из печени в желчь и в тонкую кишку, где происходят дальнейшие его превращения.

Возрастание уровня билирубина в сыворотке крови называется гипербилирубинемией. Это состояние может быть следствием образования билирубина в большем количестве, чем то, которое нормальная печень не может экскретировать; повреждений печени, нарушающих экскрецию билирубина в нормальных количествах, а также вследствие закупорки желчевыводящих протоков печени, что препятствует выведению билирубина.

Во всех этих случаях билирубин накапливается в крови и по достижении определенной концентрации диффундирует в ткани, окрашивая их в желтый цвет. Это состояние называется желтухой.

От того, какая форма билирубина преобладает в сыворотке крови, неконъюгированная (непрямая) или конъюгированная (прямая), гипербилирубинемия классифицируется как неконъюгированная и конъюгированная.

В клинической практике наиболее широкое распространение получило деление желтух на гемолитические, паренхиматозные и обтурационные. Гемолитические и паренхиматозные желтухи – это неконъюгированная, а обтурационные – это конъюгированная гипербилирубинемия.

Причины увеличение содержание билирубина в крови:

1. увеличение интенсивности гемолиза эритроцитов;
2. поражение паренхимы печени с нарушением ее билирубинвыделительной функции;
3. нарушение оттока желчи из желчных путей в кишечник;
4. выпадение ферментного звена, обеспечивающего биосинтез глюкуронидов билирубина;
5. нарушение печеночной секреции прямого билирубина в желчь.

Определение уровня билирубина и различных его форм позволяет решить следующие задачи:

• выявление увеличенного содержания билирубина в крови в тех случаях, когда при осмотре больного желтуха не выявляется или ее наличие вызывает сомнение. Желтушная окраска кожи появляется тогда, когда содержание билирубина в крови превышает 30-35 мкмоль/л;
• объективная оценка степени билирубинемии;
• дифференциальная диагностика различных видов желтух;
• оценка течения заболевания путем повторных исследований.

Пигментный обмен в норме и при патологии

1. Пигментный обмен в норме и при патологии

Выполнила: Баймухан Молдир
Проверила: Бисенбина Г.Ж.

2. Пигменты (Лейтес С. М., Лаптева И. Н., 1967)

Гематогенные
(гемохромогенные)
Альбуминогенные
Липогенные

3. Гематогенные (гемохромогенные)пигменты

Гем
— железосодержащий пигмент, входящий в состав физиологически активных
молекул, так называемых дыхательных пигментов: гемоглобина, цитохромов,
каталазы
Желчные пигменты (продукты распада гемоглобина и других
хромопротеидов — миоглобина, цитохромов и гемсодержащих ферментов):
а) Билирубин (пигмент желчи)
б) Уробилиноиды (выводимые с калом и мочой)
— Стеркобилиноген
— Стеркобилин
— Уробилиноген
— Уробилин

4.

Метаболизм билирубина Образование билирубина
Транспорт билирубина
Поглощение паренхимальными клетками печени
Конъюгация билирубина в гладком
эндоплазматическом ретикулуме гепатоцитов
Секреция из эндоплазматического ретикулума в
желчь
Преобразование билирубина в тонкой и толстой
кишке
Выделение билирубина с калом и мочой

6. Образование билирубина

a)
b)
Билирубин (тетрапиррольный пигмент), образуется в клетках
ретикуло-эндотелиальной системы (РЭС) селезенки и печени в
процессе катаболизма геминовой части:
80 % из гемоглобина (протопорфирина IX, около 8-9 г. в день) при разрушении
эритроцитов (время их жизни около 4 месяцев)
20% из миоглобина, цитохромов дыхательной цепи и при распаде
предшественников эритроцитов в красном костном мозге
Распад гемоглобина в клетках РЭС при участии ферментов:
a)
c)
Разрывается связь в порфириновом кольце, гемоглобин окисляется и
образуется пигмент вердоглобин
Освобождается железо и белок – глобин, цепь пиррольных колец
распрямляется и образуется пигмент зеленого цвета – биливердин
Биливердин восстанавливается в пигмент оранжевого цвета – билирубин
При распаде 1 г. гемоглобина образуется 34 мг. билирубина
b)

7. Транспорт билирубина

a)
b)
c)
d)
e)
f)
Билирубин, попадая из клеток РЭС в сыворотку крови,
электростатически взаимодействует с альбумином и
транспортируется в печень
Каждая молекула альбумина реагирует с двумя молекулами
билирубина (1 г. альбумина заключает в себе 17 мг. билирубина)

Комплекс альбумин-билирубин – это непрямой билирубин
(свободный, неконьюгированный):
Неполярен
Не растворим в воде
Токсичен
Дает непрямую реакцию с диазореактивом Ван-ден-Бергенра
(необходимо добавление ускорителя)
Плохо проникает в ткани
Отсутствует в моче

8. Поглощение паренхимальными клетками печени

Диссоциация
комплекса альбумин-билирубин
на поверхности плазматической мембраны
гепатоцита
Прохождение свободного билирубина в клетку
при участии белков-переносчиков: лигандина и
протеина Z

9. Конъюгация билирубина в гладком эндоплазматическом ретикулуме гепатоцитов

a)
b)
c)
d)
e)
f)
В гепатоцитах к билирубину присоединяются полярные группы, и
он переходит в водорастворимую форму
Сначала происходит образование моноглюкуронида билирубина (в
эндоплазматическом ретикулуме гепатоцитов), а затем
диглюкуронида билирубина (в канальцах мембраны гепатоцитов) с
участием фермента уридиндифосфатглюкуронилтрансферазы
Конъюгированный с глюкуроновой кислотой – это прямой
билирубин (связанный):
Полярен
Растворим в воде
Нетоксичен
Дает прямую реакцию с диазореактивом
Хорошо проникает в ткани
Присутствует в моче

10.

Секреция из эндоплазматического ретикулума в желчь Билирубин секретируется в желчь
преимущественно в виде диглюкуронида
билирубина.
Секреция конъюгированного билирубина в желчь
происходит против весьма высокого градиента
концентрации при участии механизмов активного
транспорта, т.к. концентрация билирубина в клетке
меньше, чем в желчном капилляре
Нормальная желчь содержит 25% билирубинмоноглюкуронида, 75% диглюкуронида и следы
неконъюгированного билирубина

11. Преобразование билирубина в тонкой и толстой кишке

Гидролизация билирубинглюкуронида специфическими
бактериальными ферментами (b-глюкуронидазами)
Восстановление свободного билирубина кишечной
микрофлорой с последовательным образованием
мезобилирубина и мезобилиногена (уробилиногена)
В подвздошной и толстой кишках часть образовавшегося
мезобилиногена (уробилиногена) всасывается через кишечную
стенку, попадает в портальную вену и поступает в печень, где
полностью расщепляется до дипирролов, поэтому в норме в
общий круг кровообращения и в мочу мезобилиноген
(уробилиноген) не попадает
Большая часть бесцветных мезобилиногенов, образующихся в
толстой кишке, окисляется в стеркобилиноген, который в
нижних отделах толстой кишки (в основном в прямой кишке)
окисляется до стеркобилина

12.

Выделение билирубина с калом и мочой Образовавшийся стеркобилиноген (суточное
количество 100-200 мг.) почти полностью
выделяется с калом, окисляясь на воздухе в
стеркобилин, являющийся одним из пигментов кала
Небольшая часть стеркобилиногена (уробилина)
всасывается в нижних участках толстой кишки в
систему нижней полой вены и в дальнейшем
выводится почками с мочой
При повреждении паренхимы печени процесс
расщепления мезобилиногена (уробилиногена) до
дипирролов нарушается и уробилиноген переходит
в общий кровоток и оттуда в мочу

13. Метаболизм билирубина (схема)

14. Клинико-диагностическое значение исследования пигментного обмена

Референтные
величины концентрации общего
билирубина в сыворотке крови менее 0,2−1,0
мг/дл (менее 3,4−17,1 мкмоль/л).
Возрастание концентрации билирубина в
сыворотке крови выше 17,1 мкмоль/л называют
гипербилирубинемией

15. Преимущественно непрямая гипербилирубинемия

I. Избыточное образование билирубина
А. Гемолиз (внутри- и внесосудистый)
Б. Неэффективный эритропоэз
II. Сниженный захват билирубина в печени

А. Длительное голодание
Б. Сепсис
III. Нарушение коньюгации билирубина
А. Наследственная недостаточность
глюкуронилтрансферазы
− Синдром Жильбера (лёгкая недостаточность
глюкуронилтрансферазы)
− Синдром Криглера−Найяра II типа (умеренная
недостаточность глюкуронилтрансферазы)
− Синдром Криглера−Найяра I типа (отсутствие
активности глюкуронилтрансферазы)
Б. Физиологическая желтуха новорождённых (преходящая
недостаточность глюкуронилтрансферазы; повышенное
образование непрямого билирубина)
В. Приобретённая недостаточность
глюкуронилтрансферазы
− Приём некоторых препаратов (например,
хлорамфеникола)
− Желтуха от материнского молока (угнетение активности
глюкуронилтрансферазы прегнандиолом и жирными
кислотами, содержащимися в грудном молоке)
− Поражение паренхимы печени (гепатиты, цирроз)

16.

Преимущественно прямая гипербилирубинемия I. Нарушение экскреции билирубина в желчь
А. Наследственные нарушения
− Синдром Дабина−Джонсона
− Синдром Ротора
− Доброкачественный рецидивирующий
внутрипечёночный холестаз
− Холестаз беременных
Б. Приобретённые нарушения
− Поражение паренхимы печени (например, при
вирусном или лекарственном гепатите, циррозе
печени)
− Приём некоторых препаратов (пероральные
контрацептивы, андрогены, хлорпромазин)
− Алкогольное поражение печени
− Сепсис
− Послеоперационный период
− Парентеральное питание
− Билиарный цирроз печени (первичный или
вторичный)
II. Обструкция внепечёночных желчных протоков
А. Обтурация
− Холедохолитиаз
− Пороки развития желчных путей (стриктуры,
атрезия, кисты жёлчных протоков)
− Гельминтозы (клонорхоз и другие печёночные
трематодозы, аскаридоз)
− Злокачественные новообразования
(холангиокарцинома, рак фатерова соска)
− Гемобилия (травма, опухоли)
− Первичный склерозирующий холангит
Б. Сдавление
− Злокачественные новообразования (рак
поджелудочной железы, лимфомы,
лимфогранулематоз, метастазы в лимфатические
узлы ворот печени).
− Воспаление (панкреатит)

17. СПАСИБО ЗА ВНИМАНИЕ

Пигментный обмен — KDLmed

Продукт распада гемоглобина, а именно его части, ответственной за непосредственный перенос кислорода — гема. Пигмент, содержащийся во всех биологических жидкостях организма. Общий билирубин делится на конъюгированный (прямой) и свободный (непрямой) в зависимости от наличия химической связи с глюкуроновой кислотой, которая присоединяется к нему в печени.Уровень билирубина в крови отражает состояние пигментного обмена в организме, который может нарушаться в силу врожденных и приобретенных причин. Уровень непрямого билирубина в крови изменяется при усиленном распаде эритроцитов – гемолизе, причиной которого могут быть различные патологические состояния, приводящие к разрушению эритроцитов в кровяном русле. Уровень прямого билирубина повышается при патологии печени и желчевыводящих путей. Концентрация билирубина в крови имеет диагностическую значимость при вирусных гепатитах, циррозе печени, жировом гепатозе, желчнокаменной болезни, опухолях поджелудочной железы, синдроме Жильбера, приеме некоторых лекарственных препаратов. Срок выполнения исследования: 1 сутки. Указанный срок не включает день взятия биоматериала

Растворимая, связанная с глюкуроновой кислотой фракция билирубина. Связанный в печени с глюкуроновой кислотой билирубин дает быструю, прямую, реакцию с диазореактивом, откуда и происходит его название. Так как процесс конъюгации билирубина с кислотой происходит в печени, прямой билирубин является маркером поражения её ткани, откуда и попадает в кровь. Уровень прямого билирубина исследуют при гепатитах и других патологических состояниях, сопровождающихся паренхиматозной желтухой. Срок выполнения исследования: 1 сутки. Указанный срок не включает день взятия биоматериала

Обследование используется для диагностики таких заболеваний как гепатит, желчекаменная болезнь, дискинезия желчевыводящих путей, синдром Жильбера и других, сопровождающихся нарушением обмена желчных пигментов («желтухой»). Билирубин – это продукт распада гемоглобина, а именно его части, ответственной за перенос кислорода — гема. Пигмент, содержащийся во всех биологических жидкостях организма. Общий билирубин делится на фракции: прямой (конъюгированный) и непрямой (свободный) в зависимости от наличия химической связи с глюкуроновой кислотой, которая присоединяется к нему в печени.Уровень непрямого билирубина в крови изменяется при усиленном распаде эритроцитов – гемолизе, причиной которого могут быть различные патологические состояния, приводящие к разрушению эритроцитов в кровяном русле. Уровень прямого билирубина повышается при патологии печени и желчевыводящих путей. Концентрация билирубина в крови имеет диагностическую значимость при вирусных гепатитах, циррозе печени, жировом гепатозе, желчнокаменной болезни, опухолях поджелудочной железы, синдроме Жильбера, приеме некоторых лекарственных препаратов. Результаты обследования выдаются с интерпретацией врача. Срок выполнения исследования: 1 сутки. Указанный срок не включает день взятия биоматериала

Исследование пигментного обмена в Москве

Исследование пигментного обмена в Москве | ФНКЦ ФМБА России Уточнить направление

x

Дыхательная системаИммунная системаИнфекцииКровь и Кроветворная системаМочевыделительная системаНервная системаОпорно-двигательная системаОпорнодвигательная системаПишеварительная ситемаПищеварительная системаПокровная система (кожа), волосы и ногтиПоловая системаСердечно-сосудистая системаЭндокринная системаСистемы

Сбросить

Исследование уровня билирубина связанного (конъюгированного) в крови

Код услуги: А09. 05.022.001

270 ₽

Билирубин прямой (связанный) – разновидность билирубина, которая может растворяться в воде и в норме выводится из организма преимущественно вместе с желчью. В норме прямой билирубин почти не содержится в крови.

билилирубин связанный билирубин прямой

Исследование уровня общего билирубина в крови

Код услуги: А09.05.021

260 ₽

Уровень общего билирубина в крови — это показатель, с помощью которого можно оценить работу печени и состояние желчных протоков.

общий билирубин билирубин в крови билирубин

Правила сдачи анализов

В нашем Центре возможно сдать анализы ежедневно в порядке «живой» очереди:

Пн-Сб8:00–19:30

Вс9:00–15:30

Обращаем Ваше внимание, что в соответствии со статьями 13 и 22 Федерального закона от 21 ноября 2011 323-ФЗ «Об основах охраны здоровья граждан в Российской Федерации» выдача результатов исследований осуществляется ПАЦИЕНТУ ЛИЧНО В РУКИ при предъявлении паспорта.

Выдача результатов исследований другим лицам возможна только при наличии ДОВЕРЕННОСТИ, оформленной в соответствии с нормами действующего законодательства.

Cтоимость анализов указана без учета взятия биоматериала.

— синтез и распад гема

Пигментный обмен — это совокупность сложных превращений окрашенных веществ тканей и биологических жидкостей. Большинство пигментов имеет белковое происхождение и являются дериватами порфириновых структур и ароматических соединений.

Одним из важнейших пигментов является гем, входящий в состав гемоглобина, миоглобина, цитохромов, каталазы. Вторую группу пигментов составляют предшественники гема — порфирины. Третья представлена продуктами распада гема — желчными пигментами. К четвертой группе относятся меланины — пигменты кожи, волос и роговицы глаза, являющиеся продуктом полимеризации диоксииндола, образующегося в процессе обмена тирозина.

Дефекты ферментов синтеза гема и метаболизма порфиринов подразделяются на первичные — наследственные энзимопатии, получившие название «порфирии», и вторичные — приобретенные, составляющие группу под названием «порфиринурии». Эти заболевания сопровождаются накоплением и выведением в избытке с мочой и калом различных производных порфиринов.

Основная часть желчных пигментов образуется при распаде гема и гемоглобина в клетках ретикулоэндотелиальной системы (РЭС) и представляет собой многоступенчатый процесс: при окислении гемоглобина образуется вердоглобин; после отщепления глобина и железа образуется биливердин, который далее восстанавливается до билирубина. Билирубин — желто-красный пигмент, представляющий собой линейный тетрапиррол, токсичное, жирорастворимое вещество, способное нарушать окислительное фосфорилирование в клетках, в первую очередь в нервной ткани. В крови билирубин либо находится в свободном состоянии, либо в комплексе с альбумином (частично в виде альбумин-фосфатидного комплекса), в меньшем количестве — в комплексах с металлами, аминокислотами, пептидами и другими малыми молекулами. Образование таких комплексов предотвращает выделение билирубина с мочой. Такая форма билирубина называется свободной (неконъюгированной, несвязанной, непрямой). Она не дает прямой реакции с диазореактивом Эрлиха.

Из сосудистого русла в гепатоциты билирубин попадает с помощью белка-переносчика (лигандина). В печени, при участии фермента УДФ‑глюкуронилтрансферазы, происходит реакция этерификации — взаимодействие OH‑группы глюкуроновой кислоты с карбоксильными группами билирубина и образование конъюгированного (связанного, прямого) билирубина, представляющего собой парное соединение с одним или двумя остатками глюкуроновой кислоты (моно- или диглюкуронид). Кроме глюкуроновой кислоты в реакцию могут вступать сульфаты, фосфаты, глюкозиды. В норме конъюгированный билирубин активно секретируется в желчные капилляры, где при участии β‑глюкуронидазы, вновь превращается в свободный билирубин и с током желчи попадает в тонкий кишечник. Здесь ферментами бактериальной флоры он восстанавливается до мезобилирубина и мезобилиногена (уробилиногена). Часть последних всасывается и с током крови вновь попадает в печень, где окисляется до ди‑ и трипирролов. При этом в здоровом организме в общий круг кровообращения и в мочу мезобилирубин и уробилиноген не попадают, а полностью задерживаются гепатоцитами. Невсосавшаяся часть пигментов ферментами бактериальной флоры толстого кишечника восстанавливается до стеркобилиногена и выделяется из организма, окрашивая кал. Незначительное количество стеркобилиногена через геморроидальные вены попадает в большой круг кровообращения, отсюда –– в почки и выделяется с мочой. На воздухе стеркобилиноген и уробилиноген превращаются, соответственно, в стеркобилин и уробилин.

В клинике состояние пигментного обмена определяют, оценивая:

1. Количество промежуточных и конечных метаболитов синтеза порфириновых структур (порфобилиногена, δ‑аминолевулиновой кислоты, копропорфирина, уропорфирина) и активность δ‑аминолевулинат-дегидратазы.
2. Уровень желчных пигментов — продуктов распада гемоглобина и других хромопротеидов (общего билирубина и его фракций).

Резистин и пигментный обмен у больных с неалкогольной жировой болезнью печени в сочетании с сахарным диабетом 2 типа Текст научной статьи по специальности «Науки о здоровье»

Материалы 16-го Международного медицинского … | Materials of the 16th International Slavic-Baltic Scientific Forum.

показатели, липидный и углеводный обмен, плазменный уровень адипонектина (АН), ФНО-а. В зависимости от наличия АО пациенты разделены на группы: 1-я группа (п = 25) с наличием АО, 2-я (п = 20) — без АО.

Результаты. Среди пациентов с АО ожирение I ст. диагностировано у 64,0%, II — у 31,4% и III — у 4,6%. У 63,0% пациентов 2-й группы диагностирована избыточная масса тела, а у 37,0% выявлены нормальные значения индекса массы тела (ИМТ). Нарушения ли-пидного обмена в 2,4 раза чаще встречались у больных с АО, чем в группе сравнения (р < 0,01). При этом у 68,4% больных с АО была выявлена гиперхолесте-ринемия, у 20,7% — увеличение ХС ЛПНП, у 33,1% — снижение ХС ЛПВП, а гипертриглицеридемия — у 42,0% (р < 0,05). Индекс НОМА-Ш коррелировал с ИМТ (г = 0,3; р < 0,001), ОТ (г = 0,4; р < 0,001), ОТ/ ОБ (г = 0,2; р < 0,001), уровнем ТГ (г = 0,3; р < 0,001). Уровень АН у пациентов без АО был в 1,4 раза выше, чем в группе сравнения (р < 0,05). Уровень ФНО-а у больных с АО был в 2,1 раза выше, чем во 2-й группе (р < 0,05), отрицательно коррелировал с уровнем ХС ЛПВП (г = — 0,3; р < 0,05) и АН (г = — 0,3; р < 0,05), а положительно — с ОТ (г = 0,3; р < 0,05) и НОМА-Ш (г = 0,3; р < 0,05).

Выводы. Течение НАЖБП у пациентов с АО сопровождается более выраженными метаболическими нарушениями, что способствует раннему формированию МС, обусловленному дислипидемией, инсулинорезистентностью, развитием воспаления и гипоадипонектинемией.

40. Изменения липидного профиля при изолированном и сочетанном течении хронического панкреатита и сахарного диабета типа 2

Журавлева Л. В., Шеховцова Ю. А. Харьковский НМУ, Украина

Цель исследования: изучение липидного профиля у пациентов с сочетанным течением хронического панкреатита (ХП) и сахарного диабета типа 2 (СД-2).

Материалы и методы. Исследовали показатели липидного обмена у 63 пациентов. В 1-ю группу (п = 20) были включены больные с сочетанным течением ХП и СД-2, во 2-ю (п = 21) — с ХП, в 3-ю (п = 23) — с СД-2. Средний возраст составил (52,1 ± 2,8) года, НЬА1С < 7,5%.

Результаты. Индекс массы тела (ИМТ) в среднем составил (25,8 ± 4,2) кг/м2 во 2-й и (33,2 ± 3,7) кг/м2 — в 1-й и 3-й группах (р < 0,05). Дислипидемии достоверно чаще встречались в 1-й группе (67,4%), чем во 2-й и 3-й (44,2% и 52,3% соответственно; р < 0,05). Гипертриглицеридемия выявлялась чаще у пациентов 1-й группы (76,3%) в сравнении с пациентами 2-й и 3-й групп (38,4% и 52,8% соответственно; р < 0,05). Уровень ОХС во всех группах повышался пропорционально ИМТ (г = 0,39; р < 0,05). Соотношение ТГ/ХС ЛПВП в 1-й группе было на 38% выше, чем в 2-й, и на 22% выше, чем в 3-й (р < 0,05). Показатель ХСЛПНП коррелировал с уровнем ОХС (г = 0,67; р < 0,001), с ИМТ (г = 0,38; р < 0,001), с индексом НОМА-Ш (г = 0,18; р < 0,001).

Выводы. При сочетанном течении ХП с СД-2 наблюдается выраженная дислипидемия, взаимосвя-

занная с другими компонентами метаболического синдрома.

41. Резистин и пигментный обмен у больных

с неалкогольной жировой болезнью печени в сочетании с сахарным диабетом 2 типа

Журавлева Л. ас БрейгоМеЛ»). Уровень резистина определялся им-муноферментным методом (реактивы «BioVendor»).

Результаты. Средний уровень резистина достоверно (р < 0,001) повышался во всех группах по сравнению с группой контроля, где он составил (4,87 ± 0,11) нг/мл, уровень был наиболее высоким в 3-й группе — (10,0 ± 0,1) нг/мл и значимо отличался от показателей в 1-й и 2-й группе — (7,56 ± 0,21) нг/мл и (8,06 ± 0,23) нг/мл соответственно. В 1-й группе корреляции не выявлены. Во 2-й группе резистин коррелировал с конъюгированным билирубином (г = 0,46, р < 0,05). В 3-й группе выявлена корреляция резистина с общим (г = 0,59; р < 0,05) и конъюгированным (г = 0,71; р < 0,05) билирубином.

Выводы. Полученные корреляционные связи между резистином и показателями пигментного обмена подтверждают роль исследуемого показателя в патогенезе НАЖБП, а именно, в прогрессировании синдрома цитолиза, особенно у больных с сопутствующим СД-2 на фоне ожирения. Повышенный уровень резистина в плазме крови может быть дополнительным фактором, отягощающим течение НАЖБП у больных с метаболическими нарушениями.

З

42. Пожилой возраст как фактор риска полиморбидности у пациентов гастроэнтерологического профиля

Задорожная Н. А., Кьергаард А. В. НГУ физической культуры, спорта и здоровья им. П. Ф. Лесгафта, Санкт-Петербург, Россия, е-таП: 2аЛогоЛпауа_10@таП.ги

Цель исследования: оценить особенности течения заболеваний гастроэнтерологического профиля в гериатрической практике; изучить с учетом полиморбидного фона влияние на функционально-морфологическое состояние ЖКТ применения немедикаментозных факторов у больных пожилого и старческого возраста с кислотозависимыми заболеваниями.

Пигментный обмен и синдром желтухи

1. Каковы свойства свободного (непрямого) билирубина?

1. Связан с белком

2. Связан с глюкуроновой кислотой

3. Растворимый в воде

4. Нерастворимый в воде

5. Выводится с мочой в норме

2. При каких желтухах повышается свободный (непрямой) билирубин в крови?

1. Надпеченочной (гемолитической)

2. Подпеченочной (механической)

3. Печеночной

2. При всех

3. Назовите свойства связанного (прямого) билирубина.

1. Связан с белком

2. Связан с глюкуроновой кислотой

3. Растворимый в воде

4. Нерастворимый в воде

5. Выявляется в моче в норме

4. При каких желтухах повышается связанный (прямой) билирубин в крови?

1. Надпеченочной

2. Печеночной

3. Подпеченочной

4. При всех

5. При какой желтухе одновременно повышается свободный и связанный би­лирубин в крови?

1. Надпеченочной.

2. Печеночной.

3. Подпеченочной.

4. При всех.

6. Каковы особенности метаболизма уробилиногена?

1. Образуется из холестерина.

2. Образуется из билирубина.

3. Образуется из стеркобилиногена.

4. Образуется в тонком кишечнике.

7. Уробилиноиды в моче выявляются … .

1. Качественной пробой Богомолова

2. Качественной пробой Ван ден Берга

3. Качественной пробой Флоранса

4. Качественной пробой Розина

8. При каких желтухах выявляются уробилиноиды в моче?

1. При печеночной.

2. При подпеченочной.

3. При надпеченочной.

4. При всех.

9. При какой желтухе выявляется одновременно билирубин и уробилиноиды в моче?

1. При печеночной.

2. При подпеченочной.

3. При надпеченочной.

4. При всех.

10. Каковы особенности метаболизма стеркобилиногена?

1. Образуется из билирубина.

2. Образуется из холестерина.

3. Образуется в толстом кишечнике.

4. Выводится с калом в норме.

11. При какой желтухе повышается стеркобилиноген в кале?

1. При печеночной.

2. При подпеченочной.

3. При надпеченочной.

4. При всех.

12. При каких желтухах может не выявляться стеркобилиноген в кале?

1. При печеночной.

2. При подпеченочной.

3. При надпеченочной.

4. При всех.

13. При какой желтухе повышаются свободный билирубин в крови, уробили­ноиды в моче и стеркобилиноген в кале?

1. При печеночной.

2. При подпеченочной.

3. При надпеченочной.

4. При всех.

14. При какой желтухе повышается билирубин в крови, который выводится с мочой, отсутствуют уробилиноиды в моче и стеркобилиноген в кале?

1. При печеночной.

2. При подпеченочной.

3. При надпеченочной.

4. При всех.

15. При какой желтухе повышаются свободный и связанный билирубин в крови; выявляются билирубин и уробилиноиды в моче; уменьшается стеркоби­линоген в кале?

1. При печеночной.

2. При подпеченочной.

3. При надпеченочной.

4. При всех.

16. Что характерно для подпеченочной желтухи?

1. Общий билирубин в крови повышен.

2. Связанный билирубин повышен.

3. Билирубин в моче – реакция отрицательная.

4. Уробилин в моче – реакция отрицательная.

5. Стеркобилин в кале – реакция отрицательная.

17. Какой из перечисленных показателей не соответствует изменениям пиг­ментного обмена при гемолитической желтухе?

1. Общий билирубин в крови повышен.

2. Свободный билирубин повышен.

3. Билирубин в моче – реакция резко положительная.

4. Уробилин в моче – реакция положительная.

5. Стеркобилиноген в кале – реакция резко положительная.

18. Какие из перечисленных показателей следует считать соответствующими норме?

1. Общий билирубин в крови – 38 мкмоль/л.

2. Связанный билирубин – 20 мкмоль/л.

3. Свободный билирубин – 12 мкмоль/л.

4. Билирубин в моче – реакция отрицательная.

5. Билирубин в моче – реакция положительная.

19. Какие из перечисленных показателей следует считать соответствующими норме?

1. Общий билирубин в крови – 18 мкмоль/л.

2. Связанный билирубин – 8 мкмоль/л.

3. Свободный билирубин – 16 мкмоль/л.

4. Билирубин в моче – реакция положительная.

20. Что характерно для «ложной» желтухи?

1. Повышен общий билирубин в крови.

2. Желтушность кожи и склер глаз.

3. Желтушность только кожи.

4. Общий билирубин в крови в норме.

5. Желтушность только склер глаз.

21. Содержится ли при механической (подпеченочной) желтухе в моче билиру­бин?

1. Не содержится.

2. Содержится только прямой (связанный) билирубин.

3. Содержится только непрямой (свободный) билирубин.

4. Содержатся обе фракции билирубина.

22. Для какой желтухи характерны эти результаты исследования?

В крови: общий билирубин 109,5 мкмоль/л; прямой билирубин 92,4 мкмоль/л; непрямой билирубин 17,1 мкмоль/л. В моче: реакция на билирубины положительная, уробилина нет. Кал: стеркобилин отсутствует.

1. Для гемолитической (надпеченочная).

2. Для паренхиматозной (печеночная).

3. Для механической (подпеченочная).

4. Для всех видов желтух.

5. Для «ложной» желтухи.

23. При паренхиматозной (печеночной) желтухе наблюдаются следующие из­менения: … .

1. Повышается в крови связанный (прямой) билирубин

2. Повышается в крови свободный (непрямой) билирубин

3. Не определяются в моче уробилиноиды

4. Кал становится ахоличным

5. Определяются в моче уробилиноиды

24. При надпеченочной (гемолитической) желтухе наблюдаются следующие изменения: … .

1. Повышается в крови связанный (прямой) билирубин

2. Повышается в крови свободный (непрямой) билирубин

3. Повышается в моче содержание уробилиноидов

4. Не определяются в моче уробилиноиды

5. Кал становится ахоличным

25. У пациента после приступа печеночной колики произошла полная заку­порка общего желчного протока. Какие изменения характерны для этого состояния?

1. В крови повышен прямой (связанный) билирубин.

2. В крови повышен непрямой (свободный) билирубин.

3. В мочи повышено содержание уробилиновых тел.

4. В моче уробилиновых тел нет.

5. Изменений показателей в крови и моче нет.

26. Из чего образуется стеркобилиноген?

1. Из билирубина.

2. Из уробилина.

3. Из стеркобилина.

4. Непосредственно из эритроцитов.

27. Какие показатели билирубина выходят за пределы нормы?

1. Связанный билирубин (прямой) 10,3 мкмоль/л.

2. Свободный (непрямой) билирубин 6,8 мкмоль/л.

3. Общий билирубин 15,52 мкмоль/л.

4. Общий билирубин 25,52 мкмоль/л.

28. Какая фракция билирубина при ее повышении в крови выделяется с мочой?

1. Связанный билирубин (прямой).

2. Свободный билирубин (непрямой).

3. Общий билирубин.

4. Все фракции.

29. Как изменяется пигментный обмен при синдроме холестаза?

1. Общий билирубин в крови повышается.

2. Свободный билирубин в крови повышается.

3. Связанный билирубин в крови повышается.

4. Уробилиноиды в моче – реакция отрицательная.

5. Уробилиноиды в моче – реакция положительная.

Метаболизм желчных пигментов и его нарушения

Билирубин — это продукт распада гемовой составляющей гемопротеинов, включая гемоглобин, миоглобин и некоторые печеночные гемопротеины. Около 80% билирубина в дозе 200–300 мг ежедневно вырабатывается ретикулоэндотелиальными клетками из гемоглобина стареющих эритроцитов, а оставшаяся часть образуется в основном из гемопротеинов печени. Микросомальные гемоксигеназы расщепляют гем с образованием биливердина, который восстанавливается до билирубина биливердинредуктазой.В низких концентрациях билирубин оказывает цитопротекторное действие и улучшает метаболизм. Однако билирубин-индуцированное неврологическое повреждение (BIND), вызванное тяжелой неконъюгированной гипербилирубинемией, является серьезной клинической проблемой. Физиологически BIND предотвращается за счет связывания с альбумином плазмы, быстрого поглощения гепатоцитами, опосредованной UGT1A1 глюкуронизации и активной канальцевой экскреции. Часть глюкуронидов билирубина откачивается ABCC3 через синусоидальную поверхность гепатоцитов и подвергается обратному захвату гепатоцитами, расположенными ниже синусоидального кровотока.Небольшая часть билирубина, выделяемого с желчью, подвергается энтерогепатической рециркуляции, а оставшаяся часть расщепляется бактериями до уробилиногена. Неконъюгированная гипербилирубинемия может быть вызвана чрезмерным производством билирубина, сниженным гепатоцеллюлярным захватом или дефектной глюкуронидацией, тогда как конъюгированная гипербилирубинемия возникает в результате дефектной канальцевой экскреции или аномального обратного захвата. Гипербилирубинемия, которая является универсальной для новорожденных, обычно проходит через 1-2 недели, но может усугубляться или продлеваться при грудном вскармливании или задержке созревания UGT1A1 (синдром Люси-Дрисколла). Помимо приобретенных гепатобилиарных заболеваний и гемолиза, ряд наследственных заболеваний печени могут вызывать пожизненную гипербилирубинемию. Мутации кодирующей области UGT1A1 могут вызывать полную или частичную потерю глюкуронизации билирубина (синдром Криглера – Наджара, тип 1 и тип 2, соответственно). Вариант промотора UGT1A1 может снижать экспрессию UGT1A1, вызывая легкую и безвредную неконъюгированную гипербилирубинемию (синдром Гилберта). Конъюгированная гипербилирубинемия может быть результатом мутаций ABCC2 , которые снижают канальцевую секрецию глюкуронидов билирубина и многих других органических анионов, вызывающих синдром Дубина-Джонсона.Одновременные мутации ABCB1 и ABCB3 отключают обратный захват глюкуронидов билирубина, вызывая легкую конъюгированную гипербилирубинемию (синдром Ротора). Несколько других наследственных дефектов желчных канальцевых белков вызывают четыре типа прогрессирующего семейного внутрипеченочного холестаза, который вызывает смешанную гипербилирубинемию, а также повреждение печени.

Метаболизм желчных пигментов и его нарушения — Медицинский колледж Альберта Эйнштейна

TY — CHAP

T1 — Метаболизм желчных пигментов и его нарушения

AU — Roy-Chowdhury, Namita

AU — Wang, Xia

AU — Roy -Chowdhury, Jayanta

PY — 2019/1/1

Y1 — 2019/1/1

N2 — Билирубин является продуктом распада гемовой составляющей гемопротеинов, включая гемоглобин, миоглобин и некоторые печеночные гемопротеины.Около 80% билирубина в дозе 200–300 мг ежедневно вырабатывается ретикулоэндотелиальными клетками из гемоглобина стареющих эритроцитов, а оставшаяся часть образуется в основном из гемопротеинов печени. Микросомальные гемоксигеназы расщепляют гем с образованием биливердина, который восстанавливается до билирубина биливердинредуктазой. В низких концентрациях билирубин оказывает цитопротекторное действие и улучшает метаболизм. Однако билирубин-индуцированное неврологическое повреждение (BIND), вызванное тяжелой неконъюгированной гипербилирубинемией, является серьезной клинической проблемой. Физиологически BIND предотвращается за счет связывания с альбумином плазмы, быстрого поглощения гепатоцитами, опосредованной UGT1A1 глюкуронизации и активной канальцевой экскреции. Часть глюкуронидов билирубина откачивается ABCC3 через синусоидальную поверхность гепатоцитов и подвергается обратному захвату гепатоцитами, расположенными ниже синусоидального кровотока. Небольшая часть билирубина, выделяемого с желчью, подвергается энтерогепатической рециркуляции, а оставшаяся часть расщепляется бактериями до уробилиногена. Неконъюгированная гипербилирубинемия может быть вызвана чрезмерным производством билирубина, сниженным гепатоцеллюлярным захватом или дефектной глюкуронидацией, тогда как конъюгированная гипербилирубинемия возникает в результате дефектной канальцевой экскреции или аномального обратного захвата.Гипербилирубинемия, которая является универсальной для новорожденных, обычно проходит через 1-2 недели, но может усугубляться или продлеваться при грудном вскармливании или задержке созревания UGT1A1 (синдром Люси-Дрисколла). Помимо приобретенных гепатобилиарных заболеваний и гемолиза, ряд наследственных заболеваний печени могут вызывать пожизненную гипербилирубинемию. Мутации кодирующей области UGT1A1 могут вызывать полную или частичную потерю глюкуронизации билирубина (синдром Криглера-Наджара, тип 1 и тип 2, соответственно). Вариант промотора UGT1A1 может снижать экспрессию UGT1A1, вызывая легкую и безвредную неконъюгированную гипербилирубинемию (синдром Гилберта).Конъюгированная гипербилирубинемия может быть результатом мутаций ABCC2, которые снижают канальцевую секрецию глюкуронидов билирубина и многих других органических анионов, вызывающих синдром Дубина-Джонсона. Одновременные мутации ABCB1 и ABCB3 отключают обратный захват глюкуронидов билирубина, вызывая легкую конъюгированную гипербилирубинемию (синдром Ротора). Несколько других наследственных дефектов желчных канальцевых белков вызывают четыре типа прогрессирующего семейного внутрипеченочного холестаза, который вызывает смешанную гипербилирубинемию, а также повреждение печени.

AB — Билирубин является продуктом распада гемовой части гемопротеинов, включая гемоглобин, миоглобин и несколько гемопротеинов печени. Около 80% билирубина в дозе 200–300 мг ежедневно вырабатывается ретикулоэндотелиальными клетками из гемоглобина стареющих эритроцитов, а оставшаяся часть образуется в основном из гемопротеинов печени. Микросомальные гемоксигеназы расщепляют гем с образованием биливердина, который восстанавливается до билирубина биливердинредуктазой. В низких концентрациях билирубин оказывает цитопротекторное действие и улучшает метаболизм.Однако билирубин-индуцированное неврологическое повреждение (BIND), вызванное тяжелой неконъюгированной гипербилирубинемией, является серьезной клинической проблемой. Физиологически BIND предотвращается за счет связывания с альбумином плазмы, быстрого поглощения гепатоцитами, опосредованной UGT1A1 глюкуронизации и активной канальцевой экскреции. Часть глюкуронидов билирубина откачивается ABCC3 через синусоидальную поверхность гепатоцитов и подвергается обратному захвату гепатоцитами, расположенными ниже синусоидального кровотока. Небольшая часть билирубина, выделяемого с желчью, подвергается энтерогепатической рециркуляции, а оставшаяся часть расщепляется бактериями до уробилиногена.Неконъюгированная гипербилирубинемия может быть вызвана чрезмерным производством билирубина, сниженным гепатоцеллюлярным захватом или дефектной глюкуронидацией, тогда как конъюгированная гипербилирубинемия возникает в результате дефектной канальцевой экскреции или аномального обратного захвата. Гипербилирубинемия, которая является универсальной для новорожденных, обычно проходит через 1-2 недели, но может усугубляться или продлеваться при грудном вскармливании или задержке созревания UGT1A1 (синдром Люси-Дрисколла). Помимо приобретенных гепатобилиарных заболеваний и гемолиза, ряд наследственных заболеваний печени могут вызывать пожизненную гипербилирубинемию.Мутации кодирующей области UGT1A1 могут вызывать полную или частичную потерю глюкуронизации билирубина (синдром Криглера-Наджара, тип 1 и тип 2, соответственно). Вариант промотора UGT1A1 может снижать экспрессию UGT1A1, вызывая легкую и безвредную неконъюгированную гипербилирубинемию (синдром Гилберта). Конъюгированная гипербилирубинемия может быть результатом мутаций ABCC2, которые снижают канальцевую секрецию глюкуронидов билирубина и многих других органических анионов, вызывающих синдром Дубина-Джонсона. Одновременные мутации ABCB1 и ABCB3 отключают обратный захват глюкуронидов билирубина, вызывая легкую конъюгированную гипербилирубинемию (синдром Ротора).Несколько других наследственных дефектов желчных канальцевых белков вызывают четыре типа прогрессирующего семейного внутрипеченочного холестаза, который вызывает смешанную гипербилирубинемию, а также повреждение печени.

кВт — билирубин

кВт — биливердин

кВт — биливердин редуктаза

кВт — гем оксигеназа

UR — http://www.scopus.com/inward/record.url?scp=85081344=406 — http://www.scopus.com/inward/citedby.url?scp=85081344406&partnerID=8YFLogxK

U2 — 10.1016 / B978-0-12-812532-8.00019-7

DO — 10.1016 / B978-0-12-812532-8.00019-7

M3 — Раздел

AN — SCOPUS: 85081344406

SN — 9780128126806

SP — 507

EP — 553

BT — Принципы и практика медицинской генетики и геномики Эмери и Римоина

PB — Elsevier

ER —

Анализ пигмента желчного билирубина при нарушениях метаболизма билирубина в раннем младенчестве.

важная проблема в неонатальном периоде.Общие причины включают физиологическую желтуху, желтуху грудного молока, перепроизводство (то есть полицитемию), системные заболевания (врожденный гипотиреоз, сепсис) и наследственные нарушения метаболизма билирубина1. К последним относятся синдром Криглера – Наджара (ЦНС) 1 и 2 типов — вызвано дефицитом печеночной уридиндифосфатглюкуронозилтрансферазы (UGT) и характеризуется высокими уровнями неконъюгированного билирубина в сыворотке крови, которые появляются в первые несколько дней после рождения3, и синдромом Гилберта.

Точная диагностика синдрома Криглера – Наджара важна из-за последствий для прогноза и лечения.Лечение ЦНС 1 типа состоит из агрессивного использования мер по удалению билирубина (фототерапия или обменное переливание крови), в то время как трансплантация печени является окончательным лечением. 5 Основным отличительным признаком между двумя типами синдрома Криглера-Наджара является реакция на препараты, индуцирующие активность ферментов цитохрома P450. 6-8 Фенобарбитон (фенобарбитал) вызывает значительное снижение уровня билирубина в сыворотке у пациентов с заболеванием 2 типа, с повышение печеночного клиренса радиоактивно меченного билирубина и повышение уровня билирубина диглюкуронидов в желчных путях.6 8 9 Однако дифференциация синдрома Криглера – Наджара типа 1 от типа 2 исключительно на основании реакции на фенобарбитон иногда может вводить в заблуждение. 10 Рекомендуется проводить дифференциацию с использованием пигментного анализа желчного билирубина. 12 При ЦНС 1 типа дуоденальная желчь практически не содержит конъюгатов билирубина. В ЦНС 2 типа присутствуют моноглюкурониды билирубина, и некоторые диглюкурониды могут быть обнаружены во время лечения фенобарбитоном. 12 При синдроме Жильбера преобладающим пигментом являются диглюкурониды билирубина.11

Важно выбрать время для дуоденального аспирата. Последующее лечение и прогноз зависят от точного диагноза, и врачи часто вынуждены поставить ранний диагноз. Мы рассмотрели возможные результаты у детей, которым в раннем младенчестве был проведен анализ пигмента желчного билирубина, чтобы определить, дает ли ранний анализ пигмента полезную диагностическую информацию.

Методы

Мы ретроспективно рассмотрели тех младенцев с тяжелой неонатальной неконъюгированной гипербилирубинемией, которые были направлены в отделение печени Детской больницы Бирмингема в период с 1992 по 1999 год.Общие причины длительной неконъюгированной гипербилирубинемии были исключены лечащими врачами. Основные демографические данные, семейный анамнез, начало желтухи, пиковый уровень билирубина в сыворотке и клинический ответ на лечение фенобарбитоном были получены из историй болезни. При наличии клинических показаний выполнялись УЗИ брюшной полости и биопсия печени. Окончательный диагноз был поставлен на основании комбинации результатов анализа пигмента на билирубин желчи, генетических исследований, клинического течения и реакции на фенобарбитон.

СБОР ЖЕЛЧНЫХ И БИОХИМИЧЕСКИХ АНАЛИЗОВ

Фототерапия была приостановлена ​​как минимум за 24 часа до сбора желчного пигмента. Желчь собирали во время эндоскопии верхних отделов желудочно-кишечного тракта. Секреции желчи в двенадцатиперстную кишку способствовали внутривенные инъекции холецистокинина в количестве 1-2 единиц / кг, из двенадцатиперстной кишки извлекали 2-5 мл желчи. Полученные аспираты желчи немедленно защищали от света, замораживали жидким азотом и хранили при -80 ° C.Пигментный состав билирубина желчи был определен с помощью анализа с помощью высокоэффективной жидкостной хроматографии (ВЭЖХ) нативных тетрапрололов неконъюгированного билирубина и глюкуронидов билирубина в отделении молекулярной и клеточной патологии больницы Найнуэллс, Данди, Шотландия, и Отделении биологических наук, Университет Хаддерсфилда, Англия, как описано ранее.13

Референсные диапазоны пигментов желчного билирубина для нормальных субъектов были: неконъюгированный 0–2%, моноглюкурониды 7–16%, диглюкурониды 79–91%.Анализ показал, что воздействие на образцы желчи источника света, используемого во время процедуры эндоскопии, не оказало значительного влияния на измеренный состав билирубиновых пигментов (Clarke DJ, Burchell B, неопубликованные данные). Первоначальный диагноз синдрома Криглера – Наджара типа 1 или 2 или синдрома Гилберта был установлен в соответствии с пигментным составом желчного билирубина.

ГЕНЕТИЧЕСКИЕ ИССЛЕДОВАНИЯ

Генетические исследования синдрома Криглера – Наджара и синдрома Гилберта были выполнены, как описано ранее.3 14 Была взята вся кровь и извлечена ДНК. Гомозиготность по (TA) 7TAA (TA7 / TA7) была связана с синдромом Гилберта.14 Синдром Криглера – Наджара типа 1 и 2 диагностировался при наличии гомозиготности или двойной гетерозиготности по известным мутациям.

Результаты

В период с 1992 по 1999 год девять младенцев в возрасте до 3 месяцев с тяжелой неконъюгированной гипербилирубинемией были направлены в гепатологическое отделение Детской больницы Бирмингема для уточнения диагноза.Было пять мальчиков и четыре девочки. Восемь были доставлены в срок, а дело № 6 — на 36 неделе. Шесть были белыми (европидами) и трое родились от единокровных азиатских родителей с Индийского субконтинента. В семейном анамнезе тяжелой желтухи новорожденных не было.

У всех младенцев появилась тяжелая желтуха в течение первой недели жизни (в среднем 3 дня). Пик сывороточного билирубина находился в диапазоне от 300 до 650 мкмоль / л (в среднем 396 мкмоль / л). Всем потребовалась фототерапия, в случае № 8 — двухобменные переливания.Четыре случая (случаи 2, 6, 7 и 9) были начаты с фенобарбитона в дозе 5 мг / кг массы тела их лечащими врачами. Пять пациентов находились на грудном вскармливании (случаи 3, 4, 5, 7 и 8). Пациент 5 имел дефект атриовентрикулярной перегородки. В трех случаях (случаи 1, 2 и 3) в рамках диагностического обследования была проведена биопсия печени. Гистологически все были нормальными.

АНАЛИЗ ЖЕЛЧНОГО БИЛИРУБИНА ПИГМЕНТА

Анализ пигмента билирубина желчи проводился в возрасте от 10 до 58 дней (в среднем 25 дней) (таблица 1).По результатам анализов (первый анализ в случае 3) было два ребенка с типом ЦНС 1, шесть с типом ЦНС 2 и один с синдромом Жильбера. В случае № 3 было проведено два анализа. Второй анализ был проведен через семь месяцев после первого, когда пациент лечился фенобарбитоном и когда уровень билирубина в сыворотке упал до 80 мкмоль / л. Было заметное снижение неконъюгированного билирубина со значительным увеличением моноглюкуронидов.

Таблица 1

Демографические данные, пиковый уровень билирубина в сыворотке и результаты анализа пигмента билирубина желчи у девяти детей с длительной и тяжелой неконъюгированной гипербилирубинемией

Для сравнения, результаты анализа пигмента желчного билирубина у четырех пациентов старше 3 месяцев, которые были направлены в отделение печени для исследования основной причины желтухи, также показаны в таблице 1.Случаи 10 и 11 были исследованы на предмет перемежающейся желтухи с клиническим диагнозом синдрома Жильбера. Пациенту 12 был поставлен клинический диагноз 2 типа ЦНС со стойкой желтухой. Билирубин в сыворотке был 150 мкмоль / л, в основном неконъюгированный при приеме фенобарбитона. У пациента 13 впервые была обнаружена желтуха в возрасте 16 лет после эпизода острого гастроэнтерита. Билирубин сыворотки был 63 мкмоль / л, с неконъюгированным билирубином 52 мкмоль / л.

ГЕНЕТИЧЕСКИЕ ИССЛЕДОВАНИЯ

Генетические исследования были выполнены в четырех случаях (случаи 1, 2, 8 и 9).Два случая (случай 8 и 9) были гомозиготными UGT1A1 и TA6 / TA6, что не связано с гипербилирубинемией. В случае 1 показана гетерозиготная мутация G-to-C в экзоне 2 в положении нуклеотида 923 гена UGT1A1 , что приводит к замене глицина на аланин в кодоне 308. Вторая гетерозиготная мутация была обнаружена там, где была делеция остатка Т. на нуклеозид 1221 (1221delT) в экзоне 4. Случай 1 унаследовал два дефектных аллеля UGT1A1 от каждого из родителей, что привело к полной потере активности UGT билирубина и типа ЦНС 1.Случай 2 показал гетерозиготную мутацию C-to-T в положении нуклеотида 625 гена UGT1A1 и гетерозиготную мутацию IVS4-1G-to-A. Кроме того, она также является гетерозиготной по UGT1A1 и аллелям промотора TA6 / TA7. Ни TA6 / TA6, ни TA6 / TA7 не связаны с гипербилирубинемией.

КЛИНИЧЕСКИЙ КУРС И СОБЫТИЯ ДИАГНОСТИКИ

Эти данные показаны в таблице 2. Диагностика шести случаев требует пересмотра. Случай 3 с неконъюгированным билирубином и отсутствием моно- или диглюкуронидов в желчи был первоначально диагностирован как тип ЦНС 1.Был назначен фенобарбитон, продолжена фототерапия. Билирубин в сыворотке снизился до 40–60 мкмоль / л, а продолжительность фототерапии постепенно сократилась. Второй анализ желчного билирубина на пигмент, проведенный в возрасте 8 месяцев, показал преобладание моноглюкуронидов. Диагноз был изменен на ЦНС типа 2. В настоящее время в возрасте 5 лет уровень билирубина в сыворотке поддерживается в диапазоне 50–90 мкмоль / л при приеме фенобарбитона.

Таблица 2

Первоначальный диагноз, ответ на фенобарбитон, генетические исследования и окончательный диагноз

В пяти случаях (случаи 5, 6, 7, 8 и 9), которым был поставлен первоначальный диагноз ЦНС 2 типа, после лечения фенобарбитоном отмечалось разрешение желтухи и снижение уровня билирубина в сыворотке крови. У всех был нормальный билирубин сыворотки после прекращения приема фенобарбитона. Кроме того, как в случае 8, так и в случае 9 были отрицательные генетические исследования на мутацию синдрома Криглера – Наджара и синдром Гилберта (TA6 / TA6). Пациенту 6, который принадлежал путешествующей семье, давали фенобарбитон в течение одной недели. Билирубин в сыворотке продолжал снижаться после прекращения приема фенобарбитона. Окончательным диагнозом была физиологическая желтуха или синдром Жильбера. Напротив, во всех четырех случаях, когда анализ пигмента желчного билирубина был проведен после 3-месячного возраста, диагноз, который был поставлен на основании результатов анализа пигмента желчного билирубина, совпадал с клиническим диагнозом.

Обсуждение

Диагноз синдрома Криглера – Наджара типов 1 и 2 и синдрома Гилберта обычно может быть поставлен на основе комбинации ответа на фенобарбитон, анализа пигмента желчного билирубина и генетических исследований.15 Измерение активности UGT в биопсийной ткани печени для дифференциации ЦНС Тип 1 из ЦНС Тип 2 сложен и обычно недоступен. 16 Лечение фенобарбитоном снижает уровень билирубина в сыворотке крови на 26% или более в ЦНС типа 2, в то время как при типе 1 снижения не происходит.11 Однако есть некоторые исключения из этого наблюдения, 16 и, кроме того, снижение уровня билирубина в сыворотке может не проявиться в течение нескольких месяцев после начала лечения.

Sinaasappel et al. выполнили анализ пигмента билирубина желчи у девяти пациентов с синдромом Криглера – Наджара (четыре типа 1 и пять типов 2) в возрасте от 1 до 18 лет и пришли к выводу, что эти два типа можно дифференцировать на основе желчи. билирубиновый пигментный анализ.11 Однако такая задержка в подтверждении диагноза неприемлема в клинической практике, поскольку врачи обычно сталкиваются с огромным давлением со стороны родителей, чтобы подтвердить или исключить возможность ЦНС типа 1, особенно с учетом возможной необходимости трансплантации печени. .Следовательно, было бы разумно выполнять анализ пигмента желчного билирубина в гораздо более молодом возрасте, особенно в раннем младенчестве, когда у большинства пациентов все еще сохраняется значительная желтуха.

Однако, прежде чем рекомендовать рутинный анализ пигментов желчного билирубина в раннем младенчестве, необходимо рассмотреть влияние созревания UGT. Ciotti и др. наблюдали отсроченный ответ на фенобарбитон у ребенка с типом ЦНС 2, которому первоначально был поставлен диагноз 1 типа из-за отсутствия ответа на фенобарбитон в течение первых 7 месяцев жизни.10 Они приписали такую ​​задержку простому феномену развития, вызывающему медленное развитие вторичных структурных изменений, необходимых для активности UGT. Такой феномен развития может объяснить наблюдения, сделанные в этом исследовании, что анализ пигмента билирубина желчи, выполненный в раннем возрасте, показал низкие уровни неконъюгированного билирубина и моноглюкуронидов в желчи из-за относительно низкой активности фермента UGT. По мере созревания и введения фенобарбитона процесс глюкуронизации усиливался, а уровень билирубина в сыворотке крови падал.Rubaltelli и др. наблюдали, что при лечении фенобарбитоном наблюдалось абсолютное увеличение концентрации моноглюкуронида, но не концентрации диглюкуронида в желчи. 12 Мы наблюдали, что в случае 3 после лечения фенобарбитоном наблюдалось значительное увеличение как моноглюкуронида, так и его концентрации. и диглюкурониды с желчью.

Мы показали, что хотя аспират желчи для анализа пигмента билирубина может быть выполнен относительно легко и безопасно в течение первых 3 месяцев жизни, анализ пигмента желчного билирубина в таком молодом возрасте часто показывает высокие уровни неконъюгированного или моноконъюгированного билирубина в желчи. .Как указано выше, это отражает незрелость гепатоцитов в очень молодом возрасте, что приводит к относительному дефициту UGT. Ранее было показано, что активность UGT низка в неонатальном периоде и постепенно увеличивается до взрослых значений после 3 месяцев жизни.17 Эта незрелость привела к переоценке тяжести заболевания и гипердиагностике синдрома Криглера-Наджара, как в наших случаях тип 1 и тип 2. Последующий пересмотр первоначальных диагнозов потребовался в шести из девяти случаев.В пяти случаях нормализация сывороточного билирубина после отмены фенобарбитона сделала диагноз ЦНС 2 типа маловероятным. В случае 3, у которого было два анализа пигментов желчного билирубина, второй анализ показал заметное увеличение моноглюкуронидов билирубина и снижение уровня неконъюгированного билирубина по сравнению с первым анализом, который состоял преимущественно из неконъюгированного билирубина.

В случае 2, у которого первоначальный диагноз ЦНС 2 типа совпал с окончательным диагнозом, анализ пигмента желчного билирубина был проведен, когда пациент принимал фенобарбитон.В случае 3 — у которого был второй анализ желчного билирубина, который показал преимущественно моноглюкуронид, что согласуется с клинической картиной ЦНС типа 2 — анализ пигмента желчного билирубина был проведен после начала приема фенобарбитона. Поэтому было бы разумно рекомендовать выполнять анализ пигмента на билирубин желчи, когда пациент принимает фенобарбитон.

In убедительно показано, что мутации в гене UGT1 — локусе гена, кодирующем фермент UGT у пациентов с типом ЦНС 1, — ответственны за отмену активности UGT в печени in vitro в клетках COS. 18 В настоящее время доступен анализ мутаций как для синдрома Криглера – Наджара, так и для синдрома Гилберта.19 Это полезно для подтверждения клинического диагноза и для генетического консультирования, но является сложным и обычно недоступным.15 Единственным случаем ЦНС типа 1 в этой серии был Показано, что это двойная гетерозигота для мутаций, ответственных за тип ЦНС 1. Кроме того, два пациента с первоначальным диагнозом ЦНС типа 2, но у которых впоследствии были нормальные уровни билирубина в сыворотке без фенобарбитона, оказались гомозиготными по TA6 / TA6, которые не связан с синдромом Гилберта.

В результате этого исследования мы впоследствии пересмотрели политику исследования детей с длительной неконъюгированной гипербилирубинемией. Протокол был пересмотрен, чтобы избежать слишком раннего проведения анализа пигмента желчного билирубина и, следовательно, гипердиагностики синдрома Криглера – Наджара типов 1 и 2. После исключения других более частых причин неконъюгированной гипербилирубинемии было проведено терапевтическое испытание фенобарбитона в дозе 5 мг / кг тела. При необходимости следует начинать прием веса, продолжая фототерапию (рис. 1).Затем таких пациентов следует повторно обследовать; Если к 3-месячному возрасту наблюдается стойкое повышение уровня неконъюгированного билирубина в сыворотке крови, следует продолжить интенсивное лечение фототерапией и фенобарбитоном. Анализ пигмента на билирубин желчи следует отложить до достижения 3-месячного возраста. Хотя генетические исследования могут быть полезными, в настоящее время они сложны в выполнении и обычно недоступны, но их можно провести, если есть особые опасения.

фигура 1

Предложено схематическое исследование длительной неконъюгированной гипербилирубинемии.SB, билирубин сыворотки.

Нарративная медицина, Междисциплинарная конференция «Исследования, нарратив и практика» Двухдневная конференция — понедельник 3-го и вторник 4-го сентября 2001 г. Гомертон-колледж, Кембридж, Великобритания

Издательская группа BMJ

Для получения подробной информации обращайтесь: BMA / BMJ Conference Unit, Tavistock Square, London, WC1H 9JP Tel: +44 (0) 20 7383 6819; факс: +44 (0) 20 7383 6663; электронная почта: clyders {at} bma. org.uk. www.quality.bmjpg.com

границ | At5g19540 кодирует новый белок, который влияет на метаболизм пигментов и развитие хлоропластов у Arabidopsis thaliana

Введение

Развитие хлоропластов — ключевое событие для роста и адаптации растений.Он включает в себя различные процессы, включая экспрессию ядерных и пластидных генов, биосинтез и накопление хлорофиллов и каротиноидов, а также сборку мембранных систем, которые высоко скоординированы в пространственно-временном контексте (Mullet, 1988; Pfalz and Pfannschmidt, 2013; Andriankaja и др., 2014). Сообщалось о различных механизмах регуляции развития хлоропластов посредством биосинтеза пигментов. Например, члены семейства PHYTOCHROME-INTERACTING FACTOR (PIF) взаимодействуют с DELLA для регулирования экспрессии светозависимых генов, особенно генов метаболизма хлорофилла и каротиноидов (Cheminant et al., 2011). Экспрессия гена фитоенсинтазы (PSY), ключевого фермента биосинтеза каротиноидов, также напрямую подавляется PIF (Toledo-Ortiz et al. , 2010). Кроме того, сообщалось, что гены, участвующие в сборке тилакоидных мембран и в пластид-кодируемой РНК-полимеразе (PEP) -зависимой транскрипции, такие как DnaJ-подобный белок домена цинкового пальца PSA2 и белок теплового шока HSP21, также модулируют развитие хлоропластов и чтобы повлиять на адаптацию к сильному световому стрессу (Zhong et al., 2013; Fristedt et al., 2014; Wang et al., 2016).

Было продемонстрировано, что пигментные мутанты с альбиносными, желтыми или пестрыми семядолями или настоящими листьями являются хорошей системой для открытия новых регулирующих компонентов. Например, было обнаружено, что хорошо изученные мутанты immutans ( im ) и пестрых ( var ) кодируют терминальную оксидазу пластид и FtsH, соответственно (Aluru et al., 2001; Sakamoto, 2003; Yu. и др., 2007). Исследования мутантов снежных семядолей также выявили участие фактора удлинения хлоропластов G (SCO1), белка домена цинковых пальцев (SCO2), микротрубочек и пероксисомо-ассоциированного белка (SCO3) и протеиназы (SCO4) в развитии хлоропластов (Albrecht et al. ., 2006, 2008, 2010; Альбрехт-Борт и др., 2013). Эти исследования показали, что различные механизмы на метаболическом, транскрипционном и трансляционном уровнях участвуют в регуляции метаболизма пигментов, развития хлоропластов или того и другого.

В этой работе путем скрининга пула мутантов Arabidopsis thaliana со вставкой Т-ДНК на проростки с аномальным накоплением пигмента мы идентифицировали новый ген, Dwarf and Yellow 1 ( DY1 / At5g19540 ), который регулирует оба метаболизм пигментов и сборка тилакоидной мембраны.

Материалы и методы

Растительные материалы и условия роста

Пул мутантных инсерций Т-ДНК Arabidopsis thaliana (CS76508) был приобретен в Центре биологических ресурсов арабидопсиса (ABRC, Университет штата Огайо, Колумбус, Огайо, США). Все растений A. thaliana , использованные в этом исследовании, имели фон Col-0 дикого типа (WT). Через 3 дня стратификации при 4 ° C в темноте семена проращивали на чашках Murashige-Skoog (MS), содержащих 2% сахарозу, при 22 ° C и интенсивности света 120 мкмоль фотонов m ^-2 с ^-1 с фотопериод свет / темнота 16 ч / 8 ч. Двухнедельные сеянцы перемещали для выращивания в почву (смесь торфяного мха, вермикулита и перлита в соотношении 1: 1: 1) в тех же условиях (Wang et al., 2016).

Мутанты подвергали скринингу на планшетах MS, содержащих 25 мг / л канамицина. Сеянцы с альбиносными, желтоватыми или бледно-зелеными семядолями перемещали для выращивания в почву, а их семена собирали индивидуально.

Молекулярные манипуляции и трансформация растений

Геномную ДНК экстрагировали из розеточных листьев методом CTAB (Green, Sambrook, 2012).Для определения положения вставки Т-ДНК каждого мутанта «обход генома» выполняли с использованием набора Genome Walking Kit (TaKaRa, Shiga, Japan) в соответствии с руководством производителя. Гомозиготное потомство мутантов подвергали скринингу с помощью инструмента SIGnAL iSect. Все праймеры, использованные в этом исследовании, перечислены в дополнительной таблице S1.

РНК

выделяли с использованием реагента RNAiso Plus (TaKaRa) в соответствии с инструкциями производителя. Общую РНК (1 мкг) подвергали обратной транскрипции с использованием набора для синтеза первой цепи кДНК PrimeScript (TaKaRa).Обилие транскриптов каждого изученного гена определяли с помощью количественной ПЦР в реальном времени (qPCR) в системе термоциклера Dice Real Time System TP800 (TaKaRa) с использованием SYBR Premix ExTaq II (TaKaRa), следуя инструкциям производителя, и рассчитывали с использованием сравнительного C _T метод (Schmittgen, Livak, 2008). ACT 2 ( At3g18780 ) использовался в качестве ссылки. Для каждого образца анализировали не менее трех биологических повторов, каждая с тремя повторами.

Для генетической комплементации с использованием праймеров DY1- амплифицировали фрагмент геномной ДНК размером 4332 п.н. DY1 ( At5g19540 ) в диапазоне от -2044 п.н. перед кодоном инициации трансляции (ATG) до 290 п.н. GF и DY1-GR, и клонировали в сайт Bam HI pCAMBIA1300 (CAMBIA, Canberra, ACT, Australia) для создания конструкции DY1: DY1 . Для исследования субклеточной локализации полноразмерную открытую рамку считывания (ORF) DY1 или At4g20360 амплифицировали из пула кДНК 1-й цепи с использованием праймеров DY1-HF и DY1-ER для DY1 или RABE1b-HF и RABE1b. -ER для At4g20360 , а затем клонировали в сайт Bam HI pA7-eYFP для создания конструкции 35S: DY1-eYFP или 35S: At4g20360-eYFP . Чтобы создать конструкцию для экспрессии DY1 с двойными флуоресцентными белками, кодирующие последовательности для транзитного пептида хлоропластов (cTP) DY1 (cTP ^{DY 1} ) (с использованием пары праймеров DY1-cTP-HF и DY1-cTP-ER), eYFP (eYFP-HF и eYFP-ER), DY1 без cTP (DY1 ^ΔcTP ) (DY1-ΔcTP-HF и DY1-ΔcTP-ER) и mCherry (mCherry-HF и mCherry-ER) были отдельно амплифицированы и объединены в сайты Bam HI и Sac I pA7-eYFP с использованием техники In-Fusion (TaKaRa).Полный фрагмент, кодирующий слитый белок cTP ^{DY 1} -eYFP-DY1 ^ΔcTP -mCherry, был дополнительно амплифицирован (DY1-mature-HF и DY1-mature-ER), а затем субклонирован в сайт Nco I pCAMBIA1300- RTL2 с использованием техники In-Fusion для временной экспрессии в листьях табака и генетической трансформации Arabidopsis. A. thaliana трансформировали методом окунания в цветы (Clough and Bent, 1998).

Для временной трансформации протопласты выделяли из листьев розетки согласно Yoo et al.(2007). Для каждой трансформации наносили около 20 мкг очищенной плазмидной ДНК. Протопласты инкубировали в темноте при 22 ° C в течение ночи перед наблюдением под микроскопом.

Для всех ПЦР-амплификаций использовалась высокоточная ДНК-полимераза PrimeSTAR (TaKaRa) в соответствии с инструкциями производителя.

Анализ последовательности

Субклеточная локализация DY1 была предсказана с помощью онлайн-программ ChloroP и TargetP (Emanuelsson et al., 1999; Emanuelsson et al., 2007).Выведенная аминокислотная последовательность DY1 использовалась в качестве запроса для поиска его гомологов у различных видов растений, полные геномы которых были секвенированы в GenBank с использованием алгоритма BlastP. Последовательности были выровнены с помощью программы ClustalX, и филогенетическое дерево максимального правдоподобия было построено с использованием MEGA 6 со значением начальной репликации 1000 (Chenna et al. , 2003; Tamura et al., 2013).

Нозерн-блот

Для проведения Нозерн-блоттинга суммарную РНК экстрагировали из листьев 3-недельных мутантных растений dy1 и растений WT.Десять микрограмм общей РНК загружали на каждую дорожку и разделяли на 1,5% агарозном геле. После разделения РНК наносили на положительно заряженную нейлоновую мембрану (GE Healthcare, Питтсбург, Пенсильвания, США). Зонд для обнаружения транскриптов DY1 амплифицировали с использованием пары праймеров DY1-Probe-F и DY1-Probe-R с кДНК DY1 в качестве матрицы, а затем метили с использованием смеси для маркировки ДНК DIG (Roche, Базель, Швейцария). Зондирование, промывание и обнаружение DY1 выполняли в соответствии с руководством пользователя DIG High Prime DNA Labeling and Detection Starter Kit II (Roche).

Экстракция белков и вестерн-блоттинг

Общий белок экстрагировали из листьев розетки с использованием метода осаждения трихлоруксусной кислотой (TCA). Примерно 1 г листьев розетки гомогенизировали в жидком азоте. Затем добавляли десять миллилитров холодной 10% TCA в ацетоне и хорошо перемешивали на вортексе и обработке ультразвуком. Смесь инкубировали при -20 ° C в течение не менее 4 ч, а затем центрифугировали при 4 ° C, 15000 г в течение 20 мин. Осадок несколько раз промывали холодным ацетоном, ненадолго сушили на воздухе и солюбилизировали в 9 М мочевине (в 100 мМ фосфатно-солевом буфере, 1 мМ DTT) с обработкой ультразвуком.Осаждение повторяли один раз, и осажденный белок окончательно растворяли в 9 М растворе мочевины для непосредственного использования или хранения.

Образцы белка смешивали с равными количествами загрузочного буфера 2 × SDS (Green and Sambrook, 2012), нагревали при 65 ° C в течение 10 мин, разделяли на 12% SDS-полиакриламидном геле и затем наносили на нитроцеллюлозную мембрану (GE Healthcare) для иммунодетекция. Пептид (WSIRNPTDLETSSY) был синтезирован на основе выведенной аминокислотной последовательности DY1 и использован в качестве антигена для иммунных кроликов GenScript (Нанкин, Китай). Антисыворотку очищали от блотов согласно Harlow and Lane (1988). Антитело против актина 11 было приобретено у Agrisera (Vännäs, Швеция). Вторичное антитело против кроличьего IgG, конъюгированное с пероксидазой хрена (HRP), было от Promega (Мэдисон, Висконсин, США). Соблюдались общие протоколы (Green and Sambrook, 2012) и руководства производителей по электрофорезу, полусухому блоттингу и вестерн-детекции с использованием субстрата для вестерн-блоттинга ECL (Promega, Мэдисон, Висконсин, США).

Микроскопия

Для флуоресцентных наблюдений использовалась система лазерной сканирующей конфокальной микроскопии FluoView FV1000 (Olympus, Токио, Япония).Флуоресцентный eYFP возбуждали лазером 488 нм, и излучаемый свет регистрировался от 500 до 530 нм. Флуоресцентный модуль mCherry возбуждали лазером с длиной волны 543 нм, регистрировали от 580 до 620 нм. Для наблюдения автофлуоресценции хлорофилла использовали лазерное возбуждение 543 нм и диапазон регистрации от 680 до 720 нм.

Для анализа с помощью просвечивающей электронной микроскопии (ПЭМ) листья трехнедельных проростков фиксировали, заделывали и делали срезы в соответствии с Faso et al. (2009). Просвечивающий электронный микроскоп Hitachi-7700 (Hitachi, Токио, Япония) использовался для наблюдения и захвата изображений.

Выделение, фракционирование и исходный синий хлоропласт (BN) — СТРАНИЦА

Около 10 г розеточных листьев кратковременно гомогенизировали в холодном буфере для выделения хлоропластов (0,3 М сорбит, 5 мМ MgCl ₂ , 5 мМ EGTA, 5 мМ ЭДТА, 20 мМ HEPES, 10 мМ NaHCO ₃ , pH 8,0) и затем фильтровали через два слоя чудесной ткани (EMD Millipore, Биллерика, Массачусетс, США). Неочищенные хлоропласты собирали центрифугированием в течение 5 мин при 4 ° C, 1000 г . После разделения сырых хлоропластов на 2-слойном градиенте Перколла (40 и 80%), на границе раздела между двумя слоями были получены интактные хлоропласты.Очищенные хлоропласты дополнительно лизировали в растворе ТЕ (10 мМ Трис-HCl, 1 мМ ЭДТА, pH 7,5) в течение 30 минут на льду с последующим центрифугированием в течение 5 минут при 3000 g для сбора тилакоидных мембран.

Для BN-PAGE интактные хлоропласты солюбилизировали в буфере для солюбилизации (50 мМ бис-трис, pH 7,0, 0,5 М аминокапроновой кислоты, 10% глицерина, 1% n -додецил β- D -мальтозид и 1 мМ PMSF. ) на льду в течение 10 мин перед разделением на 4% -14% градиентном геле. После электрофореза в первом измерении гель либо непосредственно наносили на PVDF-мембрану (Millipore), либо дополнительно разделяли с помощью SDS-PAGE для второго измерения (Zhou et al., 2017).

Количественное определение пигмента

Хлорофиллы и каротиноиды были выделены из розеточных листьев согласно Pogson et al. (1996). Сто миллиграмм листьев измельчали ​​в жидком азоте в мелкий порошок и тщательно перемешивали с 250 мкл 80% ацетона, содержащего 10 мкг диметилового эфира дейтеропорфирина IX (Sigma – Aldrich, Сент-Луис, Миссури, США) в качестве внутреннего стандарта. Затем экстракт смешивали с 250 мкл этилацетата, а затем с 200 мкл воды. После центрифугирования при 4 ° C, 15000 г в течение 10 мин, верхнюю органическую фазу собирали и сушили в токе азота. Пигмент повторно растворяли в растворителе А (ацетонитрил: вода: триметиламин = 9: 1: 0,01) для анализа методом высокоэффективной жидкостной хроматографии (ВЭЖХ). Все шаги проводились при тусклом свете.

Образцы

общего пигмента были проанализированы с помощью ВЭЖХ (модуль разделения Waters 2695) с аналитической колонкой Waters ODS2 C18 (5 мкм, 4,6 мм × 250 мм) и детектором с фотодиодной матрицей 2998 (Waters, Milford, MA, США) согласно Wang et al. al. (2016).

Анализ флуоресценции хлорофилла

Флуоресценцию хлорофилла

3-недельного мутанта dy1 и растений WT измеряли с помощью флуориметра MINI-PAM (Walz, Effeltrich, Германия) согласно Wang et al.(2016). Для получения кривых светового отклика квантового выхода ФСII (ΦPSII) и нефотохимического тушения (NPQ) адаптированные к темноте растения освещали серией фотосинтетически активных плотностей потока фотонов (PPFD) (3, 19, 43, 145, 300, 387, 611, 1006 и 1312 мкмоль фотонов м ^-2 с ^-1 ). Минимальный выход флуоресценции ( F ₀ ) под 650 нм был измерен при 0,8 мкмоль фотонов m ^-2 с ^-1 . Для оценки максимального выхода флуоресценции ( F _m ) насыщающий импульс (0.8 с, 5000 мкмоль фотонов м ^-2 с ^-1 ).

Двухгибридный скрининг дрожжей

Скрининг двугибридных дрожжей проводился в основном в соответствии с Руководством пользователя Matchmaker ^TM GAL4 Two-Hybrid System 3 & Libraries (TaKaRa). Полноразмерная ORF DY1 была клонирована в pDEST32 (Invitrogen, Carlsbad, CA, United States), а затем трансформирована в дрожжевой ( Saccharomyces cerevisiae ) штамм Ah209. Библиотека кДНК A. thaliana , сконструированная в pDEST22 (Invitrogen), поддерживалась в дрожжевом штамме Y187.После спаривания диплоидные дрожжевые клетки подвергали скринингу на среде с тройным выпадением SD / -Leu / -Trp / -His. Из положительных колоний вставки кДНК, кодирующие белки-жертвы, амплифицировали с помощью ПЦР и секвенировали. Гены-кандидаты были дополнительно протестированы на парное взаимодействие с использованием системы pGAD-T7 / pGBK-T7 (TaKaRa). Вкратце, кодирующие последовательности DY1, и гены-кандидаты клонировали в pGAD-T7 и pGBK-T7 соответственно. Плазмиды совместно трансформировали в штамм дрожжей Ah209 и отбирали на планшетах с двойным выпадением SD / -Leu / -Trp.Колонии были серийно разведены и дополнительно протестированы на планшетах с четырехкратным выпадением SD / -Leu / -Trp / -His / -Ade для выявления межбелковых взаимодействий.

Статистический анализ

Статистическая значимость была проверена с использованием GraphPad Prism6 (GraphPad Software). Данные представлены как средние значения ± стандартное отклонение не менее трех повторов.

Результаты

Характеристика мутанта

dy1

Мы проверили 10 000 особей библиотеки мутантных вставок Т-ДНК.По крайней мере, 20 линий показали бледно-зеленые, желтоватые или полностью альбиносные семядоли. Положения вставок Т-ДНК в этих линиях были идентифицированы путем прогулок по геному. Доказано, что одна из этих линий, показавших карликовый рост и желтоватые семядоли (рис. 1А), содержит вставку Т-ДНК перед третьим экзоном At5g19540 (рис. 1С). Мы назвали этот не охарактеризованный ген Dwarf и Yellow 1 ( DY1 ). Нозерн-блоттинг (рис. 1B) и эксперименты по геномной комплементации (рис. 1A) подтвердили, что At5g19540 отвечает за соответствующие фенотипы. DY1 кодирует белок массой 53 кДа с предсказанным N-концевым транзитным пептидом (cTP), который, как было предсказано, нацелен на DY1 в хлоропласты (дополнительная фигура S1). Мутантные проростки dy1 оказались дефектными по деэтиоляции, т.е. их семядоли оставались желтыми после освещения. Вегетативный рост проростков dy1 был сильно замедлен. Ювенильные настоящие листья мутанта dy1 также имели дефекты пигментации, тогда как зрелые листья мутанта были более зелеными (рис. 1А).

РИСУНОК 1. Фенотип и характеристика мутантного растения dy1 . (A) dy1 , WT и At5g19540 трансформировали dy1 растений, выращенных на чашках MS. Прутки = 2 мм. (B) Нозерн-блот, демонстрирующий молчание At5g19540 в мутанте dy1 . (C) Положение вставки Т-ДНК dy1 . Вставка находится на 3 п.н. выше третьего экзона At5g19540 .Отмечены размеры каждого интрона и экзона.

DY1 высоко сохраняется в растениях

Мы не нашли ни отчетов о функциональных характеристиках, ни аннотаций для DY1 , поэтому мы провели поиск в GenBank на предмет гомологов DY1 . У каждого вида растений, для которых был секвенирован полный геном, была обнаружена только одна копия гена гомолога DY1 . Мы не нашли близких гомологов DY1 в цианобактериях, зеленых водорослях или диатомовых водорослях, хотя есть некоторые последовательности в определенных организмах со слабым сходством с DY1 (рис. 2).

РИСУНОК 2. Множественное выравнивание последовательностей (A) и филогенетический анализ (B) гомологов DY1. Последовательности взяты из видов растений, для которых были секвенированы полные геномы, включая Amborella trichopoda (Atr, XP_006833290.3), Arabidopsis thaliana (Ath, OAO95398.1), Brachypodium distachyon (Bdi, XP_003574414.1) Cucumis sativus (Csa, XP_004150055.2), Marchantia polymorpha (Mpo, OAE23078.1), Medicago truncatula (Mtr, AFK48173.1), Oryza sativa (Osa, XP_015650923.1), Physcomitrella patens (Ppa, XP_001768011.1), Populus trichocarpar324991.1 (XP) , Selaginella moellendorffii (Smo, XP_002961080.1), Solanum tuberosum (Stu, XP_006353458.1), Vitis vinifera (Vvi, XP_002280972.1), Zostera marina.1, KM7. Последовательности из зеленой водоросли Ostreococcus lucimarinus (Olu, XP_001420303.1) и диатомовые водоросли Fragilariopsis cylindrus (Fcy, OEU12403. 1), которые показали сходство с DY1, были включены в филогенетическое дерево. Масштабная линейка соответствует 20% расхождению аминокислотной последовательности.

Сравнения выведенных аминокислотных последовательностей гомологов DY1 выявили высококонсервативные области, охватывающие всю последовательность за пределами cTP гомологов (рис. 2А). Общая идентичность последовательностей среди гомологов DY1 превышает 40% и превышает 60%, если исключить наиболее вариабельные области cTP.На филогенетическом дереве гомологи DY1 сформировали две основные клады, одна из которых состояла из членов от покрытосеменных, а другая — из гомологов от остальных наземных растений, включая голосеменные и мохообразные. Кладу покрытосеменных можно разделить на 2 подклассы, по одной для двудольных и однодольных (рис. 2В).

Мутант

dy1 нарушает биосинтез пигмента и световую акклиматизацию

Листья мутанта dy1 показали заметно более светлый цвет по сравнению с листьями растений WT. Таким образом, мы предположили, что мутант dy1 может накапливать меньшее количество пигментов. В нашей количественной оценке пигментов в 3-недельных проростках содержание хлорофилла a и b в мутанте dy1 было значительно ниже, чем в растениях WT. Что касается каротиноидов, dy1 листьев также накапливали меньше неоксантина, виолаксантина, лютеина и β-каротина по сравнению с растениями WT. Однако при нормальных условиях роста было обнаружено, что два ксантофилла, антераксантин и зеаксантин, накапливаются в листьях dy1 , хотя и в следовых количествах (рис. 3).Количества всех содержащихся пигментов указаны в Таблице 1.

РИСУНОК 3. Разделение пигментов с помощью высокоэффективной жидкостной хроматографии (ВЭЖХ) в трехнедельных розеточных листьях мутантных растений (A) (A) (A) dy1 и растений дикого типа (B) . Пики представляют собой неоксантин (Nx), внутренний стандарт (IS), виолаксантин (Vx), антераксантин (Ax), лютеин (Lu), зеаксантин (Zx), β-каротин (βC) и хлорофилл a и b ( Chl a и Chl b ).

ТАБЛИЦА 1. Профиль пигментации листьев Arabidopsis thaliana дикого типа (WT) и dy1 мутантных растений (мкг / г сырой массы).

Затем мы количественно определили количество транскриптов генов биосинтеза хлорофилла и каротиноидов. В 3-недельных листьях dy1 экспрессия большинства генов биосинтеза хлорофилла, например, CRD1 , CHLH , PORB , GUN4 и CAO , была подавлена ​​(рис. 4А).Интересно, что гены обмена хлорофилла, включая PAO и RCCR , также были подавлены в dy1 (Рисунок 4B). Более того, экспрессия большинства генов хлорофилла a / b -связывающих белков ( CABs ) также подавлялась в dy1 (Рисунок 4C). Большинство генов биосинтеза и катаболизма каротиноидов также подавлялись в dy1 (рис. 4D). Короче говоря, в нашем определении не было активировано никаких генов метаболизма пигментов в dy1 .

РИСУНОК 4. Экспрессия генов, кодирующих ферменты биосинтеза хлорофилла (A) и оборот (B) , хлорофилл-связывающие белки (C) и ферменты метаболизма каротиноидов (D) в листьях розетки 3-недельного возраста dy1 и проростков дикого типа (WT). Обилие транскриптов каждого гена определяли количественной ПЦР в реальном времени и нормализовали по уровню ACT2 ( At3g18780 ).Данные представляют собой средние значения ± стандартное отклонение (критерий Стьюдента t ; n = 3; ^∗ P <0,05; ^∗∗ P <0,01).

Поскольку dy1 имеет меньшее количество пигментов листьев, мы предположили, что он также может иметь более низкую фотосинтетическую способность. Это подтверждено измерениями параметров флуоресценции хлорофилла. В нашем исследовании значение F _v / F _m , которое отражает эффективность фотохимии ФСII, было уменьшено с 0.83 у растений WT до 0,73 у dy1 (таблица 2). Мы также измерили светочувствительные кривые для оценки ΦPSII и NPQ как у растений dy1, , так и у растений WT при серии значений интенсивности света. Растения WT имели более высокий ФПСII, чем растения dy1 при всех измеренных нами интенсивностях света (рис. 5А). Однако dy1 имел более высокий NPQ, чем растения WT, когда интенсивность света была ниже 300 мкмоль фотонов m ^-2 с ^-1 ( P <0.05 при 43 и 145 мкмоль фотонов m ^-2 с ^-1 ) (Рисунок 5B).

ТАБЛИЦА 2. Параметры флуоресценции хлорофилла в листьях мутанта dy1 и растений дикого типа (WT), выращенных при глубине 100 мкмоль ^-2 с ^-1 .

РИСУНОК 5. Кривые светового отклика квантового выхода PSII (ΦPSII) (A) и нефотохимического тушения (NPQ) (B) у дикого типа (WT, синий) и dy1 мутантных (красных) саженцев.Измерения проводились при плотностях фотосинтетического активного потока фотонов (PPFD) 3, 19, 43, 145, 300, 387, 611, 1,006 и 1,312 мкмоль м ^-2 с ^-1 . Данные представляют собой средние значения ± стандартное отклонение ( n = 6).

DY1 влияет на сборку тилакоидной мембраны

Мы вскрыли настоящие листья 3-недельных мутантных растений dy1 и растений WT для наблюдений с помощью ТЕА. Мутант dy1 обычно показывает нормальную форму хлоропластов и образование тилакоидов. Однако у мутанта dy1 тилакоидные мембраны были неплотно упакованы в граны (со средней толщиной каждого слоя тилакоидов граны 21.3 ± 1,9 нм по сравнению с уровнем WT 14,3 ± 1,4 нм) и имел больше пластоглобул (рис. 6).

РИСУНОК 6. Наблюдение с помощью просвечивающей электронной микроскопии (ТЕМ) хлоропластов из листьев дикого типа (WT) (A, C) и мутантных проростков dy1 (B, D) . Полосы = 1 мкм (в A, B ) или 500 нм (в C, D ). (C, D) — это увеличенные изображения областей в рамке в (A, B) , соответственно.

DY1 — это белок хлоропласта, который подвергается посттрансляционному регулированию

DY1 кодирует белок с 462 аминокислотами. Обе онлайн-программы ChloroP и TargetP предсказывали локализацию хлоропластов. Чтобы подтвердить локализацию хлоропластов, полноразмерный белок DY1 с усиленным желтым флуоресцентным белком (eYFP), слитый с его С-концом, временно экспрессировался в протопластах Arabidopsis. Флуоресценция DY1-eYFP строго перекрывается с аутофлуоресценцией хлорофилла, что указывает на локализацию хлоропластов (рис. 7A).Из аминокислотной последовательности DY1 мы идентифицировали мотив двойного аргинина (R ⁸⁴ R ⁸⁵ ) (дополнительный рисунок S1), который указывает на то, что DY1, вероятно, импортируется в хлоропласты посредством ΔpH-зависимого пути (Robinson and Bolhuis , 2001). Сообщалось, что для белков, импортируемых этим путем, их С-концевые фрагменты, предшествующие мотиву двойного аргинина, должны быть расщеплены после импорта (Williams et al., 2000; Robinson and Bolhuis, 2001). Таким образом, мы выделили интактные хлоропласты из листьев WT, разделили их на фракции стромы и тилакоидов и выполнили SDS-PAGE и вестерн-блот-анализы. Из наших иммуноблотов, исследованных специфическим антителом против DY1, в образце общего хлоропластного белка и стромальной фракции была обнаружена полоса 42 кДа (рис. 7В). Это открытие согласуется с рассчитанным размером DY1 после расщепления (DY1 ^ΔcTP ) и доказывает локализацию DY1 в строме.

РИСУНОК 7. DY1 представляет собой белок стромы хлоропласта. (A) Субклеточная локализация DY1 в хлоропласте. Протопласты, трансформированные pA7-eYFP-DY1, наблюдали в системе лазерной конфокальной микроскопии FLUOVIEW FV1000 (Olympus) (полоски = 20 мкм). (B) Вестерн-блоттинг, демонстрирующий локализацию DY1 в строме. Очищенный хлоропласт субфракционировали на фракции стромы и тилакоидной мембраны, разделяли с помощью SDS-PAGE, блоттинга и зондирования антисывороткой против DY1. LHCB1 и RbcL были исследованы как контроли. Показаны полосы процессированной и зрелой форм DY1 при 42 и 24 кДа соответственно. TP, общий белок растений; CP, интактный белок хлоропласта; Str — фракция стромы; Thy, тилакоидная мембранная фракция. (C) Вестерн-блот-анализ накопления 24 кДа формы DY1 во время развития листа. Цифры над каждой полосой указывают стадии роста в неделях.

К нашему удивлению, дополнительная меньшая полоса 24 кДа часто обнаруживалась во фракциях стромы растений WT (рис. 7B). Мы обнаружили, что уровень белка DY1 ^ΔcTP был более стабильным на всех стадиях развития, в то время как содержание более мелкой формы имело тенденцию к накоплению с течением времени (рис. 7C).Таким образом, мы предположили, что после импортирования в хлоропласты DY1 может подвергаться дальнейшей переработке во время созревания листьев. Чтобы проверить это визуально, мы слили eYFP сразу после cTP и mCherry на конце C-конца DY1 (рис. 8A), и мы экспрессировали этот гибридный белок с двойными флуоресцентными метками в табаке и арабидопсисе. В табаке мы провели временную экспрессию в молодых листьях, которые были близко к верхушечному побегу, и в зрелых листьях снизу растения. Через 3 дня сигналы как eYFP, так и mCherry можно было четко наблюдать в хлоропластах ювенильных листьев. Однако в зрелых листьях большинство наблюдаемых хлоропластов имели схожую силу сигнала eYFP, но их сигналы mCherry были намного слабее (рис. 8C). Было ясно, что в растениях Arabidopsis, которые были генетически трансформированы для экспрессии этого слитого белка, в зрелых листьях можно было обнаружить только сигнал eYFP (фиг. 8D). Когда мы исследовали образцы белка трансгенных проростков арабидопсиса в возрасте 1 и 2 недели, антитело против eYFP могло обнаружить слитый белок DY1 в обоих образцах, тогда как антитело против mCherry показало только слабую полосу на блоте, что предполагает удаление белка. C-конец от DY1 (Рисунок 8B).Эти результаты продемонстрировали, что DY1 созревает по мере развития листа.

РИСУНОК 8. Зрелая форма DY1 подвергается дальнейшей переработке во время развития листьев. (A) Диаграмма, показывающая пребелковую структуру белка DY1, меченного двойными флуоресцентными белками. (B) Вестерн-блоттинг-анализ количеств обоих концов DY1, меченных двойными флуоресцентными белками. Суммарные белки экстрагировали из однонедельных и двухнедельных трансгенных проростков арабидопсиса. (C) Временная экспрессия слитого белка eYFP-DY1-mCherry в листьях табака, демонстрирующая возможное расщепление С-конца DY1 во время развития листа. Штанги = 10 мкм. (D) Флуоресцентное наблюдение за 2-недельными проростками Arabidopsis, показывающее отсутствие сигналов mCherry. Штанги = 5 мкм. В (C) и (D) панели Profile (зеленая линия, сигнал eYFP; оранжевая линия, сигнал mCherry) демонстрируют профили интенсивности сигнала вдоль вертикальных линий, указанных на панелях слияния.

Чтобы определить распределение двух форм DY1 в хлоропластах, мы выполнили BN-PAGE для разделения различных белковых комплексов в хлоропластах (Рисунок 9A), а затем SDS-PAGE в качестве второго измерения (Рисунок 9B). После электрофореза гели каждого измерения подвергали блоттингу, а затем зондировали антителом против DY1. Наш вестерн-блот ясно показал, что как 42-, так и 24-кДа формы DY1 могут быть обнаружены в позиции около 300 кДа, которая находится вокруг ядра PSII + Cyt b ₆ f комплекса (Timperio et al. al., 2007; Chen et al., 2010), и форма 42 кДа также может быть исследована в положении приблизительно 100 кДа (фигура 9B).

РИСУНОК 9. PAGE с природным синим и вестерн-блоттинг, показывающий, что DY1 существует в различных белковых комплексах в хлоропласте. Образцы белков интактных хлоропластов из 3-недельных растений Arabidopsis дикого типа разделяли с помощью BN-PAGE в качестве первого измерения (A) . Chl, гель после блоттинга, содержащий только хлорофиллы. Гель либо непосредственно подвергали блоттингу и зондировали антителом против DY1, либо дополнительно разделяли с помощью SDS-PAGE в качестве второго измерения, а затем подвергали блоттингу и зондированию тем же антителом (B) .Позиции белка DY1, исследуемого его антителом, обозначены треугольниками.

Обсуждение

В этом исследовании путем скрининга пула мутантов арабидопсиса, содержащих вставки Т-ДНК, мы идентифицировали новый белок, кодируемый At5g19540 , DY1, который важен для биосинтеза как хлорофиллов, так и каротиноидов и участвует в сборке грана. тилакоиды. Тот факт, что нам не удалось получить близких гомологов от цианобактерий, зеленых водорослей и диатомовых водорослей, указывает на то, что DY1 , вероятно, был приобретен только предком сосудистых растений.Присутствие только одной копии DY1 в геноме каждого вида растений и высокая идентичность последовательностей среди его гомологов предполагают его критическую функцию.

Отличительным фенотипом мутанта dy1 является меньшее количество как хлорофиллов, так и каротиноидов. Основываясь на нашей количественной оценке генов, кодирующих ферменты метаболизма хлорофилла и каротиноидов, которые участвуют в биосинтезе и катаболизме, а также для белков, связывающих хлорофилл, кажется, что экспрессия всех этих генов подавляется подавлением молчания DY1 . .Однако с помощью нашего анализа ВЭЖХ мы обнаружили аномальное накопление двух ксантофиллов, антераксантина и зеаксантина, в листьях dy1 при выращивании на свету. И антераксантин, и зеаксантин являются участниками нефотохимического механизма гашения энергии, используемого высшими растениями в условиях сильного светового стресса, называемого ксантофилловым циклом (Demmig-Adams and Adams, 1996; Johnson et al. , 2008). Эти пигменты отсутствуют у растений WT, адаптированных к нормальному свету для роста, но они накапливаются, когда есть дефект в функциональности фотосистемы или растения страдают от повреждения высоким светом.Интересно, что в нашем анализе флуоресценции хлорофилла мутантные листья dy1 показали увеличение минимального выхода флуоресценции ( F ₀ ) вместе со сниженным уровнем максимального выхода флуоресценции ( F _m ) и результирующий максимальный квантовый выход ФСII ( F _v / F _м = [ F _м –F ₀ ] / F _м ). Это указывало либо на дефект переноса электронов внутри ФСII, либо на частичное отключение антенны LHCII, аналогично мутантам hhl1 и pam71 (Jin et al., 2014; Schneider et al., 2016). Это подтверждается нашим определением ФПСII и NPQ, которые все были ниже у растений dy1 по сравнению с растениями дикого типа. Однако растения dy1 имели более высокий NPQ по сравнению с растениями WT, когда интенсивность света была ниже 300 мкмоль фотонов m ^-2 с ^-1 . Вероятно, это связано с накоплением зеаксантина и антераксантина в растениях dy1 . Взятые вместе, наши результаты продемонстрировали стрессовое состояние dy1 PSII.Это могло бы объяснить более низкое количество общих хлорофиллов и каротиноидов и замедленный рост dy1 .

Участие DY1 в функции хлоропластов дополнительно подтверждается нашими наблюдениями ТЕМ, а также анализами BN-PAGE и вестерн-блоттинга. Сообщалось, что укладка гран является критической для зависимого от ксантофиллового цикла NPQ (Goss et al., 2007). Хотя хлоропласты мутантов dy1 сохраняли нормальную форму мутантов WT, было ясно, что тилакоиды свободно укладываются в граны в хлоропластах dy1 .Наши вестерн-блоттинги, показывающие, что DY1 существует в белковом комплексе, мигрирует вместе с комплексом PSII core + Cyt b ₆ f , что предполагает возможное участие DY1 в PSII.

Особенностью DY1 является его созревание. Из нашего вестерн-блоттинга и наблюдения за субклеточной локализацией гибридного белка с двойными флуоресцентными метками ясно, что пептид DY1 процессируется дважды после трансляции. Транзитный пептид хлоропластного белка, кодируемого ядерным геном, обычно удаляется после того, как пре-белок импортирован в хлоропласты.Но C-концевой конец DY1 дополнительно расщеплялся во время созревания листьев. Неясно, нужна ли эта зрелая форма DY1 для созревания листьев или является просто результатом. Более того, хотя DY1 был обнаружен только во фракции стромы хлоропластов, наш вестерн-блоттинг образцов, разделенных BN-PAGE, также продемонстрировал его существование в двух разных белковых комплексах, что предполагает его возможные взаимодействия с разными белками-партнерами. В ходе двухгибридного скрининга дрожжей мы определили, что DY1 взаимодействует с RABE1b, фактором удлинения связывания GTP (дополнительный рисунок S2A).Наша временная экспрессия протопласта также подтвердила локализацию RABE1b в хлоропласте (дополнительный рисунок S2B), что указывает на пространственную совместную локализацию этих двух белков. Глубокий анализ белок-белкового взаимодействия между DY1 и RABE1b может помочь расшифровать новый механизм, который регулирует метаболизм пигментов и функции хлоропластов во время развития растений.

Авторские взносы

X-QH, LZ и SL разработали и разработали эксперименты. X-QH, LZ, J-DR, C-FZ и ZZ проводили эксперименты.X-QH, LZ, C-FZ и SL проанализировали данные. С.Л. написал статью.

Финансирование

Эта работа была поддержана Государственным планом ключевых фундаментальных исследований и разработок Китая (973, № 2013CB127004) и Национальным фондом естественных наук Китая (NSFC, №№ 31770331 и 002).

Заявление о конфликте интересов

Авторы заявляют, что исследование проводилось при отсутствии каких-либо коммерческих или финансовых отношений, которые могут быть истолкованы как потенциальный конфликт интересов.

Благодарность

Авторы благодарят ABRC за пул мутантных инсерций Т-ДНК Arabidopsis.

Дополнительные материалы

Дополнительные материалы к этой статье можно найти в Интернете по адресу: https://www. frontiersin.org/articles/10.3389/fpls.2017.02140/full#supplementary-material

РИСУНОК S1 | Нуклеотид и выведенная аминокислотная последовательность DY1. Предполагаемый сайт расщепления после транзитного пептида хлоропласта указан черной стрелкой.Фрагмент пептида, использованный для получения антисыворотки против DY1, подчеркнут.

РИСУНОК S2 | DY1 взаимодействует с белком-гомологом RAB GTPase At4g20360. (A) Дрожжевой двугибридный анализ взаимодействия между DY1 и At4g20360. DY1 и At4g20360 были клонированы в pDEST32 и pDEST22 соответственно. Клетки дрожжей Ah209 котрансформировали комбинацией этих плазмид и высевали на неселективные (SD / -Leu / -Trp, DDO) и селективные (SD / -Leu / -Trp / -His / -Ade, QDO) планшеты в последовательном разведении. (B) At4g20360 также локализуется в хлоропластах.

ТАБЛИЦА S1 | Праймеры, использованные в этом исследовании.

Сноски

1. http://signal. salk.edu/tdnaprimers.2.html

Список литературы

Альбрехт В., Ингенфельд А. и Апель К. (2006). Характеристика мутанта снежной семядоли 1 Arabidopsis thaliana : влияние фактора удлинения хлоропластов G на развитие хлоропластов и жизнеспособность растений. Завод Мол. Биол. 60, 507–518. DOI: 10.1007 / s11103-005-4921-0

PubMed Аннотация | CrossRef Полный текст | Google Scholar

Альбрехт В., Ингенфельд А. и Апель К. (2008). Snowy cotyledon 2 : идентификация белка домена цинкового пальца, необходимого для развития хлоропластов в семядолях, но не в настоящих листьях. Завод Мол. Биол. 66, 599–608. DOI: 10.1007 / s11103-008-9291-y

PubMed Аннотация | CrossRef Полный текст | Google Scholar

Альбрехт, В., Симкова, К., Кэрри, К., Деланной, Э., Жиро, Э., Уилан, Дж. И др. (2010). Цитоскелет и белок SNOWY COTYLEDON3, нацеленный на пероксисому, необходимы для развития хлоропластов у арабидопсиса . Растительная клетка 22, 3423–3438. DOI: 10.1105 / tpc.110.074781

PubMed Аннотация | CrossRef Полный текст | Google Scholar

Альбрехт-Борт, В., Каусс, Д., Фан, Д., Ху, Ю., Коллиндж, Д., Марри, С. и др. (2013). Новая протеиназа, SNOWY COTYLEDON4, необходима для фотосинтетической акклиматизации Arabidopsis к более высокой интенсивности света. Plant Physiol. 163, к732–745. DOI: 10.1104 / стр.113.216036

PubMed Аннотация | CrossRef Полный текст | Google Scholar

Алуру, М. Р., Бэ, Х., Ву, Д., и Родермел, С. Р. (2001). Мутация Arabidopsis immutans влияет на дифференцировку пластид и морфогенез белых и зеленых секторов у пестролистных растений. Plant Physiol. 127, 67–77. DOI: 10.1104 / стр.127.1.67

PubMed Аннотация | CrossRef Полный текст | Google Scholar

Андрианкая, М.E., Danisman, S., Mignolet-Spruyt, L.F., Claeys, H., Kochanke, I., Vermeersch, M., et al. (2014). Транскрипционная координация между дифференцировкой листовых клеток и развитием хлоропластов, установленная TCP20 и факторами транскрипции bHLH подгруппы Ib. Завод Мол. Биол. 85, 233–245. DOI: 10.1007 / s11103-014-0180-2

PubMed Аннотация | CrossRef Полный текст | Google Scholar

Cheminant, S., Wild, M., Bouvier, F., Pelletier, S., Renou, J.P., Erhardt, M., et al.(2011). DELLA регулируют биосинтез хлорофилла и каротиноидов для предотвращения фотоокислительного повреждения во время деэтиоляции проростков Arabidopsis. Растительная клетка 23, 1849–1860. DOI: 10.1105 / tpc.111.085233

PubMed Аннотация | CrossRef Полный текст | Google Scholar

Чен, К.-М., Хольмстрём, М., Раксаджит, В., Суорса, М., Пийппо, М., и Аро, Э.-М. (2010). Малые белки DnaJ, нацеленные на хлоропласты, участвуют в оптимизации фотосинтетических реакций у Arabidopsis thaliana .BMC Plant Biol. 10:43. DOI: 10.1186 / 1471-2229-10-43

PubMed Аннотация | CrossRef Полный текст | Google Scholar

Ченна Р., Сугавара Х., Койке Т., Лопес Р., Гибсон Т. Дж., Хиггинс Д. Г. и др. (2003). Множественное выравнивание последовательностей с помощью clustal серии программ. Nucleic Acids Res. 31, 3497–3500. DOI: 10.1093 / nar / gkg500

CrossRef Полный текст | Google Scholar

Клаф, С. Дж., И Бент, А. Ф. (1998). Цветочный окунание: упрощенный метод трансформации Arabidopsis thaliana, опосредованной Agrobacterium .Завод J. 16, 735–743. DOI: 10.1046 / j.1365-313x.1998.00343.x

PubMed Аннотация | CrossRef Полный текст | Google Scholar

Деммиг-Адамс Б. и Адамс В. В. III. (1996). Роль каротиноидов ксантофиллового цикла в защите фотосинтеза. Trends Plant Sci. 1, 21–26. DOI: 10.1016 / S1360-1385 (96) 80019-7

CrossRef Полный текст | Google Scholar

Эмануэльссон, О., Брунак, С., Фон Хейне, Г., и Нильсен, Х. (2007). Поиск белков в клетке с помощью TargetP, SignalP и связанных с ними инструментов. Nat. Protoc. 2, 953–971. DOI: 10.1038 / nprot.2007.131

PubMed Аннотация | CrossRef Полный текст | Google Scholar

Эмануэльссон, О., Нильсен, Х., и фон Хейне, Г. (1999). ChloroP, метод нейронной сети для прогнозирования транзитных пептидов хлоропластов и их сайтов расщепления. Protein Sci. 8, 978–984. DOI: 10.1110 / пс. 8.5.978

PubMed Аннотация | CrossRef Полный текст | Google Scholar

Фасо, К., Чен, Ю. Н., Тамура, К., Хельд, М., Zemelis, S., Marti, L., et al. (2009). Миссенс-мутация в белке оболочки Sec24A Arabidopsis COPII индуцирует образование кластеров эндоплазматического ретикулума и аппарата Гольджи. Растительная клетка 21, 3655–3671. DOI: 10.1105 / tpc.109.068262

PubMed Аннотация | CrossRef Полный текст | Google Scholar

Фристедт Р., Уильямс-Кэрриер Р., Мерчант С.С. и Баркан А. (2014). Белок тилакоидной мембраны, несущий домен цинкового пальца DnaJ-типа, необходим для накопления фотосистемы I в растениях. J. Biol. Chem. 289, 30657–30667. DOI: 10.1074 / jbc.M114.587758

PubMed Аннотация | CrossRef Полный текст | Google Scholar

Госс Р., Ороси С. и Вильгельм К. (2007). Важность укладки гран для зависимого от ксантофиллового цикла NPQ в тилакоидных мембранах высших растений. Physiol. Растение. 131, 496–507. DOI: 10.1111 / j.1399-3054.2007.00964.x

PubMed Аннотация | CrossRef Полный текст | Google Scholar

Грин, М. Р., Сэмбрук, Дж.(2012). Молекулярное клонирование: лабораторное руководство . Колд-Спрингер-Харбор, Нью-Йорк: Лаборатория Колд-Спрингер-Харбор.

Google Scholar

Харлоу Э. и Лейн Д. (1988). Антитела: лабораторное руководство . Колд-Спринг-Харбор, Нью-Йорк: Лаборатория Колд-Спринг-Харбор.

Google Scholar

Jin, H., Liu, B., Luo, L., Feng, D., Wang, P., Liu, J., et al. (2014). ГИПЕРЧУВСТВИТЕЛЬНОСТЬ К ВЫСОКОМУ СВЕТУ1 взаимодействует с НИЗКИМ КВАНТОВЫМ УХОДОМ ФОТОСИСТЕМЫ II1 и действует в защите фотосистемы II от фотоповреждений у арабидопсиса .Растительная клетка 26, 1213–1229. DOI: 10.1105 / tpc.113.122424

PubMed Аннотация | CrossRef Полный текст | Google Scholar

Джонсон, М. П., Дэвисон, П. А., Рубан, А. В., и Хортон, П. (2008). Размер пула цикла ксантофилла контролирует кинетику нефотохимического тушения у Arabidopsis thaliana . FEBS Lett. 582, 262–266. DOI: 10.1016 / j.febslet.2007.12.016

PubMed Аннотация | CrossRef Полный текст | Google Scholar

Маллет, Дж. Э. (1988).Развитие хлоропластов и экспрессия генов. Annu. Rev. Plant Physiol. Завод Мол. Биол. 39, 475–502. DOI: 10.1146 / annurev.pp.39.060188.002355

CrossRef Полный текст | Google Scholar

Погсон Б., Макдональд К. А., Чыонг М., Бриттон Г. и Делла Пенна Д. (1996). Мутанты каротиноидов арабидопсиса демонстрируют, что лютеин не важен для фотосинтеза у высших растений. Растительная клетка 8, 1627–1639. DOI: 10.1105 / tpc.8.9.1627

PubMed Аннотация | CrossRef Полный текст | Google Scholar

Шнайдер, А., Steinberger, I., Herdean, A., Gandini, C., Eisenhut, M., Kurz, S., et al. (2016). Эволюционно консервативный белок PHOTOSYNTHESIS AFFECTED MUTANT71 необходим для эффективного захвата марганца тилакоидной мембраной у Arabidopsis. Растительная клетка 28, 892–910. DOI: 10.1105 / tpc.15.00812

PubMed Аннотация | CrossRef Полный текст | Google Scholar

Тамура К., Стечер Г., Петерсон Д., Филипски А. и Кумар С. (2013). MEGA6: анализ молекулярной эволюционной генетики, версия 6.0. Мол. Биол. Evol. 30, к2725–2729. DOI: 10.1093 / molbev / mst197

PubMed Аннотация | CrossRef Полный текст | Google Scholar

Тимперио, А. М., Д’Амичи, Г. М., Барта, К., Лорето, Ф., и Золла, Л. (2007). Протеомика, пигментный состав и организация тилакоидных мембран в железодефицитных листьях шпината. J. Exp. Бот. 58, 3695–3710. DOI: 10.1093 / jxb / erm219

PubMed Аннотация | CrossRef Полный текст | Google Scholar

Толедо-Ортис, Г., Хук, Э., и Родригес-Консепсьон, М. (2010). Прямая регуляция экспрессии генов фитоенсинтазы и биосинтеза каротиноидов с помощью факторов, взаимодействующих с фитохромом. Proc. Natl. Акад. Sci. США 107, k11626–11631. DOI: 10. 1073 / pnas.0914428107

PubMed Аннотация | CrossRef Полный текст | Google Scholar

Wang, Y. W., Chen, S. M., Wang, W. J., Huang, X.Q., Zhou, C.F., Zhuang, Z., et al. (2016). DnaJ-подобный белок домена цинкового пальца PSA2 влияет на световую акклиматизацию и развитие хлоропластов у Arabidopsis thaliana .Фронт. Plant Sci. 7: 360. DOI: 10.3389 / fpls.2016.00360

PubMed Аннотация | CrossRef Полный текст | Google Scholar

Уильямс, Д. К., Вилдунг, М. Р., Джин, А. К., Далал, Д., Оливер, Дж. С., Коутс, Р. М. и др. (2000). Гетерологичная экспрессия и характеристика «псевдоматической» формы таксадиен-синтазы, участвующей в биосинтезе паклитаксела (таксола), и оценка потенциального промежуточного продукта и ингибиторов многоступенчатой ​​реакции дитерпеновой циклизации. Arch.Biochem. Биофиз. 379, 137–146. DOI: 10.1006 / abbi.2000.1865

PubMed Аннотация | CrossRef Полный текст | Google Scholar

Ю С. Д., Чо Ю. Х. и Шин Дж. (2007). Arabidopsis Протопласты мезофилла: универсальная клеточная система для анализа временной экспрессии генов. Nat. Protoc. 2, 1565–1572. DOI: 10.1038 / nprot.2007.199

PubMed Аннотация | CrossRef Полный текст | Google Scholar

Yu, F., Fu, A., Aluru, M., Park, S., Xu, Y., Лю, Х. и др. (2007). Пестролистные мутанты и механизмы биогенеза хлоропластов. Plant Cell Environ. 30, 350–365. DOI: 10.1111 / j.1365-3040.2006.01630.x

PubMed Аннотация | CrossRef Полный текст | Google Scholar

Чжун, Л., Чжоу, В., Ван, Х., Дин, С., Лу, К., Вэнь, X., и др. (2013). Малый белок теплового шока хлоропласта HSP21 взаимодействует с белком пластидного нуклеоида pTAC5 и необходим для развития хлоропластов у Arabidopsis в условиях теплового стресса. Растительная клетка 25, 2925–2943. DOI: 10.1105 / tpc.113.111229

PubMed Аннотация | CrossRef Полный текст | Google Scholar

Zhou, F., Wang, C.Y., Gutensohn, M. , Jiang, L., Zhang, P., Zhang, D., et al. (2017). Рекрутирующий белок геранилгеранилдифосфатсинтазы контролирует метаболический поток в направлении биосинтеза хлорофилла в рисе. Proc. Natl. Акад. Sci. США 114, 6866–6871. DOI: 10.1073 / pnas.1705689114

PubMed Аннотация | CrossRef Полный текст | Google Scholar

ПЕЧЕНЬ Функции печени Обмен желчных пигментов

Презентация на тему: «ПЕЧЕНЬ Функции печени Обмен желчных пигментов» — Расшифровка презентации:

ins [data-ad-slot = «4502451947»] {display: none! important;}} @media (max-width: 800px) {# place_14> ins: not ([data-ad-slot = «4502451947»]) {display: none! important;}} @media (max-width: 800px) {# place_14 {width: 250px;}} @media (max-width: 500 пикселей) {# place_14 {width: 120px;}} ]]>

1 ПЕЧЕНЬ Функции печени Метаболизм желчных пигментов
Распад гемоглобина Нарушения метаболизма желчных пигментов Ферменты для диагностики печени

2 Функции печени Печень выполняет множество важных функций, связанных с обменом веществ, выделением различных веществ, защитой, кровообращением и свертыванием крови или влияющими на них. Метаболические функции: — Углеводный обмен (гликогенез из глюкозы и хранящейся в печени, гликогенолиз). Синтез белков (почти все белки плазмы синтезируются в печени), липопротеинов, факторов свертывания крови: V, VII, X и IX.

3 — Липидный обмен: липопротеины плазмы,
холестерин, фосфолипиды и триглицериды. Другой синтез или превращения: превращение кетокислоты в аминокислоту, производство кетоновых тел (ацетоуксусной кислоты и β-гидроксимасляной кислоты) из ацетил-КоА, a.а из глюкозы, лактата в глюкозу, синтез жирных кислот из ацетил-КоА. Функции хранения: печень является основным местом хранения гликогена, витаминов A, D и B12, железа. Экскреторные функции: печень выделяет желчь (билирубин), соли желчных кислот (холевую кислоту), некоторые красители, тяжелые металлы, ферменты и многие продукты жизнедеятельности.

4 Защитные функции: печень защищает организм
от инородных и опасных материалов за счет — фагоцитарного действия. Печень содержит множество фагоцитарных клеток, называемых клетками Купфера (удаляют инородные материалы из крови. — Детоксикация: включает этерификацию, метилирование, окисление, восстановление. Аммиак превращается в мочевину. Функции кровообращения: печень играет роль в иммунологической защите, помогает регулировать объем крови.

5 Метаболизм желчных пигментов
Билирубин Билирубин является основным пигментом желчи.Это происходит из-за распада гемоглобина. РБК живет всего 120 дней. Разрушение старых эритроцитов происходит в ретикулоэндотелиальной (RE) системе фагоцитарными клетками. Эти разрушения находятся в селезенке, печени и костном мозге.

6 Распад гемоглобина
1- Отщепление белкового глобина, который гидролизуется до а.о. Порфириновое кольцо молекулы гема разорвано. Образовавшаяся открытая цепь тетрапиррола теряет железо.Образовавшийся пигмент восстанавливается с образованием билирубина, красновато-желтого продукта жизнедеятельности, который необходимо выводить.

7 2-Билирубин покидает ретикулоэндотелиальную клетку и связывается с альбумином плазмы.
3- Билирубин-альбумин передается в клетки печени активным процессом, после чего билирубин отделяется от альбумина. 4- Этерификация (конъюгация) билирубина с диглюкуронидом билирубина (БДГ) под действием фермента глюкуронил-билирубинтрансферазы.5-БДГ (конъюгированный билирубин) растворим в воде и секретируется печенью. 6 — БДГ, с остатком желчи переходит в желчный проток. Желчь непрерывно вырабатывается печенью. 7- БДГ достигает толстой кишки и подвергается действию бактерий, ферменты которых отщепляют БДГ до уробилиногена.

8 8- Часть уробилиногена всасывается в печень и повторно выводится с желчью. Небольшая часть уробилиногена достигает периферического кровообращения и выводится почками.9- Уробилиноген в толстой кишке частично окисляется до уробилина и других коричневатых пигментов, которые выделяются с калом.

9 Нарушения метаболизма желчных пигментов
У нормального здорового взрослого человека ежедневно вырабатывается около мг билирубина. Нормальная концентрация общего билирубина в сыворотке крови колеблется в пределах мг / дл. Нормальная концентрация этерифицированного билирубина (конъюгированного) (прямого) в сыворотке может достигать 0.3 мг / дл. Когда концентрация билирубина в крови повышается, пигмент начинает откладываться в склере глаза и на коже. Эта желтоватая пигментация кожи или склеры известна как желтуха.

10 Нарушения метаболизма желчных пигментов
Большинство заболеваний печени и некоторые непеченочные нарушения сопровождаются желтухой. Чрезмерная нагрузка билирубина (гемолитические заболевания, хроническая гемолитическая анемия). Нарушение транспорта в гепатоцит.Этот транспортный дефект известен как болезнь Жильберта. Нарушение этерификации билирубина. А) физиологическая желтуха новорожденных из-за фермента трансферазы UDPG еще не полностью развита. Б) Гемолитическая болезнь новорожденных из-за несовместимости систем Rh и ABO. Врожденная недостаточность трансферазы UDPG. Известный как синдром Криглера-Наджара.

11 Нарушения обмена желчных пигментов
5) Нарушения выведения билирубина.(Холестаз), гипербилирубинемия. 6) Внутрипеченочный. Вирусный гепатит, гепатит, вызванный токсическим действием (лекарственные препараты, химические вещества, такие как фосфор, органические мышьяки, четыреххлористый углерод и хлороформ), циррозом печени, отеком печени. 7) Постпеченочный. К ним относятся все типы внепеченочного холестаза или препятствия оттоку желчи в кишечник, могут быть вызваны камнями в желчных протоках или желчном пузыре, карциномой головки поджелудочной железы или другими опухолями.

12

13 Ферменты для диагностики печени
Количество ферментов, используемых при диагностике функции печени, называется диагностическими ферментами.Щелочная фосфатаза (ЩФ). Фермент распределен во многих тканях, включая остеобласты, клетки, выстилающие синусоиды и желчные каналы. Нормальный диапазон 2o-1o5u / л. Повышение активности ЩФ связано с поражением печени, таким как карцинома, амебный абсцесс, амилоидоз, гранулематозное поражение (саркоидоз, туберкулез печени).

14 Ферменты для диагностики печени
2. Аспартатаминотрансфераза (AST) (GOT).3. Аланинаминотрансфераза (АЛТ) (ГПТ). Печень является богатым источником как ферментов GOT, так и GPT. Нормальный диапазон: GOT мужчины до 37 мкл / л женщины до 31 ед / л мужчины GPT до 40 мкл / л

15

16

17

ОБМЕН ЖЕЛТОГО ПИГМЕНТА 74 МИКРОСОМНЫМИ БЕЛКАМИ КРЫСЫ И ЧЕЛОВЕКА

Реферат

Желтый пигмент 74 (PY74) — моноазо-пигмент, который используется в желтых чернилах для тату.Метаболизм PY74 исследовали с использованием микросом печени крысы и печени человека и экспрессировали цитохромы человека P450 (P450s). Два метаболита фазы I были выделены и охарактеризованы методами масс-спектрометрии и ЯМР. Один метаболит (PY74-M1) представлял собой продукт гидроксилирования кольца PY74, 2 — ((2-метокси-4-нитрофенил) азо) — N — (2-метокси-4-гидроксифенил) -3-оксобутанамид. Второй метаболит (PY74-M2) был идентифицирован как 2 — ((2-гидрокси-4-нитрофенил) азо) — N — (2-метокси-4-гидроксифенил) -3-оксобутанамид, который представляет собой O . -деметилирование PY74-M1.Эти метаболиты были образованы in vitro инкубацией PY74 с индуцированными 3-метилхолантреном микросомами печени крысы и, в гораздо меньшей степени, микросомами печени необработанных или индуцированных фенобарбиталом крыс. Роль CYP1A в метаболизме PY74 была подтверждена с использованием экспрессированных человеческих P450. Каталитическая способность P450s для метаболизма PY74 была CYP 1A2> CYP 1A1> CYP 3A4 ≈ CYP 1B1 (отсутствие активности с CYP 2B6, 2C9, 2D6 или 2E1). Метаболизм PY74-M1 в PY74-M2 катализируется только CYP 1A2 и CYP 1A1 (отсутствие активности со стороны CYP 1B1, 2B6, 2C9, 2D6, 2E1 или 3A4).Эти результаты демонстрируют, что пигмент татуировки PY74 метаболизируется in vitro с помощью P450 до метаболитов, которые должны быть доступны для метаболизма и выведения фазы II.

Сноски

• Содержание этой рукописи не обязательно отражает взгляды или политику Управления по санитарному надзору за качеством пищевых продуктов и медикаментов США, а также упоминание торговых наименований или коммерческих продуктов не является одобрением или рекомендацией для использования. Y. Cui был поддержан назначением в Программу исследований дочерних университетов Ок-Ридж в Национальном центре токсикологических исследований, проводимую в рамках межведомственного соглашения между U.S. Министерство энергетики и Управление по санитарному надзору за качеством пищевых продуктов и медикаментов США. Признается финансовая поддержка со стороны Управления безопасности пищевых добавок, Центра безопасности пищевых продуктов и прикладного питания (CFSAN), Управления по санитарному надзору за качеством пищевых продуктов и медикаментов США. Центр фототоксикологии NTP частично поддерживается Межведомственным соглашением (IAG 224-93-0001) между Управлением по санитарному надзору за качеством пищевых продуктов и медикаментов США и Национальным институтом гигиены окружающей среды США.

• Информацию о статье, дате публикации и цитировании можно найти по адресу http: // dmd.aspetjournals.org.

• DOI: 10.1124 / dmd.104.003285.

• СОКРАЩЕНИЯ: PY74, желтый пигмент 74; PY74-M1, метаболит 1 PY74; PY74-M2, метаболит 2 PY74; БСА, бычий сывороточный альбумин; 3-MC, 3-метилхолантрен; ВЭЖХ, высокоэффективная жидкостная хроматография; P450, цитохром P450; ПБ, фенобарбитал; МС, масс-спектрометрия; APCI, химическая ионизация при атмосферном давлении; FDA, Управление по санитарному надзору за качеством пищевых продуктов и медикаментов.

• • Поступила 10.12.2004 г.
  • Принято 8 июля 2005 г.

• Американское общество фармакологии и экспериментальной терапии

процесс метаболизма пигмента | SGD

Аннотации

---

Отобран вручную

Увеличьте общее количество строк, отображаемых на этой странице, используя раскрывающийся список, расположенный под таблицей, или используйте страницу прокрутите в правом верхнем углу таблицы, чтобы просмотреть страницы таблицы; используйте стрелки справа от заголовка столбца отсортировать по этому столбцу; отфильтруйте таблицу, используя поле «Фильтр» в верхней части таблицы.

Джин	Квалификация	Термин генной онтологии	Аспект	Расширение аннотации	Доказательства	Метод	Источник	Назначено	Номер ссылки

Высокая пропускная способность

Увеличьте общее количество строк, отображаемых на этой странице, используя раскрывающийся список, расположенный под таблицей, или используйте страницу прокрутите в правом верхнем углу таблицы, чтобы просмотреть страницы таблицы; используйте стрелки справа от заголовка столбца отсортировать по этому столбцу; отфильтруйте таблицу, используя поле «Фильтр» в верхней части таблицы.

Джин	Квалификация	Термин генной онтологии	Аспект	Расширение аннотации	Доказательства	Метод	Источник	Назначено	Номер ссылки

Вычислительный

Увеличьте общее количество строк, отображаемых на этой странице, используя раскрывающийся список, расположенный под таблицей, или используйте страницу прокрутите в правом верхнем углу таблицы, чтобы просмотреть страницы таблицы; используйте стрелки справа от заголовка столбца отсортировать по этому столбцу; отфильтруйте таблицу, используя поле «Фильтр» в верхней части таблицы.

Джин	Квалификация	Термин генной онтологии	Аспект	Расширение аннотации	Доказательства	Метод	Источник	Назначено	Номер ссылки

.

No related posts.