Пролиферативное воспаление патанатомия: Патологическая анатомия (ВОСПАЛЕНИЕ 3) реферат по биологии

Содержание

Патологическая анатомия (ВОСПАЛЕНИЕ 3) реферат по биологии

Патологическая анатомия. Воспаление (часть 3). Продуктивное (пролиферативное воспаление). При этом воспалении преобладает фаза пролиферации. Причины разнообразны — те же биологические, физические и химические факторы, что и при других типах воспаления. Одним из основных условий возникновения пролиферативного воспаления является устойчивость повреждающих факторов во внутренних средах организма, способность персистировать в тканях. Повреждающие факторы могут быть представлены сами по себе инертными веществами кристаллической природы, частицами дерева, которые попадают, чаще всего при травмах, при вдыхании внутрь организма. Они плоо поддаются уборке, так как практически нерастворимы в воде. С другой стороны биологические повреждающие факторы могут обладать защитными системами, свойствами — например, капсулами, не поддающимся разрушению (микобактерии туберкулеза). Защиту могут обеспечивать и модные ферменты патогенности которыми обладают возбудители (гемолитический стрептококк, токсины которого весьма успешно разрушают защитные клетки организма, сохраняя себе жизнь).

Может сложиться ситуация, когда организм проитв каких-то факторов обладает несовершенный защитой ( при слабом иммунно ответе). Это слабый иммунный ответ может быть запрограмирован природой в процессе эволюции либо это какие-либо генетические ошибки кодирования системы определяющих иммунный ответ ( так называемая система HLA). Если у человека преобладают анитела главного комплекса гистосовместимости HLA относящиеся к классу Д, то часто не некоторых возбудителей развивается недостаточный , слабый иммунный ответ). Особенности пролиферативного воспаления. 1. Хроническое волнообразное течение. 2. Локалзиация преимущественно в соединительных тканях и в тканях , клетки которых сохранили способность к пролиферации — это эпителий кожи, кишки. В морфологическом плане наиболее характерной особенностью является образование грануляционной ткаи. Грануляционная тань — это молодая, незрелая, растущация соединительная ткань. Ее существование определяется классическими биологическими свойствами. Рост и функция ткани — процессы антагонистические.
Если ткань хорошо функционирует , то она плохо растет , и наоборот. В состав грануляционной ткани входях обязательные и необязательные элементы. К обязательным относятся сосуды, которые обеспечивают трофику, мкрофаги — главная задача которых — уборка, расчистка места повреждения, и основные строители — клетки соединительной ткани — фибробласты. Сосуды растут перпендикулярно месту повреждения ( это капилляры), и образуют своеобразные коленца. Коленца слегка выступают на поверхность. Пространство между сосудистыми коленцами заполнено основным веществом соединительной ткани, которое вырабатывается фибробластами. Макроскопическая характеристика. Грануляционная ткань красная, с блестящей зернистой поверхностью и легко кровоточит. Основное вещество полупрозрачное, поэтому сквозь него просвечивают наполненные кровью капилляры — поэтому ткань красная. Ткань ернистая так как коленца приподнимают основное вещество. Кровоточит ткаь потому, что является механически непрочной, малейшая травма , наложение повязки может привести к повреждению эпителия коленец и кровь может выходить из этих мелких сосудов — появляютс якапльки крови.
Марофаги расчищают место повреждения , со временем их количество уменьшается. По мере заполнения дефектов количество сосудов тоже уменьшается, а оставшиеся будут дифференцироваться в артериолы и венуля. Фибробласты, которые вырабатывали основное вещество, приступают к синтезу коллагена. Они превращаются в фиброциты и тоже исчезают. То есть количество всех обязательных компонентов уменьшается, а увеличиваетсяк оличество коллагена. На месте дефекта формируется соединительнотканый рубец, то есть ткань созревает. Разновидности продуктивного воспаления: 1. Межуточное или интерстициальное. 2. Гранулематозное. 3. Продуктивное воспаление вокруг животных — паразитов. 4. Гипертрофические разрастания. Межуточное воспаление обычно развивается в строме паренхиматозных органов. Иметот диффузный характер. Может встречаться в интерстиции легих, миокарда, печени, почек. Исход такого воспаления — диффузный склероз. При этом орган может деформироваться, например в исходе хронических гепатитов формируется цирроз печени.
В почках — нефросклероз. Если деформация в почках, легких резко выражена то говорят о циррозе почек, легкого. Функция органов при диффузных склерозах резко ухудшается. Это хроническая сердечная недостаточность, печеночная , почечная недостаточность. Гранулематозное воспаление — это очаговое продуктивное воспаление, при котором ткань образует очаги из клеток, способных к фагоцитозу. Такие очаги получили нзвание гранулем. Гранулематозное воспаление встречается при заболеваниях человека очень часто: при ревматизме, туберкулезе, профессиональных заболеваниях — при запылении легких различными минеральными и др веществами . мароскопическая картина. Гранулема имеет небольшие размеры, ее диаметр 1-2 мм, то есть она едва различима невооруженным глазом. Микроскопическое строение гранулемы завист от фазы дифференцировки фагоцитирующих клеток. Предшественником фагоцитов является моноцит ( клетка костномозгового происхождения). Моноцит в очагах поражения дифференцируется в макрофаг, который может трансформироваться в эпителиоидную клетку, она , в свою очередь , может трансформироваться в гигантскую многоядерную клетку.
Различают 2 типа многоядерных клеток: 1. Гигантская клетка инородных тел. В ней многочисленные ядра лежат бессистемно. 2. Гигантская многоядерная клетка Пирогова — Лангханса. Многочисленные ядра лежат частоколом у клеточной мембраны, образуя своеобразную подковку. Все эти клетки сохраняют способность к фагоцитозу в разной степени, она по мере трансформации утрачивается. Трансформация макрофагов в эпителиоидные клетки и клетки Пирогова-Лангханса обычно происходит под действием стимулов иммунной природы. Исход таких гранулем чаще всего рубцевание. Рубец образуется маленький, но поскольку заболевание протекает хронически, как ревматизм, например, с каждой новой атакой количество рубцов возрастает, отсюда повышается степень склероза, с каждой атакой все больше нарушается функция ( например, сократительная способность миокарда). В редких случаях гранулемы могут подвергается некрозу. Некроз обозначает неблагоприятное течение заболевания. Продуктивное воспаление вокруг животных — паразитов. Паразиты — это эхинококк, трихинеллы, цистицерк и др.
Вокруг этих паразитов , обладающих капсулой разрастается грануляционная ткань, богатая макрофагами и гигантскими клетками инородных тел. Исход — склероз, рубцевание и с образованием фиброзной капсулы вокруг паразита. Организм не в состоянии разрушить паразита и пытается отгородиться от него. Гипертрофические разрастания — это полипы и кондилломы. Эти образования возникают при хроническом воспалении, в котором участвуют соединительная ткань и эпителий. Полипы наиболее часто образуются в слизистой оболочке толстой кишки , в желудке, в носовой полости, а кондилломы — на коже, вблизи отверстий — анального, половых путей. И те и другие очень похожи на опухоль, но к ним не относятся, хотя трансформация полипов и кондилом в опухоль сначала доброкачественную, затем в злокачественную может быть. Отличаются гипертрофические образования от опухоелй наличием

Межуточное (интерстициальное) воспаление

Пользователи также искали:

альтеративное воспаление, гранулематозное воспаление патанатомия, межуточное продуктивное воспаление характерно для, межуточное воспаление патанатомия, продуктивное воспаление вокруг животных паразитов, пролиферативное гранулематозное воспаление, пролиферативное воспаление патанатомия, пролиферативное воспаление виды, воспаление, патанатомия, Межуточное, межуточное, гранулематозное, продуктивное, пролиферативное, пролиферативное гранулематозное воспаление, гранулематозное воспаление патанатомия, межуточное воспаление патанатомия, альтеративное воспаление, интерстициальное, виды, вокруг, животных, паразитов, характерно, альтеративное, пролиферативное воспаление виды, пролиферативное воспаление патанатомия, Межуточное интерстициальное воспаление, продуктивное воспаление вокруг животных паразитов, межуточное продуктивное воспаление характерно для, межуточное (интерстициальное) воспаление,

Патологическая анатомия — Катаральное, геморрагическое, гнилостное, смешанное и пролиферативное воспаления

Катаральное, геморрагическое, гнилостное, смешанное и пролиферативное воспаления

Катаральное воспаление – к экссудату примешивается слизь. Происходит стекание экссудата с воспаленной поверхности. Типовая локализация – слизистые оболочки. Исход катарального воспаления – полное восстановление слизистой.

Геморрагическое воспаление характеризуется примесью эритроцитов к экссудату. Экссудат становится красного цвета, затем по мере разрушения пигментов приобретает черный цвет. Характерно при вирусных инфекциях, таких как грипп, корь, натуральная (черная) оспа, при эндогенных интоксикациях, – например интоксикация азотистыми шлаками при хронической почечной недостаточности.

Гнилостное (гангренозное) воспаление возникает вследствие присоединения к очагам воспаления гнилостной флоры, прежде всего фузоспирохетозной. Чаще встречается в органах, которые имеют связьс внешней средой: гнилостные гангрены легкого, конечностей, кишечника и т. д. Распадающиеся ткани тусклые, со зловонным специфическим запахом.

Смешанное воспаление. О нем говорят, когда имеет место сочетание воспалений (серозно-гной-ное, серозно-фибринозное, гнойно-геморрагическое или фибринозно-геморрагическое).

Продуктивное (пролиферативное воспаление) – преобладает фаза пролиферации, в результате чего образуются очаговые или диффузные клеточные инфильтраты, которые могут быть полиморфно-клеточными, лимфоцитарно-клеточными, макрофагальными, плазмоклеточными, гигантоклеточными и эпителиоидно-клеточными. Одним из основных условий развития пролиферативного воспаления является относительная устойчивость повреждающих факторов во внутренних средах организма, возможность персистировать в тканях.

Особенности пролиферативного воспаления:

1) хроническое волнообразное течение;

2) локализация преимущественно в соединительных тканях, а также в тканях, клетки которых обладают способностью к пролиферации – эпителий кожи, кишки.

В морфологии наиболее характерной особенностью является образование грануляционной ткани. Грануляционная ткань – это молодая, незрелая, растущая соединительная ткань. Ее формирование определяется классическими биологическими свойствами. Рост и функционирование ткани – процессы антагонистические. Если ткань начинает хорошо функционировать, то ее рост замедляется, и наоборот.

Разновидности продуктивного воспаления:

1) межуточное, или интерстициальное;

2) грануломатозное;

3) продуктивное воспаление вокруг животных-паразитов;

4) гипертрофические разрастания.

Межуточное воспаление обычно развивается в стро-ме паренхиматозных органов; имеет диффузный характер. Может встречаться в интерстиции легких, миокарда, печени, почек.

Исход данного воспаления – диффузный склероз. Функция органов при диффузных склерозах резко ухудшается.


Патологическая анатомия (ВОСПАЛЕНИЕ 3) (Реферат)

Патологическая анатомия.

Воспаление (часть 3).

Продуктивное (пролиферативное воспаление). При этом воспалении преобладает фаза пролиферации.

Причины разнообразны — те же биологические, физические и химические факторы, что и при других типах воспаления. Одним из основных условий возникновения пролиферативного воспаления является устойчивость повреждающих факторов во внутренних средах организма, способность персистировать в тканях. Повреждающие факторы могут быть представлены сами по себе инертными веществами кристаллической природы, частицами дерева, которые попадают, чаще всего при травмах, при вдыхании внутрь организма. Они плоо поддаются уборке, так как практически нерастворимы в воде. С другой стороны биологические повреждающие факторы могут обладать защитными системами, свойствами — например, капсулами, не поддающимся разрушению (микобактерии туберкулеза). Защиту могут обеспечивать и модные ферменты патогенности которыми обладают возбудители (гемолитический стрептококк, токсины которого весьма успешно разрушают защитные клетки организма, сохраняя себе жизнь). Может сложиться ситуация, когда организм проитв каких-то факторов обладает несовершенный защитой ( при слабом иммунно ответе). Это слабый иммунный ответ может быть запрограмирован природой в процессе эволюции либо это какие-либо генетические ошибки кодирования системы определяющих иммунный ответ ( так называемая система HLA). Если у человека преобладают анитела главного комплекса гистосовместимости HLA относящиеся к классу Д, то часто не некоторых возбудителей развивается недостаточный , слабый иммунный ответ).

Особенности пролиферативного воспаления.

1. Хроническое волнообразное течение.

2. Локалзиация преимущественно в соединительных тканях и в тканях , клетки которых сохранили способность к пролиферации — это эпителий кожи, кишки. В морфологическом плане наиболее характерной особенностью является образование грануляционной ткаи. Грануляционная тань — это молодая, незрелая, растущация соединительная ткань. Ее существование определяется классическими биологическими свойствами. Рост и функция ткани — процессы антагонистические. Если ткань хорошо функционирует , то она плохо растет , и наоборот.

В состав грануляционной ткани входях обязательные и необязательные элементы. К обязательным относятся сосуды, которые обеспечивают трофику, мкрофаги — главная задача которых — уборка, расчистка места повреждения, и основные строители — клетки соединительной ткани — фибробласты. Сосуды растут перпендикулярно месту повреждения ( это капилляры), и образуют своеобразные коленца. Коленца слегка выступают на поверхность. Пространство между сосудистыми коленцами заполнено основным веществом соединительной ткани, которое вырабатывается фибробластами.

Макроскопическая характеристика. Грануляционная ткань красная, с блестящей зернистой поверхностью и легко кровоточит. Основное вещество полупрозрачное, поэтому сквозь него просвечивают наполненные кровью капилляры — поэтому ткань красная. Ткань ернистая так как коленца приподнимают основное вещество. Кровоточит ткаь потому, что является механически непрочной, малейшая травма , наложение повязки может привести к повреждению эпителия коленец и кровь может выходить из этих мелких сосудов — появляютс якапльки крови.

Марофаги расчищают место повреждения , со временем их количество уменьшается. По мере заполнения дефектов количество сосудов тоже уменьшается, а оставшиеся будут дифференцироваться в артериолы и венуля. Фибробласты, которые вырабатывали основное вещество, приступают к синтезу коллагена. Они превращаются в фиброциты и тоже исчезают. То есть количество всех обязательных компонентов уменьшается, а увеличиваетсяк оличество коллагена. На месте дефекта формируется соединительнотканый рубец, то есть ткань созревает.

Разновидности продуктивного воспаления:

1. Межуточное или интерстициальное.

2. Гранулематозное.

3. Продуктивное воспаление вокруг животных — паразитов.

4. Гипертрофические разрастания.

Межуточное воспаление обычно развивается в строме паренхиматозных органов. Иметот диффузный характер. Может встречаться в интерстиции легих, миокарда, печени, почек. Исход такого воспаления — диффузный склероз. При этом орган может деформироваться, например в исходе хронических гепатитов формируется цирроз печени. В почках — нефросклероз. Если деформация в почках, легких резко выражена то говорят о циррозе почек, легкого. Функция органов при диффузных склерозах резко ухудшается. Это хроническая сердечная недостаточность, печеночная , почечная недостаточность.

Гранулематозное воспаление — это очаговое продуктивное воспаление, при котором ткань образует очаги из клеток, способных к фагоцитозу. Такие очаги получили нзвание гранулем. Гранулематозное воспаление встречается при заболеваниях человека очень часто: при ревматизме, туберкулезе, профессиональных заболеваниях — при запылении легких различными минеральными и др веществами .

мароскопическая картина. Гранулема имеет небольшие размеры, ее диаметр 1-2 мм, то есть она едва различима невооруженным глазом.

Микроскопическое строение гранулемы завист от фазы дифференцировки фагоцитирующих клеток. Предшественником фагоцитов является моноцит ( клетка костномозгового происхождения). Моноцит в очагах поражения дифференцируется в макрофаг, который может трансформироваться в эпителиоидную клетку, она , в свою очередь , может трансформироваться в гигантскую многоядерную клетку. Различают 2 типа многоядерных клеток:

1. Гигантская клетка инородных тел. В ней многочисленные ядра лежат бессистемно.

2. Гигантская многоядерная клетка Пирогова — Лангханса.

Многочисленные ядра лежат частоколом у клеточной мембраны, образуя своеобразную подковку. Все эти клетки сохраняют способность к фагоцитозу в разной степени, она по мере трансформации утрачивается. Трансформация макрофагов в эпителиоидные клетки и клетки Пирогова-Лангханса обычно происходит под действием стимулов иммунной природы.

Исход таких гранулем чаще всего рубцевание. Рубец образуется маленький, но поскольку заболевание протекает хронически, как ревматизм, например, с каждой новой атакой количество рубцов возрастает, отсюда повышается степень склероза, с каждой атакой все больше нарушается функция ( например, сократительная способность миокарда). В редких случаях гранулемы могут подвергается некрозу. Некроз обозначает неблагоприятное течение заболевания.

Продуктивное воспаление вокруг животных — паразитов.

Паразиты — это эхинококк, трихинеллы, цистицерк и др. Вокруг этих паразитов , обладающих капсулой разрастается грануляционная ткань, богатая макрофагами и гигантскими клетками инородных тел. Исход — склероз, рубцевание и с образованием фиброзной капсулы вокруг паразита. Организм не в состоянии разрушить паразита и пытается отгородиться от него.

Гипертрофические разрастания — это полипы и кондилломы. Эти образования возникают при хроническом воспалении, в котором участвуют соединительная ткань и эпителий. Полипы наиболее часто образуются в слизистой оболочке толстой кишки , в желудке, в носовой полости, а кондилломы — на коже, вблизи отверстий — анального, половых путей. И те и другие очень похожи на опухоль, но к ним не относятся, хотя трансформация полипов и кондилом в опухоль сначала доброкачественную, затем в злокачественную может быть. Отличаются гипертрофические образования от опухоелй наличием воспалительной инфильтрации в их строме. Гипертрофические образования удаляют хирургическим путем, важно лечение основного заболевания.

Специфическое воспаление. Специфическим называется особый вариант продуктивного грануляматозного воспаления который вызывают особые возбудители, и коорый развивается на иммунной основе. К специфическим возбудителям относятся микобактерии туберкулеза, бледная трепонема, грибы — актиномицеты, микобактерии лепры, возбудители риносклеромы.

Особенности специфического воспаления:

  1. хроническое волнообразное течение без склонности к самоизлечению.

  2. Способность возбудителей вызывать все 3 типы воспалений в зависимости от состояния реактивности организма.

  3. Смена воспалительных тканевый реакций, обусловленная изменением иммунологической реактивности организма.

  4. В морфологическом плане — воспаление характеризуется образованием специфических гранулем, имеющих характерное строение в зависимости от возбудителя.

  5. Склонность специфических гранулем к некрозу.

Воспаление при туберкулезе. Микобактерия туберкулеза может вызвать альтеративное, экссудативное, пролиферативное воспаление. Альтеративное воспаление возникает чаще всего при гипоергии, обусловленной ослаблением защитных сил организма. Морфологическое появление — казеозный некроз. Экссудативное воспаление обычно развивается в условиях гиперергии — сенсибилизации к антигенам, токсинам микобактерий. Микобактерия , попав в организм способная там долго персистировать

в связи с чем развивается сенсибилизация. Морфология: локализуются очаги в любых органах и тканях. Сначала в очагах скапливается серозный, фибринозный или смешанный экссудат, затем очаги подвергаются казеозному некрозу. Если заболевание распознано до казеозного некроза, то лечение может привести к рассасыванию экссудата.

Продуктивное воспаление развивается в условиях специфического туберкулезного нестерильного иммунитет. Морфологическим проявленим будет образование специфических туберкулезных граунелм. Макроскопическая картина: гранулема имет диаметр 1-2 мм ( “просяное зерно”). Такое бугорок называется милиарным бугорком. Микроскопическая картина: такой бугорок состоит из эпителиоидных клеток. Поэтому бугорки называют эпителиоидными. Кроме того в бугорки входят гигантские клетки Пирогова — Лангханса. По периферии гранулемы обычно располагаются многочисленные лимфоциты. В иммунологическом плане такие гранулемы отражают гиперчувствительность замедленного типа.

Исход: чаще всего казеозный некроз. Обычно в центре гранулемы — небольшой очажок некроза.

Макроскопическая классификация очагов туберкулезного воспаления. Все очаги делятся на 2 группы:

1. Милиарные.

2. Крупные ( все, что крупнее милиарных).

Милиарные очаги чаще всего продуктивные, но могут быть альтеративными, экуссудативными. Из крупных очагов — различают: 1. Ацинозный. Макроскопически он похож на трилистник. Состоит из трех слипшихся милиарных очагов. Может быть также продуктивным, альтеративным. 2. Казеозный очаг — по размерам он напоминает тутовую ягоду или ягоду малины. Цвет черный. Воспаление практически всегда продуктивное, соединительно ткань адсорбирует пигменты. 3. Дольковый. 4. Сегментарный. 5. Долевой очаги.

Эти очаги экссудативные.

Исходы — рубцевание, реже некроз. У экссудитвных очагов — инкапсуляция, петрификация, оссификация. Для крупных очагов характерно развитие вторичной колликвации разжижение плотных масс. Жидкие массы могут опорожняться наружу и на месте этих очагов остаются полости — каверны.

Воспаление при сифилисе. Различают первичный, вторичный, третичный сифились первичный сифилис — воспаление обычно экссудативное, так как обусловлено гиперергическими реакциями. Морфологическим проявленим является твердый шанкр в месте внедрения спирохеты — язва с блестящим дном и плотными краями. Плотность определяется массивным воспалительным клеточным инфильтратом ( из макрофагов, лимфоцитов, фибробластов). Обычно шанкр рубцуется.

Вторичный сифилис — протекает от нескольких месяцев до нескольких лет и характеризуется неустойчивым состоянием перестройки иммунной системы. В основе лежит также гиперергическая реакция, поэтому воспаление бывает экссудативным. Наблюдается спирихетемия. Вторичный сифилис протекает с рецидивами , которые характеризуются высыпаниями на коже — экзантемой и на слизистых оболочках энантемой, котоыре беследной, без рубцеваия исчезают. С каждым рецидивом развивается специфические иммунные реакции, поэтому количество высыпаний уменьшается.

Воспаление становится продуктивным в 3 фазе заболевания — третичный сифилис. Образуются специфические сифилитические гранулемы — гуммы. Макроскопически в центре гуммы находятся очаг клеевидного некроза, вокурго него грануляционная ткань с бльшим количеством сосудов и клеток — макрофагов, лимфоцитов, плазматических, по периферии грануляционная ткань созревает в рубцовую. Локализация — повсеместно — кишечник, кости и др. Исход гумм — рубцевание с обезображиванием (грубой деформацией органа). Второй вариант продуктивного воспаления при третичном сифилисе — межуточное (интерстициальное) воспаление. Оно часто локализуется в печени и в аорте — сифилитический аортит ( в восходящий части дуги аорты). Макроскопически интима аорты напоминает шагреневую ( тонко выделанную) кожу. Микроскопически в медии и адвентиции видна диффузная гуммозная инфильтрация, а при дифференциальных методах окраски — разрушение эластического каркаса аорты. Исход — локальное расширение — аневризма аорты, которое может разорваться, может также образоваться тромб.

Сравнительная характеристика гуммы и эпителиоидного бугорка ( то есть туберкулеза и сифилиса).

Морфологические элементы

эпителиоидный бугорок

сифилитическая гумма

некроз

казеозный

клеевидный

эпителиоидные клетки

+++

+/-

гигантские клетки Пирогова-Лангханса

++

+/-

лимфоциты

преобладают Т-лимфоциты

преобладают В-лимфоциты

макрофаги

+

фибробласты

+

сосуды

+

актиномикоз — заболевание , вызываемое лучистыми грибами актиномицетами, которые в различных органах образуют скопления — друзы. Макроскопическая картина — видны опухолевидные плотные очаги, напоминающие пчелиные соты. Микроскопическая картина — в центре очага находится друза актиномицета, вокруг нее — грануляционная ткань, рубцовая, соединительная ткань. Исходы. При хроническом течении может развиться вторичный амилоидоз, образование свищей, разъедание сосудов.

Диагностика и лечение теносиновитов кисти и предплечья | Коршунов В.Ф., Романов С.Ю., Лазарева В.В.

Статья посвящена вопросам диагностики и лечения теносиновитов кисти и предплечья

    Воспалительные заболевания синовиальных оболочек сухожилий верхней конечности являются одной из малоизученных проблем, несмотря на широкое распространение данной патологии. Прежде всего, необходимо различать близкие по названию и проявлениям нозологические формы: 
• тендинит − воспаление ткани сухожилия;
• теносиновит – воспаление сухожилия и его синовиальных оболочек;
• тендовагинит – воспаление только оболочек сухожилия, в т. ч. синовиальных влагалищ, чаще всего речь идет о гнойном процессе;
• перитендинит – вовлечение оболочек вне синовиальных влагалищ;
• паратендинит – вовлечение окружающей рыхлой соединительной ткани.
    В этой статье мы будем говорить в первую очередь об особенностях диагностики и лечения теносиновитов. В Международной классификации болезней 10-го пересмотра данные заболевания относятся к классу ХIII: Болезни костно-мышечной системы и соединительной ткани, Блок М65-М68: Поражения синовиальных оболочек и сухожилий. 
    По статистике, среди всех заболеваний кисти теносиновиты встречаются в 0,02% случаев, среди дегенеративно-дистрофических – в 12% случаев [1–9].
    По этиологическому фактору теносиновиты делятся на асептические и инфекционные, среди которых выделяют специфические и неспецифические. К факторам риска возникновения асептических теносиновитов относятся профессиональные нагрузки (у музыкантов, программистов, спортсменов) [10] и системные заболевания (ревматоидный артрит, болезнь Бехтерева, окуло-уретро-синовиальный синдром, коллагенозы). Специфические инфекционные теносиновиты могут вызываться возбудителями иерсиниоза, бруцеллеза, псевдотуберкулеза, туберкулеза [3, 4]. В связи с этим исследование крови пациентов на наличие антител к перечисленным инфекциям и ревмопробы являются обязательными. По характеру экссудата различают серозные, серозно-фибринозные, геморрагические и гнойные теносиновиты. Схематически сухожилия сгибателей и разгибателей пальцев кисти с синовиальными влагалищами представлены на рисунке 1.

    Особую сложность при хирургическом лечении представляют теносиновиты сухожилий сгибателей пальцев в связи с наличием большого количества анатомически значимых структур ладонной поверхности кисти и предплечья. Также необходимо помнить о «запретной зоне» [11] срединного нерва – месте отхождения его двигательной ветви (рис. 2).

    Дифференциальная диагностика основывалась на клинических данных, результатах магнитно-резонансной томографии и ультрасонографии [12, 13], термографии и радионуклидных исследований. Внешний вид кисти при теносиновите сухожилий сгибателей II пальца и разгибателей пальцев представлен на рисунках 3 и 4 соответственно.

    При ультразвуковом исследовании можно обнаружить изменение синовиальных оболочек и жидкостный компонент (рис. 5).

    Аналогичные изменения выявляются при МРТ Т1- и Т2-взвешенном изображении (рис. 6).

    Тактика лечения целиком зависит от правильно поставленного диагноза. Неверный метод оперативного вмешательства или медикаментозной терапии ведет к рецидиву заболевания. При выявлении антител к различным инфекциям или признаков активности ревматического процесса показано первоочередное лечение основного заболевания. В этом случае больные направляются в специализированные инфекционные или ревматологические лечебные учреждения. 
    В начальной, острой стадии заболевания, особенно при экссудативном характере воспалительного процесса, проводится консервативное лечение. Оно заключается в иммобилизации пальцев и кисти гипсовыми повязками, ортезами или шинами. Одновременно назначаются нестероидные противовоспалительные препараты (НПВП), уменьшающие отек, экссудацию и купирующие болевую симптоматику. Среди НПВП предпочтение отдается лекарственным средствам с гастропротективным действием, например амтолметин гуацилу (Найзилат). Рекомендуемая доза препарата составляет 600 мг 2 раза в сутки и может быть снижена до 600 мг/сут за 1 прием. Для сохранения гастропротективного действия Найзилат следует принимать на голодный желудок. Продолжительность лечения – 5−7 дней.
    После купирования острой стадии показаны физиотерапевтические процедуры. Применяются фоно- и электрофорезы с кортикостероидами (гидрокортизон), магнито- и лазеротерапия, грязевые или парафиновые (озокеритовые) аппликации. Курс консервативного лечения составляет 1 мес. 
    При отсутствии положительного эффекта от консервативного лечения, а также в случае пролиферативного воспаления и нарушения функции пальцев показано оперативное лечение. Основным хирургическим методом является синовэктомия. При теносиновитах наиболее важно тщательное иссечение всех патологически измененных оболочек сухожилий. Кроме того, согласно принципам абластики показана обработка тканей спиртовыми растворами антисептиков. В случае обширного спаечного процесса в области сухожильных оболочек производится тенолиз, а при творожистом некрозе – пластика сухожилий. Интраоперационный материал обязательно отправляется на гистологическое исследование. Оперативные доступы стандартны для операций на кисти (рис. 7). Разрезы производятся параллельно кожным складкам ладонной поверхности кисти и пальцев и S-образно – на тыльной поверхности [4, 6, 14, 15].

    Этапы операции представлены на рис. 8 и 9.
    Во время операции необходимо сохранять элементы скользящего аппарата сухожилий, в т. ч. кольцевидные связки (см. рис. 9). 
    При соблюдении указанных условий мы получим восстановление функции пальцев в ближайшей и отдаленной перспективе (рис. 10).

    В послеоперационном периоде применяется иммобилизация кисти и пальцев сроком на 3 нед., лечебная гимнастика для интактных суставов [4]. В плане дифференциальной диагностики мы столкнулись с такими доброкачественными опухолями, как липома, фибролипома, нейрофиброма, гемангиома, ангиолейомиома, а также злокачественными новообразованиями: эккринной акроспиромой, липосаркомой и синовиальной саркомой [9, 10, 16−18] (рис. 11-15).



Рис. 15. Липосаркома

    Хорошие отдаленные результаты лечения достигнуты нами в 95% случаев, у 3% пациентов отмечен рецидив заболевания, в оставшихся 2% наблюдался переход патологического процесса на ранее интактные сухожилия и их оболочки.
    Таким образом, разработанный в нашей клинике алгоритм обследования обеспечивает правильную постановку диагноза, а применяемые консервативное, физиотерапевтическое лечение и различные виды оперативных вмешательств позволяют добиться надежных положительных результатов лечения пациентов с заболеваниями данной нозологической группы.

.

Порекомендуйте статью вашим коллегам

Хроническое воспаление — StatPearls — Книжная полка NCBI

Непрерывное обучение

Хроническое воспаление также называют медленным, длительным воспалением, продолжающимся от нескольких месяцев до нескольких лет. Как правило, степень и последствия хронического воспаления зависят от причины травмы и способности организма восстанавливать и преодолевать повреждения. Это упражнение рассматривает патофизиологию хронического воспаления и подчеркивает роль межпрофессиональной группы в принятии мер по контролю патологии.

Цели:

  • Определить этиологию хронического воспаления.

  • Обобщите патофизиологию хронического воспаления.

  • Опишите доступные варианты лечения и ведения хронического воспаления.

  • Объясните стратегии межпрофессиональной команды для улучшения координации оказания помощи и коммуникации для улучшения контроля хронического воспаления и улучшения результатов.

Заработайте кредиты на непрерывное образование (CME / CE) по этой теме.

Введение

Воспаление является частью защитного механизма организма. Это процесс, с помощью которого иммунная система распознает и удаляет вредные и посторонние раздражители и начинает процесс заживления. Воспаление может быть острым или хроническим. [1] [2] [3]

Острое воспаление

Повреждение тканей в результате травмы, микробной инвазии или вредных соединений может вызвать острое воспаление. Он начинается быстро, быстро становится тяжелым, а симптомы могут длиться несколько дней, например целлюлит или острая пневмония.Подострое воспаление — это период между острым и хроническим воспалением, который может длиться от 2 до 6 недель.

Хроническое воспаление

Хроническое воспаление также называют медленным, длительным воспалением, продолжающимся в течение длительных периодов от нескольких месяцев до нескольких лет. Как правило, степень и последствия хронического воспаления зависят от причины травмы и способности организма восстанавливать и преодолевать повреждения. В этой статье рассматривается хроническое воспаление.

Этиология

Хроническое воспаление может быть следствием следующих причин:

  1. Неспособность устранить агент, вызывающий острое воспаление, например, инфекционные организмы, включая Mycobacterium tuberculosis , простейшие, грибы и других паразитов, которые могут сопротивляться защитным силам хозяина и оставаться в ткани в течение длительного периода.

  2. Воздействие небольшого количества определенного раздражителя или инородного материала, который не может быть устранен путем ферментативного расщепления или фагоцитоза в организме, включая вещества или промышленные химические вещества, которые можно вдыхать в течение длительного периода, например, кремнеземная пыль.

  3. Аутоиммунное заболевание, при котором иммунная система распознает нормальный компонент тела как чужеродный антиген и атакует здоровые ткани, вызывая такие заболевания, как ревматоидный артрит (РА), системная красная волчанка (СКВ).

  4. Дефект клеток, ответственных за опосредование воспаления, приводящий к стойкому или рецидивирующему воспалению, например, аутовоспалительным расстройствам (семейная средиземноморская лихорадка).

  5. Рецидивирующие эпизоды острого воспаления. Однако в некоторых случаях хроническое воспаление является независимой реакцией, а не следствием острого воспаления, например таких заболеваний, как туберкулез и ревматоидный артрит.

  6. Воспалительные и биохимические индукторы вызывают окислительный стресс и дисфункцию митохондрий, такие как повышенное производство молекул свободных радикалов, конечных продуктов гликирования (AGE), кристаллов мочевой кислоты (урата), окисленных липопротеинов, гомоцистеина и других.

Эпидемиология

Хронические воспалительные заболевания являются самой значительной причиной смерти в мире. Всемирная организация здравоохранения (ВОЗ) считает хронические заболевания величайшей угрозой для здоровья человека. Ожидается, что распространенность заболеваний, связанных с хроническим воспалением, будет неуклонно расти в течение следующих 30 лет в Соединенных Штатах. в 2000 году почти 125 миллионов американцев жили с хроническими заболеваниями, а 61 миллион (21%) имели более одного. По последним оценкам Rand Corporation, в 2014 году почти 60% американцев имели хотя бы одно хроническое заболевание, 42% — более одного и 12% взрослых имели 5 или более хронических заболеваний.Во всем мире 3 из 5 человек умирают из-за хронических воспалительных заболеваний, таких как инсульт, хронические респираторные заболевания, сердечные заболевания, рак, ожирение и диабет. [4] [5] [6] Распространенность некоторых конкретных хронических заболеваний, опосредованных воспалением, следующая:

  • Диабет : По данным Американской диабетической ассоциации, 30,3 миллиона человек или 9,4% населения Америки , болела диабетом в 2015 году и была седьмой по значимости причиной смерти в США.

  • Сердечно-сосудистые заболевания: В соответствии с обновленным отчетом Американской кардиологической ассоциации за 2017 год, на сердечно-сосудистые заболевания (ССЗ) приходится 1 из каждых трех смертей или примерно 800 000 смертей в Соединенных Штатах. В глобальном масштабе на сердечно-сосудистые заболевания приходится 31% всех смертей, а на ишемическую болезнь сердца (ИБС) приходится большая часть смертей от сердечно-сосудистых заболеваний, за которыми следуют инсульт (1 из 20 смертей в США) и сердечная недостаточность.

  • Артрит и заболевания суставов : От них страдают примерно 350 миллионов человек во всем мире и почти 43 миллиона человек в Соединенных Штатах, или почти 20% населения.Ожидается, что к 2020 году это число превысит 60 миллионов человек. Почти 2,1 миллиона американцев страдают ревматоидным артритом.

  • Аллергии: Они занимают шестое место среди основных причин хронических заболеваний человека в США и ежегодно поражают более 50 миллионов американцев. Астма поражает более 24 миллионов человек в Соединенных Штатах, в том числе более 6 миллионов детей. В 2015 году сенная лихорадка была диагностирована у 8,2% взрослых и 8,4% детей.

  • Хроническая обструктивная болезнь легких (ХОБЛ): Третья по частоте причина смерти в США в 2014 году, и почти у 15,7 миллиона американцев (6,4%) была диагностирована ХОБЛ.

Патофизиология

Большинство признаков острого воспаления сохраняются по мере того, как воспаление становится хроническим, включая расширение кровеносных сосудов (вазодилатацию), увеличение кровотока, проницаемость капилляров и миграцию нейтрофилов в инфицированную ткань через стенку капилляров (диапедез).Однако вскоре состав лейкоцитов меняется, и макрофаги и лимфоциты начинают заменять короткоживущие нейтрофилы. Таким образом, признаком хронического воспаления является инфильтрация первичных воспалительных клеток, таких как макрофаги, лимфоциты и плазматические клетки, в участок ткани, продуцирующая воспалительные цитокины, факторы роста, ферменты и, следовательно, способствующие прогрессированию повреждения ткани и вторичному восстановлению, включая фиброз образование гранулем и т. д. [7] [8] [9] [10]

В ответ на чужеродные или аутоантигены клетки тканевого иммунитета, такие как макрофаги и дендритные клетки, выделяют цитокины, такие как IL-1 и TNF-α.Эти цитокины побуждают эндотелиальные клетки в месте повреждения высвобождать селектины и интегрины, которые стимулируют хемотаксис и диапедез циркулирующих лейкоцитов. Помимо набора лейкоцитов, тканевые макрофаги и дендритные клетки также играют роль в очищении от антигена путем фагоцитоза, высвобождении цитокинов и служат лимфоцитам в качестве антигенпрезентирующих клеток. Как только циркулирующие лейкоциты попадают в местное повреждение, они активируются различными цитокинами и хемокинами, секретируемыми макрофагами и дендритными клетками.При активации лейкоциты дополнительно высвобождают цитокины и медиаторы воспаления. Нейтрофилы являются исходными клетками и наиболее преобладают в острой фазе воспаления. Нейтрофилы содержат гранулы, богатые лизоцимом, матриксными металлопротеиназами, миелопероксидазой, которые высвобождаются на чужеродном или аутоантигене, что приводит к его разрушению. Нейтрофилы также разрушают антиген путем фагоцитоза, высвобождения активных форм кислорода и цитокинов, таких как IL-1, IL-6 и TNF-α. Лимфоциты, включая Т-лимфоциты и В-лимфоциты, являются следующей линией защиты, и они играют решающую роль в опосредовании воспаления с помощью нескольких сложных механизмов, включая секрецию цитокинов, костимуляцию лимфоцитов и выработку антител и иммунных комплексов.Циркулирующие тромбоциты также могут играть роль в воспалении за счет агрегации тромбоцитов, образования тромбов и дегрануляции с высвобождением хемокинов и медиаторов воспаления.

Типы хронического воспаления

  • Неспецифическая пролиферация: Характеризуется наличием неспецифической грануляционной ткани, образованной инфильтрацией мононуклеарных клеток (лимфоцитов, макрофагов, плазматических клеток) и пролиферацией фибробластов, соединительной ткани, сосудов и эпителиальные клетки, например воспалительный полипоподобный полип носа или шейки матки и абсцесс легкого.

  • Гранулематозное воспаление: Особый тип хронического воспаления, характеризующийся наличием отчетливых узловых поражений или гранулем, образованных агрегацией активированных макрофагов или производных от них клеток, называемых эпителиоидными клетками, обычно окруженными лимфоцитами. Макрофаги или эпителиоидные клетки внутри гранулем часто сливаются, образуя клетки Лангханса или гигантские клетки, такие как инородное тело, клетки Ашоффа, Рида-Штернберга и гигантские опухолевые клетки.Существует два типа:

  1. Гранулема, образованная из-за инородного тела или опосредованного Т-клетками иммунного ответа, называется гранулемой инородного тела, например, силикозом.

  2. Гранулема, образовавшаяся в результате хронической инфекции, называется инфекционной гранулемой, например туберкулезом и проказой.

История и физические данные

Факторы риска, связанные с хроническим воспалением

Несколько факторов риска способствуют воспалительной реакции низкого уровня.К ним относятся:

  • Возраст: Возраст положительно коррелирует с повышенным уровнем некоторых воспалительных молекул. Возрастное увеличение воспалительных молекул может быть связано с дисфункцией митохондрий или накоплением свободных радикалов с течением времени, а также с другими возрастными факторами, такими как увеличение висцерального жира.

  • Ожирение: Многие исследования показали, что жировая ткань является эндокринным органом, секретирующим множество адипокинов и других медиаторов воспаления.Некоторые отчеты показывают, что индекс массы тела человека пропорционален количеству секретируемых провоспалительных цитокинов. Метаболический синдром хорошо иллюстрирует это.

  • Диета: Диета, богатая насыщенными жирами, трансжирами или рафинированным сахаром, связана с более высоким образованием провоспалительных молекул, особенно у людей с диабетом или людей с избыточным весом.

  • Курение : Курение сигарет снижает выработку противовоспалительных молекул и вызывает воспаление.

  • Низкие половые гормоны: Исследования показывают, что половые гормоны, такие как тестостерон и эстроген, могут подавлять выработку и секрецию нескольких провоспалительных маркеров, и было замечено, что поддержание уровня половых гормонов снижает риск некоторых воспалительных заболеваний.

  • Стресс и расстройства сна: Как физический, так и эмоциональный стресс связаны с высвобождением воспалительных цитокинов. Стресс также может вызывать нарушения сна.Поскольку у людей с нерегулярным режимом сна вероятность хронического воспаления выше, чем у людей, которые постоянно спят, нарушения сна также считаются одним из независимых факторов риска хронического воспаления.

Симптомы хронического воспаления

Ниже перечислены некоторые из общих признаков и симптомов, которые развиваются во время хронического воспаления.

  • Боль в теле, артралгия, миалгия

  • Хроническая усталость и бессонница

  • Депрессия, тревожные расстройства и расстройства настроения

  • Желудочно-кишечные осложнения, такие как запор, диарея

  • веса и кислотный рефлюкс потеря

  • Частые инфекции

Оценка

Анализы на хроническое воспаление

К сожалению, не существует высокоэффективных лабораторных мер для оценки пациентов на предмет хронического воспаления, и диагностика проводится только тогда, когда воспаление возникает в сочетании с другим состояние здоровья.

  • Электрофорез сывороточного белка (SPE) может показать сопутствующую гипоальбуминемию и поликлональное повышение всех гамма-глобулинов (поликлональная гаммапатия).

  • Два недорогих и хороших анализа крови на системное воспаление включают высокочувствительный С-реактивный белок (вчСРБ) и фибриноген. Высокий уровень hs-CRP указывает на воспаление, но он не является специфическим маркером хронического воспаления, поскольку он также повышен при остром воспалении, возникшем в результате недавней травмы или болезни.Нормальный уровень вчСРБ в сыворотке составляет менее 0,55 мг / л у мужчин и менее 1,0 мг / л у женщин. Нормальный уровень фибриногена составляет от 200 до 300 мг / дл. SAA (сывороточный амилоид A) также может указывать на воспаление, но это не стандартизованный тест.

  • Обнаружение провоспалительных цитокинов, таких как фактор некроза опухоли альфа (TNF-альфа), интерлейкин-1 бета (IL-1beta), интерлейкин-6 (IL-6) и интерлейкин-8 (IL-8) дорогостоящий метод, но может выявить конкретные факторы, вызывающие хроническое воспаление.Опять же, анализы не стандартизированы, как hs-CRP, фибриноген и SPE.

Лечение / ведение

Многие изменения в питании и образе жизни могут быть полезны для устранения триггеров воспаления и уменьшения хронического воспаления, как указано ниже. Самым эффективным считается похудание. Например, у пациентов с псориатическим артритом, который представляет собой хронический воспалительный артрит, было показано, что одна только потеря веса независимо связана с клинически значимым улучшением активности заболевания и воспаления.

  • Низкогликемическая диета: Диета с высоким гликемическим индексом связана с высоким риском инсульта, ишемической болезни сердца и сахарного диабета 2 типа. Полезно ограничить употребление в пищу продуктов, способствующих воспалению, таких как газированные напитки, рафинированные углеводы, кукурузный сироп фруктозы.

  • Уменьшите потребление общих, насыщенных жиров и трансжиров: Некоторые пищевые насыщенные и синтетические трансжиры усугубляют воспаление, в то время как полиненасыщенные жиры омега-3 обладают противовоспалительным действием.Обработанные и упакованные продукты, содержащие трансжиры, такие как обработанные семена и растительные масла, выпечка (например, соевое и кукурузное масло), следует исключить из рациона.

  • Фрукты и овощи: Черника, яблоки, брюссельская капуста, капуста, брокколи и цветная капуста, богатые природными антиоксидантами, полифенолами и другими противовоспалительными соединениями, могут защитить от воспалений. Было показано, что употребление вишни и вишневого сока оказывает урикозурический эффект и ингибирует IL-1 у пациентов с подагрой.

  • Волокно : Высокое потребление растворимой и нерастворимой клетчатки с пищей связано со снижением уровней ИЛ-6 и ФНО-альфа.

  • Орехи: , например, миндаль, снижают риск сердечно-сосудистых заболеваний и диабета.

  • Полифенолы зеленого и черного чая: Полифенолы чая связаны со снижением CRP в клинических исследованиях на людях.

  • Куркумин: компонент куркумы , как было показано, связан со значительным улучшением при некоторых воспалительных заболеваниях на животных моделях.

  • F ish Масло: Самый богатый источник омега-3 жирных кислот. Повышенное потребление омега-3 жирных кислот связано со снижением уровней TNF-альфа, CRP и IL-6.

  • Бобы мунг: Богаты флавоноидами (особенно витексином и изовитексином). Это традиционный продукт питания и лечебные травы, известный своим противовоспалительным действием.

  • Микроэлементы : Магний, витамин D, витамин E, цинк и селен).Магний считается одним из самых противовоспалительных диетических факторов, и его потребление связано со снижением активности вчСРБ, ИЛ-6 и ФНО-альфа. Витамин D проявляет свою противовоспалительную активность, подавляя медиаторы воспаления, такие как простагландины и ядерный фактор, усиливающий легкую каппа-цепь активированных В-клеток. Витамин Е, цинк и селен действуют в организме как антиоксиданты.

  • Кунжутные лигнаны : потребление кунжутного масла снижает синтез простагландинов, лейкотриенов и тромбоксанов и известно своей потенциальной гипотензивной активностью.

Физические упражнения

В клинических испытаниях на людях показано, что расход энергии при выполнении упражнений снижает количество провоспалительных молекул и цитокинов независимо от потери веса.

Традиционные препараты для борьбы с хроническим воспалением

Метформин обычно используется для лечения пациентов с сахарным диабетом II типа с дислипидемией и воспалением слабой степени. Противовоспалительная активность метформина проявляется в снижении циркулирующих TNF-альфа, IL-1beta, CRP и фибриногена у этих пациентов.

Статины обладают противовоспалительным действием, поскольку они уменьшают количество циркулирующих и клеточных биомедиаторов воспаления. Этот плейотропный эффект, по-видимому, частично способствует снижению сердечно-сосудистых событий.

Нестероидные противовоспалительные препараты (НПВП) , такие как напроксен, ибупрофен и аспирин, действуют путем ингибирования фермента циклооксигеназы (ЦОГ), который способствует воспалению и в основном используется для облегчения боли, вызванной воспалением, у пациентов с артритом.

Кортикостероиды также предотвращают несколько механизмов, участвующих в воспалении. Глюкокортикоиды назначают при нескольких воспалительных состояниях, включая воспалительный артрит, системную волчанку, саркоидоз и астму.

Травяные добавки , такие как имбирь, куркума, каннабис, иссоп и Harpagophytum procumbens, обладают противовоспалительными свойствами, однако перед их использованием всегда следует проконсультироваться с врачом, и следует соблюдать осторожность при использовании некоторых трав, таких как иссоп и каннабис. .

Дифференциальный диагноз

Важно понимать, что хроническое воспаление — это не конкретное заболевание, а механистический процесс. Заболевания, связанные с хроническим воспалением, многочисленны и включают сердечно-сосудистые заболевания, диабет, злокачественные новообразования, аутоиммунные заболевания, хронические заболевания печени и почек и т. Д. Хороший анамнез, физический осмотр и стандартные лабораторные тесты (глюкоза, креатинин, функция печени, сывороточный белок. электрофорез, ревматоидный фактор, общий анализ крови, антинуклеарные антитела) могут подтвердить или исключить большинство дифференциальных диагнозов.Соответствующие диагностические и визуализирующие исследования могут быть полезны в определенных обстоятельствах, например, колоноскопия при подозрении на воспалительное заболевание кишечника.

Прогноз

Нелеченное хроническое воспаление обычно имеет плохой прогноз. Заболеваемость и смертность, связанные с конкретным заболеванием, зависят от причинного механистического процесса, ведущего к хроническому воспалению.

Осложнения

Хотя хроническое воспаление протекает незаметно, оно является причиной большинства хронических заболеваний и представляет серьезную угрозу для здоровья и долголетия людей.Воспаление считается основной причиной нескольких заболеваний.

  • Сердечно-сосудистые заболевания: Многие клинические исследования показали сильную и последовательную взаимосвязь между маркерами воспаления, такими как вчСРБ, и прогнозом сердечно-сосудистых заболеваний. Кроме того, атеросклероз является провоспалительным состоянием со всеми признаками хронического воспаления низкой степени и приводит к учащению сердечно-сосудистых событий, таких как инфаркт миокарда, инсульт и другие.

  • Рак: Хроническое воспаление низкого уровня, по-видимому, также участвует во многих типах рака, таких как рак почек, простаты, яичников, гепатоцеллюлярный, панкреатический, колоректальный, легочный и мезотелиома.

  • Диабет: Иммунные клетки, такие как макрофаги, проникают в ткани поджелудочной железы, высвобождая провоспалительные молекулы у диабетиков. Как циркулирующие, так и клеточные биомаркеры подчеркивают, что диабет является хроническим воспалительным заболеванием. Хронические осложнения, связанные с диабетом, включают микрососудистые и макрососудистые осложнения. Диабет увеличивает не только риск макрососудистых осложнений, таких как инсульты и сердечные приступы, но и микрососудистых осложнений, таких как диабетическая ретинопатия, невропатия и нефропатия.

  • Ревматоидный артрит: У генетически восприимчивого хозяина хроническое воспаление, вызванное несколькими факторами окружающей среды, такими как курение и инфекции, приводит к системному аутоиммунному ответу, который вызывает местный воспалительный ответ в суставах, инфильтрацию иммунных клеток и выброс цитокинов. . Сохранение хронического воспаления синовиальной оболочки при неадекватно леченном РА было связано с худшим прогнозом и рентгенологическим прогрессированием заболевания.

  • Аллергическая астма: Сложное хроническое воспалительное заболевание, связанное с несоответствующим иммунным ответом и воспалением проводящих дыхательных путей, включая снижение функции дыхательных путей и ремоделирование тканей.

  • Хроническая обструктивная болезнь легких (ХОБЛ): Обструктивная болезнь легких, развивающаяся как хроническая воспалительная реакция на вдыхаемые раздражители и характеризующаяся длительными проблемами с дыханием.

  • Болезнь Альцгеймера: У пожилых людей хроническое воспаление низкого уровня связано с когнитивным снижением и деменцией.

  • Хроническая болезнь почек (ХБП): Незначительное воспаление является частым признаком хронической болезни почек. Это может привести к задержке нескольких провоспалительных молекул в крови и способствует прогрессированию ХБП и смертности. Амилоидоз может быть результатом хронического воспаления, которое может привести к тяжелым почечным осложнениям.

  • Воспалительное заболевание кишечника (ВЗК) — это группа хронических воспалительных заболеваний пищеварительного тракта.Он может развиться как язвенный колит, вызывающий длительное воспаление и язвы на слизистой оболочке толстой и прямой кишки, или болезнь Крона, характеризующуюся воспалением слизистой оболочки пищеварительного тракта, распространяющимся на пораженные ткани, такие как рот, пищевод, желудок и задний проход.

Сдерживание и обучение пациентов

Хроническое воспаление может оказывать пагубное воздействие на организм и является ключевым фактором, вызывающим почти все хронические дегенеративные заболевания. Ниже приведены некоторые из наиболее эффективных способов предотвращения хронического воспаления.

  • Увеличение потребления противовоспалительных продуктов: Важно избегать употребления простых сахаров, рафинированных углеводов, продуктов с высоким гликемическим индексом, трансжиров и гидрогенизированных масел. Употребление цельного зерна, натуральных продуктов, большого количества овощей и фруктов, таких как авокадо, вишня, капуста, и жирной рыбы, такой как лосось, помогает справиться с воспалениями.

  • Свести к минимуму прием антибиотиков и НПВП: Следует избегать использования антибиотиков, антацидов и НПВП, поскольку это может нанести вред микробиому кишечника, вызывая воспаление стенок кишечника, известное как дырявый кишечник, которое, в свою очередь, выделяет токсины и вызывает хронические заболевания. , воспаление всего тела.

  • Регулярно выполняйте физические упражнения для поддержания оптимального веса: Широко известно, что жировая ткань у людей с ожирением или избыточным весом вызывает слабое системное воспаление. Регулярные упражнения помогают не только контролировать вес, но также снижают риск сердечно-сосудистых заболеваний и укрепляют сердце, мышцы и кости.

  • Спите дольше: Ночной сон (в идеале, по крайней мере, от 7 до 8 часов) помогает стимулировать гормоны роста человека и тестостерон в организме, чтобы восстанавливать себя.

  • Меньше стресса: Хронический психологический стресс связан с повышенным риском депрессии, сердечных заболеваний и потери организмом способности регулировать воспалительную реакцию и нормальную защиту. Йога и медитация помогают облегчить вызванное стрессом воспаление и его вредное воздействие на организм.

Улучшение результатов команды здравоохранения

Есть несколько хронических воспалительных заболеваний, которые не поддаются лечению. Большинство из них лечится симптоматической терапией.Межпрофессиональная группа, включающая врачей первичного звена, медсестер, физиотерапевтов, диетологов и специалистов, должна участвовать в лечении основной этиологии, а также в предотвращении осложнений хронического воспаления. Ключевым моментом является просвещение пациентов с упором на диету и изменение образа жизни, включая потерю веса, регулярные упражнения, отказ от курения, здоровое питание и хорошую гигиену сна. К сожалению, в некоторых случаях для контроля хронического воспаления могут потребоваться пожизненные противовоспалительные препараты.

Непрерывное обучение / обзорные вопросы

Рисунок

Фазы заживления ран, гемостаз, реакция сосудов, воспаление, фиброплазия и формирование грануляционной ткани, эпителизация, сокращение, созревание и ремоделирование. Предоставлено Wikimedia Commons, «Медицинская галерея Микаэля Хэггстрёма (подробнее …)

Рисунок

Биопсия кожи, показывающая умеренный склероз дермы и подкожной клетчатки (красные стрелки) с потерей сетчатых гребней (зеленые стрелки) и очаговым хроническим воспалением ( синие стрелки) в соответствии с ранней морфеей.Предоставлено Amit Sapra, MD

Ссылки

1.
Michels da Silva D, Langer H, Graf T. Воспалительные и молекулярные пути при сердечной недостаточности-ишемии, HFpEF и транстиретиновом сердечном амилоидозе. Int J Mol Sci. 10 мая 2019 г .; 20 (9) [Бесплатная статья PMC: PMC6540104] [PubMed: 31083399]
2.
Zhang X, Wu X, Hu Q, Wu J, Wang G, Hong Z, Ren J., Lab for Травмы и хирургические инфекции. Митохондриальная ДНК при воспалении печени и окислительном стрессе.Life Sci. 01 ноября 2019 г .; 236: 116464. [PubMed: 31078546]
3.
Fritsch J, Abreu MT. Микробиота и иммунный ответ: что такое курица и что такое яйцо? Gastrointest Endosc Clin N Am. 2019 июл; 29 (3): 381-393. [PubMed: 31078242]
4.
Barcelos IP, Troxell RM, Graves JS. Митохондриальная дисфункция и рассеянный склероз. Биология (Базель). 11 мая 2019 г .; 8 (2) [Бесплатная статья PMC: PMC6627385] [PubMed: 31083577]
5.
Tsai DH, Riediker M, Berchet A, Paccaud F, Waeber G, Vollenweider P, Bochud M.Влияние краткосрочного и долгосрочного воздействия твердых частиц на уровни маркеров воспаления среди населения в целом. Environ Sci Pollut Res Int. 2019 Июль; 26 (19): 19697-19704. [PubMed: 31079306]
6.
Дипак П., Аксельрад Дж. Э., Анантакришнан А. Н.. Роль радиолога в определении степени тяжести воспалительных заболеваний кишечника. Gastrointest Endosc Clin N Am. 2019 июл; 29 (3): 447-470. [PubMed: 31078247]
7.
Юсуф А., Ибрагим В., Гриннинг, штат Нью-Джерси, Брайтлинг, СЕ.Биопрепараты T2 для лечения хронической обструктивной болезни легких. J Allergy Clin Immunol Pract. 2019 май — июнь; 7 (5): 1405-1416. [PubMed: 31076058]
8.
Миленкович В.М., Стэнтон Э.Х., Нотдурфтер С., Руппрехт Р., Ветцель С.Х. Роль хемокинов в патофизиологии большого депрессивного расстройства. Int J Mol Sci. 2019 May 09; 20 (9) [Бесплатная статья PMC: PMC6539240] [PubMed: 31075818]
9.
Кутоло М., Солдано С., Смит В. Патофизиология системного склероза: текущее понимание и новые идеи.Эксперт Рев Клин Иммунол. 2019 июл; 15 (7): 753-764. [PubMed: 31046487]
10.
Needham EJ, Helmy A, Zanier ER, Jones JL, Coles AJ, Menon DK. Иммунологический ответ на черепно-мозговую травму. J Neuroimmunol. 2019 15 июля; 332: 112-125. [PubMed: 31005712]

Воспалительная фаза — обзор

5.2.1.1 Клетки, регулирующие воспаление

Воспалительная фаза характеризуется тканевой инфильтрацией ряда лейкоцитов, включая полиморфно-ядерные (PMN) лейкоциты, моноциты / макрофаги и Т-клетки.Эти лейкоциты опосредуют важные процессы для нормального заживления ран, борясь с патогенными организмами, удаляя поврежденные ткани и апоптотические / некротические клетки, производя факторы роста и способствуя ремоделированию внеклеточного матрикса (ВКМ). Очень ранняя лейкоцитарная инфильтрация может быть опосредована резидентными тучными клетками, которые выделяют сосудорасширяющий гистамин и протеазы, а также провоспалительные цитокины. Важность резидентных тучных клеток в заживлении ран была исследована с использованием мутантных мышей Kit с дефицитом тучных клеток; Набор представляет собой важный рецептор тирозинкиназы, управляющий развитием тучных клеток у мышей.Например, у мышей с мутантами Kit рекрутирование нейтрофилов в место повреждения снижено, что подтверждает идею о том, что тучные клетки способствуют рекрутированию нейтрофилов [9]. Однако мутантные по Kit мыши проявляют фенотипы, выходящие за рамки дефицита тучных клеток, и были созданы новые модели мышей, более специфически нацеленные на тучные клетки [10]. Эти последние мыши экспрессируют рекомбиназу Cre под контролем генов протеаз тучных клеток с получением Kit-независимых мышей с дефицитом тучных клеток. На этих мышах было продемонстрировано, что тучные клетки могут быть незаменимы для нормального заживления ран [11,12].Наконец, фармакологическое ингибирование тучных клеток динатрий кромогликатом уменьшает воспаление и образование рубцов у мышей [13], оставляя открытым вопрос о том, может ли изменение специфических функций тучных клеток, а не количества тучных клеток, улучшить заживление ран.

Независимо от того, вовлечены ли тучные клетки, лейкоциты PMN обычно считаются первыми ответчиками после повреждения ткани. Эти клетки очищают от мусора и обеспечивают защиту от инфекции, если барьерная функция организма нарушена.Нейтрофилы также выделяют ферменты, такие как эластаза и протеазы, а также активные формы кислорода, которые могут вызвать случайное повреждение здоровой ткани. В модели кожных иссеченных ран у мышей индуцированное антителами истощение нейтрофилов ускоряло закрытие ран у взрослых мышей дикого типа и мышей с диабетом [14]. Напротив, отсроченное закрытие ран у старых мышей дикого типа дополнительно замедлялось из-за истощения нейтрофилов [15]. Вместе эти исследования показывают, что влияние нейтрофилов на заживление ран может зависеть от окружающей среды хозяина.Необходимы дальнейшие исследования различных функций нейтрофилов [16,17] и субпопуляций нейтрофилов [18] при заживлении ран, включая сложную связь между нейтрофилами и другими иммунными клетками, которая может привести либо к усилению, либо к нарушению заживления.

Моноциты / макрофаги следуют за нейтрофилами в место повреждения, либо выходя из крови, либо мигрируя и пролиферируя из своего локального пула. Они удаляют поврежденные ткани и некротические или апоптотические клетки посредством фагоцитоза, продуцируют цитокины / факторы роста и представляют антиген адаптивным иммунным клеткам, таким как Т-клетки.Макрофаги играют роль как в повреждении, так и в восстановлении тканей, основываясь на исследованиях, включающих избирательное истощение раневых макрофагов на разных этапах заживления на разных моделях повреждений [19-25]. Эти исследования показали, что раневые макрофаги участвуют в реакциях заживления, включая ангиогенез и отложение коллагена [22,23].

В невоспалительных условиях периферические ткани содержат в основном резидентные в ткани M2-подобные макрофаги, которые способствуют гомеостазу тканей. При повреждении ткани или инфекции M1-подобная активация индуцируется взаимодействием рецепторов распознавания образов с молекулярными паттернами, ассоциированными с повреждениями (DAMP) или патоген-ассоциированными молекулярными паттернами (PAMP), соответственно [26].Исследования были сосредоточены на фенотипах макрофагов, проявляющихся во время заживления ран после повреждения тканей. Действительно, M1-подобные макрофаги появляются на ранней стадии воспаления, и они замещаются M2-подобными макрофагами [6–8].

Различные онтогенезы макрофагов также могут влиять на фенотипы макрофагов во время заживления ран. При инфаркте миокарда Ly6C hi моноцитов / M1-подобных макрофагов и CD11c + дендритных моноцитов / макрофагов накапливаются во время начальной провоспалительной фазы, за которой следует Ly6C lo / M2-подобные макрофаги, связанные с противовоспалительным или заживляющим ответом [27] .Ly6C hi моноциты / M1-подобные макрофаги и CD11c + дендритные моноциты / макрофаги, как сообщается, происходят из костного мозга при воспалительных условиях [28]. Однако еще предстоит установить, происходят ли Ly6C lo / M2-подобные макрофаги, которые накапливаются в заживающей ткани, от резидентных предшественников ткани или от моноцитов Ly6C hi / M1-подобных макрофагов во время преобразования фенотипа, которое может регулироваться тканевая среда [29]. Более того, поскольку моноциты Ly6C lo могут вносить вклад в провоспалительные реакции в некоторых моделях воспалительного повреждения [30], точная роль (и) субпопуляций моноцитов может быть специфической для каждой ситуации [29].

Т-лимфоциты проникают в поврежденную ткань на поздней стадии воспаления и остаются в ткани во время фазы ремоделирования в течение недель или дольше. В классических исследованиях у врожденно бестимусных голых мышей, у которых отсутствует нормальная система Т-клеток, наблюдался повышенный фиброзный ответ, что свидетельствует о том, что Т-клетки могут ограничивать фиброз [31]. Серия исследований с использованием индуцированного моноклональными антителами истощения Т-клеток показала, что субпопуляция Т-клеток стимулирует заживление ран [32,33]. Т-клетки, находящиеся в неповрежденной коже мышей, были идентифицированы как γδ Т-клетки, которые могут способствовать поддержанию гомеостаза, а также прямому заживлению ран [34,35].Подобные резидентные в коже Т-клетки наблюдались в раненой коже [36]. Кожные Т-клетки могут выполнять множество функций во время заживления ран, секретируя растворимые факторы, такие как факторы роста кератиноцитов [34] и инсулиноподобный фактор роста (IGF) [35]. Интересно, но не удивительно, что эпидермальные Т-клетки чувствительны к метаболическим состояниям, таким как гипергликемия [37] и ожирение у мышей [38] и людей [39]. При инфаркте миокарда мыши Foxp3 + CD4 + регуляторные Т-клетки, по-видимому, улучшают заживление, модулируя дифференцировку моноцитов / макрофагов [40].Хотя значение Т-лимфоцитов в заживлении ран человека остается неясным [41], клетки CD4 + T-хелперы 2 (T H 2) могут способствовать заживлению за счет продукции ключевых цитокинов Th3, таких как IL-4, IL- 5, ИЛ-10 и ИЛ-13 [42].

Мезенхимальные стволовые / стромальные клетки (МСК) могут мигрировать к участкам повреждения от места своего проживания в периваскулярных пространствах различных тканей и / или через кровообращение [43]. МСК могут быть выделены из различных источников, таких как жировая ткань, костный мозг и периферическая кровь [44–48], и расширены для терапевтического использования, что, как было показано, ускоряет заживление ран [47–50].Более того, мобилизация эндогенных МСК может быть усилена системными фармакологическими вмешательствами. Цитокины и факторы роста, такие как гранулоцитарный колониестимулирующий фактор, гранулоцитарный макрофагальный колониестимулирующий фактор, фактор роста гепатоцитов, фактор роста эндотелия сосудов (VEGF) и их комбинация, использовались для ускорения заживления ран посредством мобилизации эндогенных МСК [51], в то время как Эти методы лечения также мобилизуют гемопоэтические стволовые клетки и клетки-предшественники (HSPC) и эндотелиальные клетки-предшественники (EPC) [52].Хемокиновый рецептор CXCR4 экспрессируется на MSC, HSPC и EPC и играет важную роль как в удержании клеток в костном мозге (BM), так и в привлечении к участку раны. Антагонист CXCR4 AMD3100, особенно в сочетании с другими мобилизующими факторами, как было показано, высвобождает стволовые клетки и клетки-предшественники из их якорного костного мозга, таким образом стимулируя их мобилизацию [52]. В сочетании с низкими дозами такролимуса или IGF-1 AMD3100 улучшает заживление кожных ран [53] и заживление переломов костей [54,55] за счет увеличения накопления MSC и / или EPC в области раны.МСК могут способствовать заживлению ран за счет трансдифференцировки в несколько типов клеток [56]. Возможно, что более важно, МСК обладают заметным иммуномодулирующим действием на окружающую среду после имплантации и могут секретировать множество факторов, а также индуцировать секрецию факторов другими соседними клетками [57], особенно теми, которые обладают противовоспалительным действием [50,58].

Поступление лейкоцитов из кроветворных источников также участвует в регуляции воспалительной реакции, поскольку клетки, проникающие в поврежденные ткани из крови, нуждаются в пополнении.Исследования по исцелению инфаркта миокарда, а также инсульта показали, что обмен моноцитов / макрофагов в острой воспалительной фазе происходит быстро со средним временем пребывания в тканях 20 часов и что провоспалительные моноциты, возможно, а также нейтрофилы, с учетом их более короткой продолжительности жизни , постоянно пополняются кровяными клетками в месте повреждения [28]. Регулирование поступления клеток из крови зависит от множества биологических событий: продукции и мобилизации кроветворных органов, таких как костный мозг и селезенка, трансэндотелиальной миграции в интерстициальное пространство ткани (рекрутирование клеток), выживания и пролиферации клеток и эмиграции из ткани. .Регуляторы этих процессов могут происходить на многих уровнях от контроля экспрессии генов до сигналов окружающей среды, включая молекулы адгезии и рецепторы, а также экспрессию цитокинов / хемокинов, как описано в другом месте [59]. Примечательно, что хемокин CCL2 / MCP-1 играет важную роль как в мобилизации миелоида из костного мозга, так и в его инфильтрации в воспаленную ткань [60]. По крайней мере, у мышей селезенка и лимфоидные органы служат резервуарами моноцитов, которые могут быть вредными для заживления ран, когда их количество больше, чем необходимо для эффективного восстановления, например, при провоспалительных состояниях, включая гиперхолестеринемию и атеросклероз [61,62].Исследование показало, что повреждение головного мозга активирует гемопоэтические стволовые клетки для производства миелоидных клеток в костном мозге мышей [63]. Наши исследования показали, что ишемическое повреждение задних конечностей у мышей вызывает экспансию и мобилизацию гематопоэтических клеток-предшественников в костном мозге [64]. Эти исследования показывают, что множественные источники воспалительных клеток и гемопоэтических стволовых клеток и клеток-предшественников участвуют в регуляции воспаления в периферических тканях во время заживления ран, хотя связанные с ними механизмы в значительной степени неизвестны.

Индуцированная воспалением пролиферация клеток усиливает индуцированные повреждением ДНК мутации in vivo

Abstract

Мутации — важнейший фактор возникновения рака. В то время как обширные исследования были сосредоточены на мутациях, вызванных воздействием, мало исследований изучали важность физиологии тканей как модулятора восприимчивости к мутации in vivo . Особый интерес представляет воспаление, известный фактор риска рака, связанный с хроническими воспалительными заболеваниями и воспалением, вызванным патогенами.Здесь мы использовали мышей с флуоресцентным желтым прямым повтором (FYDR), у которых есть репортер, для обнаружения несоответствий во время гомологичной рекомбинации (HR), важного класса мутаций. Мыши FYDR подвергались воздействию церулеина, мощного индуктора воспаления поджелудочной железы. Мы показываем, что воспаление вызывает DSB (очаги γh3AX) и что через несколько дней наблюдается увеличение пролиферации клеток. В то время как изолированные приступы воспаления не индуцировали HR, частичное совпадение между повреждением ДНК, вызванным воспалением, и индуцированной воспалением пролиферацией клеток, вызвало HR.Для изучения экзогенно-индуцированного повреждения ДНК животных подвергали воздействию метилнитрозомочевины, модельного алкилирующего агента, который создает повреждения ДНК, связанные как с воздействием окружающей среды, так и с химиотерапией рака. Мы обнаружили, что воздействие алкилирования индуцирует HR, и, что важно, что индуцированная воспалением пролиферация и алкилирование индуцируют HR синергетическим образом. Взятые вместе, эти результаты показывают, что во время острого приступа воспаления существует кинетический барьер, отделяющий повреждение ДНК от пролиферации клеток, который защищает от мутаций, и что пролиферация клеток, вызванная воспалением, значительно усиливает мутации, вызванные воздействием.Эти исследования демонстрируют фундаментальный механизм, с помощью которого воспаление может действовать синергетически с повреждением ДНК, вызывая мутации, вызывающие рак и рецидив рака.

Сведения об авторе

Люди с хроническими воспалительными заболеваниями имеют значительно повышенный риск рака. Кроме того, многие виды рака имеют воспалительную микросреду, которая способствует росту опухоли. Здесь мы показываем, что воспалительная инфильтрация взаимодействует с регенерацией ткани, чтобы вызвать перестройки последовательности ДНК in vivo .Таким образом, хронически воспаленные заболевания, которые постоянно регенерируют, подвергаются повышенному риску мутагенеза и злокачественной трансформации. Кроме того, быстро делящиеся опухолевые клетки в воспалительной микросреде также могут приобретать мутации, которые, как было показано, вносят вклад в устойчивость к лекарствам и рецидивы заболевания. Наконец, вызванная воспалением регенерация тканей повышает чувствительность тканей к ДНК, повреждающей воздействие окружающей среды и химиотерапевтические препараты. Таким образом, описанная здесь работа расширяет наше понимание того, как воспаление приводит к генетическим изменениям, которые приводят к образованию и рецидиву рака.

Образец цитирования: Kiraly O, Gong G, Olipitz W, Muthupalani S, Engelward BP (2015) Вызванная воспалением пролиферация клеток усиливает мутации, вызванные повреждением ДНК In vivo . PLoS Genet 11 (2): e1004901. https://doi.org/10.1371/journal.pgen.1004901

Редактор: Розана Рискес, Вашингтонский университет, США

Поступила: 11.08.2014; Одобрена: 17 ноября 2014 г .; Опубликовано: 3 февраля 2015 г.

Авторские права: © 2015 Kiraly et al.Это статья в открытом доступе, распространяемая в соответствии с условиями лицензии Creative Commons Attribution License, которая разрешает неограниченное использование, распространение и воспроизведение на любом носителе при условии указания автора и источника

Доступность данных: Все соответствующие данные находятся в пределах документ и вспомогательные информационные файлы к нему.

Финансирование: Эта работа была поддержана грантами R01-CA079827 и P01-CA026731 Национальных институтов здравоохранения (NIH) (http://www.nih.gov).Поддержка также была оказана NIH R33-CA112151, Сингапурским национальным исследовательским фондом (http://www.nrf.gov.sg) в рамках Альянса исследований и технологий Сингапура и Массачусетского технологического института (http://smart.mit.edu), и стипендия APART от Австрийской академии наук (http://www.oeaw.ac.at/en/austrian-academy-of-sciences) (WO). Центр наук об окружающей среде Массачусетского технологического института финансировался грантом NIH P30-ES002109, а центр проточной цитометрии Института Коха Массачусетского технологического института финансировался грантом NIH P30-CA014051.Финансирующие организации не играли никакой роли в дизайне исследования, сборе и анализе данных, принятии решения о публикации или подготовке рукописи.

Конкурирующие интересы: Авторы заявили, что никаких конкурирующих интересов не существует.

Введение

Эффективные стратегии профилактики и лечения рака зависят не только от понимания генетических факторов и факторов, вызванных воздействием, но также и от физиологических факторов, вызывающих болезнь. Повреждение ДНК, вызванное эндогенными метаболитами и экзогенными агентами, способствует мутациям, ключевой движущей силе фенотипических изменений, которые усиливают метастазирование и делают возможным рецидив после лечения [1].Хотя был достигнут значительный прогресс в понимании того, как гены и воздействия модулируют риск мутаций, относительно мало известно о потенциальной роли физиологии тканей в модулировании риска мутаций in vivo . Особый интерес представляет воспалительное состояние, критический фактор риска рака, который связан с радикальными изменениями в архитектуре ткани из-за инфильтрации иммунных клеток и связанных с этим изменений уровней цитокинов и активных форм кислорода и азота (RONS) [2–4].Воспаление — это хорошо зарекомендовавший себя промотор опухоли, который способствует росту рака, ангиогенезу и устойчивости к апоптозу [2,5]. Помимо роли воспаления в прогрессировании рака, все более широко признается, что вызванное воспалением повреждение ДНК также может приводить к мутациям, которые способствуют как возникновению, так и прогрессированию [3,6]. Благодаря недавним достижениям, которые позволяют анализировать ключевые факторы, влияющие на риск мутации [7], мы решили определить, как взаимодействия между повреждением ДНК и физиологическими изменениями, вызванными воспалением, влияют на риск мутаций in vivo .

Долгое время считалось, что именно совпадение условий, вызывающих повреждение ДНК и деление клеток одновременно, является ключевым фактором мутаций, вызванных воспалением [8–11]. Тем не менее, исследования, которые прямо ставят под сомнение комбинированный эффект RONS-индуцированного повреждения ДНК и деления клеток, отсутствуют, как in vitro , так и in vivo . Важно отметить, что тот же предложенный механизм синергии между делением клеток и эндогенными RONS применим к экзогенным агентам, повреждающим ДНК.В клинике практически все больные раком подвергаются высокому уровню повреждения ДНК при лечении радиацией и / или химиотерапией, при которых повреждение ДНК часто имеет решающее значение для способа действия. Хорошо известно, что увеличение частоты мутаций способствует развитию рака и устойчивости к лекарствам [12–15]. Следовательно, понимание физиологических факторов, которые модулируют восприимчивость к мутациям, вызванным терапией, может открыть двери для стратегий по снижению рецидивов заболевания.

Воспаление поджелудочной железы — ключевой фактор риска рака поджелудочной железы [11,16], одного из самых смертоносных видов рака; большинство пациентов, которые первоначально реагируют на радиохимиотерапию, страдают рецидивом, так что только около 5% пациентов выживают более 5 лет после постановки диагноза [17].Повреждение ДНК, вызванное воспалением, потенциально играет важную роль в возникновении мутаций, которые делают возможной инициацию и рецидив рака поджелудочной железы. Во время воспаления наблюдается высокий уровень RONS, который может вызывать цитотоксические и мутагенные повреждения ДНК, включая абазические участки, окисленные основания (например, 8oxoG), дезаминированные основания (например, урацил и гипоксантин) и этеноаденин (eA) [18,19]. В дополнение к повреждению оснований, RONS также индуцируют двухцепочечные разрывы ДНК (DSB). DSB являются одними из самых токсичных повреждений ДНК, и они также могут быть сильно мутагенными из-за потенциальной потери обширных участков хромосом, если не будут исправлены точно [1,20].

Гомологичная рекомбинация (HR) играет критическую роль в предотвращении цитотоксичности, вызванной DSB, путем восстановления DSB во время S / G 2 [21]. Чтобы инициировать репарацию, ДНК резектируется MRE11 и EXO1 с образованием 3 ’одноцепочечных выступов [22-25]. BRCA2 затем загружает RAD51 на одноцепочечную ДНК с образованием нуклеопротеинового филамента, способного к поиску гомологии и инвазии цепи [26-30]. Результирующая D-петля позволяет копировать информацию о последовательности, которая затем может быть обработана нижестоящими белками для завершения процесса репарации [21].Хотя HR эффективен для восстановления двусторонних DSB, его наиболее важная роль заключается в ремонте односторонних DSB, которые возникают при выходе из строя вилок репликации. В отличие от двусторонних DSB, которые могут быть восстановлены с помощью альтернативных механизмов, односторонние DSB требуют HR для точного выравнивания последовательности и повторной вставки разорванного конца ДНК. Воспаление вызывает разрывы одиночных цепей и повреждения, блокирующие репликацию, которые способствуют разрушению вилки репликации. Более того, мутации в BRCA2 являются генетическим фактором риска рака поджелудочной железы [31], указывая на то, что HR действительно активен в поджелудочной железе [32].Таким образом, прогнозируется, что RONS будет создавать DSB во время панкреатита, а HR потенциально может восстанавливать вызванные воспалением DSB в поджелудочной железе.

По иронии судьбы, хотя HR предотвращает цитотоксичность и в основном точен, HR несет в себе риск изменения последовательности. Несогласованность во время HR способствует крупномасштабным перестройкам последовательностей, таким как делеции, дупликации и транслокации [33–35], и эти управляемые HR события наблюдаются при раке [36,37]. Кроме того, HR между гомологичными хромосомами также может приводить к потере гетерозиготности (LOH), основного механизма инактивации генов-супрессоров опухолей.Действительно, исследования культивированных клеток продемонстрировали, что HR является основной причиной от 30 до 70% событий LOH [38-40], и важность LOH, управляемого HR, также была продемонстрирована в опухолях [41,42]. Наконец, недавно было показано, что HR также способствует точечным мутациям в клетках млекопитающих из-за неправильного включения во время репарационного синтеза [43–48]. Взятые вместе, теперь ясно, что практически все виды рака имеют одно или несколько изменений последовательности, управляемых ЧСС, которые способствуют возникновению и прогрессированию.

Учитывая важность HR, мы создали модель мыши, которая позволяет обнаруживать HR in vivo (см. Ссылку 7). Мыши с флуоресцентным желтым прямым повтором (FYDR) несут интегрированный прямой повтор, состоящий из двух нефункциональных кассет экспрессии EYFP, при этом передача информации о последовательности с помощью HR из одной кассеты в другую может восстановить полноразмерную последовательность и вызвать флуоресценцию (рис. 1A – D) [49]. Субстрат рекомбинации FYDR предназначен для обнаружения основных классов событий HR, включая преобразование генов (при котором информация о последовательности передается от одного дуплекса к другому), обмен сестринскими хроматидами (например,g., генная конверсия с кроссовером) и репарация репликационной вилки (S1 рис.) [50]. Важно отметить, что флуоресценция FYDR после репарации репликационной вилки указывает на несовпадение и передачу информации о последовательности во время HR и в некоторых случаях на увеличение одной повторяющейся единицы в субстрате FYDR (Fig. 1A). Учитывая, что все клетки, которые являются положительными по флуоресценции, являются результатом несовпадения последовательностей и несут изменение информации о последовательности, показания FYDR указывают на события мутации. Таким образом, модель мыши FYDR обеспечивает ключевые успехи в исследованиях мутагенеза, поскольку впервые стало возможным визуализировать мутантные клетки, возникающие в интактных тканях взрослых животных [7].

Рисунок 1. Мышь FYDR обнаруживает производные от HR перестройки последовательности in situ в интактной ткани.

( A ) Схема восстановления полноразмерной кодирующей последовательности EYFP из двух усеченных копий посредством перезапуска вилки репликации HR. Обратите внимание, что появление флуоресцентного сигнала указывает на усиление одной повторяющейся единицы (дублирование). Стрелки представляют конструкции выражения. Кодирующие последовательности EYFP показаны желтым цветом, последовательности промотора и сигнала полиаденилирования — белым, а удаленные последовательности — черным.Рисунок выполнен не в масштабе. ( B ) Репрезентативное изображение поджелудочной железы FYDR, показывающее флуоресцентные очаги, обнаруживаемые in situ в интактной ткани. Свежесобранную, нефиксированную целую поджелудочную железу контрастировали с помощью Hoechst, прессовали до 0,5 мм и отображали под эпифлуоресцентным микроскопом. Флуоресценция псевдоцветная. Исходное увеличение, × 1. Масштабная линейка = 1 см. ( C ) Кластер рекомбинантных клеток при первоначальном увеличении × 60. Флуоресценция псевдоцветная. ( D ) Рекомбинантная ацинарная клетка поджелудочной железы, идентифицированная наложением флуоресценции EYFP и окрашивания H&E.Флуоресценция псевдоцветная. Оригинальное увеличение, × 40. ( E ) Модельный алкилирующий агент MNU индуцирует HR в поджелудочной железе. Мышам вводили 25 мг / кг MNU внутрибрюшинно, а HR оценивали через 3-5 недель после лечения. Частоты рекомбинантных фокусов на см площади ткани 2 значительно выше у мышей, получавших MNU (n = 15), чем у контрольных мышей (n = 16). Прямоугольники показывают 25 -го и 75 -го процентилей, медианы показаны горизонтальными линиями. * P <0.05 (тест Манна – Уитни U ).

https://doi.org/10.1371/journal.pgen.1004901.g001

Здесь мы интегрировали подходы к визуализации и количественной оценке повреждений ДНК, пролиферации клеток и мутаций в интактных тканях, чтобы узнать об их взаимосвязи в контекст воспаления. Мы обнаружили, что после контролируемой индукции острого воспаления время для индуцированных воспалением DSB отделено от времени для пролиферации клеток, создавая защитный кинетический барьер против потенциального синергизма между повреждением ДНК и делением клеток.Нарушение этого барьера путем перекрытия пика клеточной пролиферации и острой фазы воспаления вызывает синергетическое увеличение мутаций, вызванных HR. Кроме того, в условиях пролиферации клеток, вызванной воспалением, наблюдается резкое увеличение восприимчивости к мутациям, вызванным воздействием экзогенного агента, повреждающего ДНК, класса, который присутствует в загрязнителях окружающей среды и также широко используется в клинике. Эта работа показывает критическую роль, которую физиология тканей играет в восприимчивости к мутациям, и открывает двери к новым направлениям профилактики и лечения рака.

Результаты

Мыши

FYDR позволяют проводить исследования HR

, вызванного повреждением ДНК.

У мышей FYDR индуцированные HR несовпадения между двумя копиями кассеты экспрессии для EYFP обнаруживаются как флуоресцентные фокусы в интактной ткани поджелудочной железы (рис. 1A, B). В некоторых случаях фокусы состоят из более чем одной флуоресцентной рекомбинантной клетки, что свидетельствует о событии рекомбинации в одной клетке, которая впоследствии подверглась клональной экспансии (Рис. 1C) [51]. Анализ гистологии тканей показывает, что в поджелудочной железе ацинарные клетки подвергаются HR (рис.1D), а предыдущие исследования показали, что ацинарные клетки включают практически все рекомбинантные клетки поджелудочной железы FYDR [51].

Мыши FYDR позволяют проводить исследования ЧСС, вызванной воздействием, в поджелудочной железе взрослых животных. Особый интерес представляют алкилирующие агенты, важный класс агентов, повреждающих ДНК, которые присутствуют в пище и в окружающей среде, некоторые из которых, как было показано, вызывают рак [52–54]. По иронии судьбы, алкилирующие агенты используются для лечения рака в высоких дозах [55].Темозоломид, метилирующий агент, который используется в химиотерапии рака, убивает опухолевые клетки, создавая повреждения ДНК, которые прямо или косвенно ингибируют репликацию ДНК, вызывая цитотоксичность [55]. Клетки, которые не погибают от воздействия темозоломида, потенциально подвергаются риску укрывательства вызванных химиотерапией мутаций, включая события ЧСС. Чтобы определить, вызывает ли повреждение алкилирования HR в поджелудочной железе, мышей FYDR подвергали воздействию модельного агента метилирования MNU, который создает те же типы основных повреждений, что и темозоломид.Результаты показывают, что MNU вызывает значительное увеличение частоты флуоресцентных фокусов (рис. 1E), указывая на то, что модель FYDR на мышах эффективна для исследований HR, вызванного повреждением ДНК.

Воспаление поджелудочной железы, вызванное церулеином, приводит к отеку и предраковым поражениям

Для изучения взаимодействия между повреждением ДНК и воспалением мы использовали церулеин, аналог холецистокинина, который хорошо зарекомендовал себя как индуктор воспаления поджелудочной железы [56,57]. У животных, которым вводили церулеин через 6-часовые внутрибрюшинные инъекции, наблюдались отек поджелудочной железы и инфильтрация воспалительными клетками, главным образом нейтрофилами (рис.2А, Б). Было обнаружено, что выраженность признаков панкреатита статистически значимо увеличивается при количественной оценке обученным патологом (рис. 2C). В исследованиях длительного воздействия церулеина мы наблюдали тяжелую атрофию тканей и метаплазию у мышей дикого типа (рис. 2D, E) и предраковые поражения у мышей K-Ras (рис. S2), что указывает на то, что воздействие церулеина служит важным фактором. модель рака, вызванного панкреатитом.

Рисунок 2. Лечение церулеином вызывает воспаление поджелудочной железы, а хронический церулеиновый панкреатит вызывает метапластические изменения.

( A ) Срезы ткани поджелудочной железы контрольных мышей демонстрируют нормальную архитектуру поджелудочной железы. ( B ) Острое лечение церулеином вызывает воспаление поджелудочной железы, о чем свидетельствует отек и воспалительный инфильтрат. ( C ) Тяжесть вызванного церулеином воспаления, определенная квалифицированным патологом. Показатели воспаления значительно выше у мышей, получавших церулеин (n = 30), чем у контрольных мышей (n = 30). Данные представляют собой среднее значение ± стандартная ошибка среднего. *** P <0,001 (тест Стьюдента t ).( D ) Срез поджелудочной железы мыши, получавшей церулеин в течение 6 месяцев, показывает хроническое воспаление поджелудочной железы, отек, значительную потерю ацинаров и метаплазию ацинаров в протоки (стрелки). ( E ) Количественная оценка метапластических изменений, определенных обученным патологом, показывает отсутствие метаплазии у контрольных мышей. Однако у 9 из 13 мышей, получавших церулеин в течение 6 месяцев, наблюдаются метапластические изменения. См. Методы для подробных патологических критериев оценки. Статистическое тестирование не могло быть выполнено в группах, содержащих только нулевые значения.Панели A, B : Исходное увеличение, × 10. Масштабная линейка = 200 мкм. Панель D : Первоначальное увеличение, × 200. Масштабная линейка = 80 мкм.

https://doi.org/10.1371/journal.pgen.1004901.g002

Острое воспаление вызывает DSB

Во время воспаления повышение уровня макрофагов и нейтрофилов приводит к повышению уровня RONS [18]. RONS, в свою очередь, вызывают повреждения оснований, включая eA, 8oxoG и Hx, которые наблюдались в очагах воспаления [18,19].Многие повреждения ДНК, вызванные RONS, потенциально могут вызывать рекомбиногенные DSB через химическое расщепление, ферментативный процессинг или в результате разрушения репликационной вилки [58–60]. Чтобы узнать, вызывает ли воспаление поджелудочной железы DSB in vivo , мы проанализировали частоту очагов репарации DSB путем количественной оценки клеток с пятью или более очагами γh3AX (h3AX становится фосфорилированным с образованием γh3AX вблизи DSB) [61]. Иммуногистохимический (ИГХ) анализ ткани поджелудочной железы показывает четкую индукцию ДР после воздействия церулеина (рис.3А, Б).

Рис. 3. Независимые приступы воспаления вызывают образование ДСР, но не ЧСС.

( A ) Иммуногистохимическое окрашивание маркера DSB γh3AX (желтый) в срезах поджелудочной железы. Ядра контрастировали DAPI (синий). У контрольных мышей ядра с фокусами γh3AX очень редки ( Left ). Однако ядра с очагами γh3AX (острие стрелки) появляются после независимых приступов воспаления ( Right ). ( B ) Количественная оценка ядер, содержащих более пяти очагов γh3AX, показывает значительно больше γh3AX-положительных ядер после воспаления (n = 6), чем у контрольных животных (n = 6).Данные представляют собой среднее значение ± стандартная ошибка среднего. *** P <0,001 (тест Стьюдента t ). ( C ) Количество флюоресцентных очагов в поджелудочной железе не различается у контрольных мышей (n = 17) и мышей, перенесших повторное острое воспаление (n = 17). Символы представляют данные от отдельных мышей, горизонтальные полосы показывают медианы. нс, статистически не значимо (критерий Манна – Уитни U ). ( D ) Нет статистически значимой разницы в частотах флуоресцентных клеток в поджелудочной железе между контрольными мышами (n = 17) и мышами, перенесшими повторное острое воспаление (n = 17).Поджелудочную железу разделяли на суспензии отдельных клеток и определяли частоту флуоресцентных клеток с помощью проточной цитометрии. Символы представляют данные от отдельных мышей, горизонтальные полосы показывают медианные значения. нс, статистически не значимо (критерий Манна – Уитни U ).

https://doi.org/10.1371/journal.pgen.1004901.g003

Повторяющееся воздействие острого воспаления не вызывает заметного увеличения HR

Поскольку было показано, что HR индуцируется DSB in vitro [62,63], мы затем спросили, индуцируют ли DSB, связанные с острым воспалением, HR in vivo .Чтобы повысить чувствительность нашего подхода, животные подверглись трем приступам острого панкреатита. Анализ частоты событий ЧСС у контрольных животных показывает, что есть вариации в частотах очагов / см 2 , в диапазоне от ∼15 до ∼100 (рис. 3C), что согласуется с предыдущими исследованиями [7,64,65] . (Примечательно, что вариации в частоте мутаций среди нормальных животных аналогичным образом были показаны на нескольких других моделях мышей для обнаружения мутаций [66–69]). Неожиданно у животных, перенесших три приступа воспаления, мы не обнаружили увеличения частоты событий рекомбинации (на что указывают флуоресцентные фокусы; рис.3С). Анализ частоты флуоресцентных рекомбинантных клеток аналогичным образом не выявил увеличения ЧСС у животных, подвергшихся трем приступам воспаления (рис. 3D).

Размножение клеток, вызванное воспалением, происходит через несколько дней после инфильтрации и отека

HR активен во время S / G 2 , тогда как большинство клеток в здоровой ткани поджелудочной железы являются неделящимися клетками в G 0 / G 1 [70], что повышает вероятность того, что HR не был активен в RONS-воздействии. клетки во время трех приступов воспаления.Чтобы узнать о степени деления клеток во время воспаления, мы количественно оценили делящиеся клетки, когда ткань здорова (рис. 4A), подвержена острому воспалению (рис. 4B) или восстанавливается (рис. 4C; через пять дней после воздействия церулеина, когда исчезли признаки воспаления). Клеточную пролиферацию во время воспалительного ответа оценивали путем окрашивания на Ki-67, маркер пролиферации клеток [71]. Результаты показывают, что в контрольной и остро воспаленной ткани очень мало Ki-67-положительных клеток (рис.4D, E). Напротив, частота Ki-67 положительных клеток значительно индуцируется во время восстановления ткани (рис. 4F) и при количественной оценке с использованием программного обеспечения для анализа изображений (см. Материалы и методы) (рис. 4G). В качестве альтернативного подхода животных лечили BrdU, аналогом тимидина, который интегрируется в ДНК делящихся клеток и может быть обнаружен с помощью иммуногистохимии. Ткань поджелудочной железы дезагрегировали, и частоту BrdU-положительных клеток анализировали с помощью проточной цитометрии. В соответствии с анализом Ki-67 результаты показывают явное увеличение частоты делящихся клеток через несколько дней после острого воспаления (рис.4H). Таким образом, с помощью обоих методов мы обнаружили, что острая фаза воспаления отделена от последующей фазы пролиферации.

Рис. 4. При остром церулеиновом панкреатите разделены воспаление и пролиферация регенеративных клеток.

( A ) Поджелудочная железа контрольной мыши демонстрирует нормальную структуру ткани без обнаруживаемых гистологических изменений. ( B ) Через 12 часов после лечения острым церулеином в поджелудочной железе проявляются гистологические признаки острого панкреатита, такие как отек и воспалительный инфильтрат.( C ) Через пять дней после лечения церулеином в острой форме воспаление больше не выявляется, и гистология сопоставима со здоровой тканью. ( D ) Низкое окрашивание Ki-67 указывает на низкую пролиферативную активность в контрольной поджелудочной железе. ( E ) Окрашивание Ki-67 остается низким во время острого панкреатита, что указывает на отсутствие увеличения пролиферации клеток во время острого воспаления. ( F ) Через пять дней после острого лечения церулеином повышенное окрашивание Ki-67 указывает на повышенную пролиферацию клеток во время регенерации ткани.( G ) Количественная оценка мечения Ki-67 показывает значительно более высокую пролиферацию в регенерирующей ткани. Данные представляют собой среднее значение ± SEM для контрольных мышей (n = 16) и мышей с острым панкреатитом (n = 16). *** P <0,001, Тест Стьюдента t -тест. ( H ) На усиление пролиферации клеток во время регенерации от острого панкреатита указывает повышенное мечение BrdU. Через пять дней после острого панкреатита или имитационного лечения мыши получали BrdU (75 мг / кг внутрибрюшинно) для мечения вновь реплицированной ДНК в пролиферирующих клетках.Панкреату собирали через 4 часа, дезагрегировали и определяли частоту клеток, меченных BrdU, окрашиванием антителами и проточной цитометрией. Данные представляют собой среднее значение ± SEM для контрольных мышей (n = 5) и мышей с острым панкреатитом (n = 5). ** P <0,01, тест Стьюдента t -тест. Панели B, C, D : Исходное увеличение, × 10. Масштабная линейка = 200 мкм. Панели E, F, G : Исходное увеличение, × 20. Масштабная линейка = 100 мкм.

https: // doi.org / 10.1371 / journal.pgen.1004901.g004

Создание перекрытия между острой и пролиферативной фазами воспаления вызывает перестройку последовательности

Поскольку HR активен в основном во время S / G 2 , мы предположили, что отсутствие индукции HR после трех независимых приступов воспаления может быть связано с кинетическим разделением между DSB, вызванными острым воспалением, и пролиферацией клеток, индуцированной восстановлением. Поэтому мы спросили, может ли воспаление вызывать ЧСС, если время было скорректировано таким образом, чтобы создать перекрытие между индуцированными воспалением DSB и пролиферацией клеток.Для «протокола 1», описанного выше, животные подвергались трем независимым приступам воспаления, каждые две недели (фиг. 5A). Здесь, для «протокола 2», животные также подвергались трем приступам воспаления, однако между приступами воспаления было 4–5 дней (рис. 5B).

Рисунок 5. Независимые и перекрывающиеся приступы воспаления поджелудочной железы.

( A ) Для независимых приступов воспаления три события острого церулеинового панкреатита были вызваны с интервалом в две недели, и воспаление и пролиферация оценивались во втором (время анализа A) и третьем (время анализа C) приступе воспаления.ЧСС определялась через 10-15 дней после последнего события панкреатита. ( B ) Для перекрывающихся приступов воспаления три события острого церулеинового панкреатита были вызваны в дни 1, 4 и 9. Воспаление и пролиферацию оценивали во втором (время анализа B) и третьем (время анализа D) приступе воспаления. ЧСС определялась через 10-15 дней после последнего события панкреатита. ( C ) Срез поджелудочной железы контрольной мыши показывает здоровую ткань. ( D, E ) Лечение церулеином (как независимое, так и перекрывающееся) приводит к отеку и воспалительному инфильтрату, главным образом нейтрофилов, что указывает на острое воспаление.( F ) Иммуногистохимический анализ Ki-67 показывает низкие уровни базовой пролиферации в контрольной поджелудочной железе. ( G ) В поджелудочной железе во время острого воспаления пролиферация клеток остается низкой. ( H ) Во время регенерации от острого воспаления появляются Ki-67-положительные ядра, что указывает на регенеративную пролиферацию. ( I ) Иммуногистохимическое определение фосфорилирования γh3AX в срезах поджелудочной железы показывает низкие уровни DSB в здоровой поджелудочной железе. ( J ) Во время независимых приступов воспаления становятся очевидными ядра с очагами γh3AX (стрелка).( K ) Во время перекрывающихся приступов воспаления видно больше γh3AX-положительных ядер. ( C E ) Исходное увеличение, × 10. Масштабная линейка = 200 мкм. ( F H ) Исходное увеличение, × 20. Масштабная линейка = 100 мкм. ( I K ) Исходное увеличение, × 40.

https://doi.org/10.1371/journal.pgen.1004901.g005

Для «протокола 1» мы наблюдали, что воздействие церулеина вызывает острое воспаление, о чем можно судить по отеку и инфильтрации в условиях воспаления (ср. рис. .5C и 5D). Во время острого воспаления частота делящихся клеток не изменилась по сравнению с необработанными животными (рис. 5F, G). Однако очевидны клетки с большим количеством очагов γh3AX (рис. 5J), что согласуется с повреждениями ДНК, образованными RONS, которые связаны с острой фазой воспаления. Мы также наблюдали острое воспаление, используя «протокол 2» (рис. 5E). В отличие от протокола 1, мы также наблюдали сопутствующую индукцию клеточного деления, соответствующую пролиферативной фазе первого приступа воспаления (рис.5H). Видны клетки с высокой частотой очагов γh3AX (рис. 5К).

Чтобы узнать больше о влиянии наложения между приступами воспаления, обученный патолог оценил степень воспаления, количественно оценили степень пролиферации клеток с помощью автоматического анализа изображений, а частоту положительных по γh3AX клеток измеряли путем подсчета клеток с > 5 фокусов γh3AX. Результаты показывают, что степень тяжести острой фазы воспаления одинакова независимо от того, происходят ли приступы воспаления независимо или одновременно (рис.6А, Б). Напротив, пролиферация клеток резко увеличивается в условиях, когда реакция на первый приступ воспаления перекрывается с началом второго приступа воспаления (фиг. 6C, D). Частота DSB увеличивается как в независимых, так и в перекрывающихся приступах воспаления, и это увеличение больше в условиях перекрытия между острой фазой воспаления и фазой пролиферации (сравните фиг. 6E и фиг. 6F). Аналогичные результаты наблюдались при третьем приступе воспаления (S3 – S4 рис.), хотя частоты γh3AX были снижены во время третьего приступа воспаления по сравнению со вторым в условиях перекрытия. Непонятно, почему третий приступ воспаления, по-видимому, менее разрушителен, однако одна из возможностей заключается в том, что в ходе протокола воздействия повышалась эффективность HR, что приводило к более быстрому избавлению от DSB. Примечательно, что клиренс потенциально токсичных DSB способствует выживанию клеток, но несет в себе риск мутаций из-за несоответствия HR.

Рис. 6. Перекрывающиеся приступы воспаления вызывают больше DSB, чем независимые приступы воспаления.

Воспаление, пролиферацию клеток и образование очагов γh3AX количественно оценивали в срезах поджелудочной железы мышей, получавших независимые приступы воспаления (синие столбцы) и с перекрывающимися приступами воспаления (фиолетовые столбцы). ( A, B ) Церулеин вызывает воспаление как при независимом (n = 7), так и при перекрывающемся (n = 8) режимах лечения. Тяжесть воспаления у контрольных мышей и мышей, получавших церулеин, количественно оценивал обученный патолог.( C, D ) Количественная оценка ядер, положительных по маркеру пролиферации Ki-67, показывает умеренное увеличение независимых приступов воспаления (n = 7) и большое увеличение перекрывающихся приступов воспаления (n = 8). ( E, F ) Количественная оценка ядер, положительных по маркеру DSB γh3AX (ядра с> 5 очагами), показывает умеренное увеличение независимых приступов воспаления (n = 3) и большое увеличение перекрывающихся приступов воспаления (n = 3). Данные представляют собой среднее значение ± стандартная ошибка среднего. См. Методы для подробных патологических критериев оценки.Статистическое тестирование не могло быть выполнено в группах, содержащих только нулевые значения. * P <0,05; ** P <0,01, *** P <0,001 (тест Стьюдента t ).

https://doi.org/10.1371/journal.pgen.1004901.g006

Чтобы узнать о влиянии кинетики воспалительного ответа на восприимчивость к ЧСС, события рекомбинации были количественно определены в интактной ткани поджелудочной железы, а также оценена частота рекомбинантных клеток. в дезагрегированной ткани поджелудочной железы методом проточной цитометрии.В условиях перекрывающихся приступов воспаления (протокол 2) наблюдается значительное увеличение частоты событий рекомбинации, что является как визуально очевидным (фиг. 7A), так и количественно значимым (фиг. 7B). Кроме того, наблюдается значительное увеличение частоты флуоресцентных рекомбинантных клеток в условиях перекрытия (фиг. 7C), но не тогда, когда животные подвергаются трем независимым приступам воспаления (фиг. 3D).

Рисунок 7. Одновременное воспаление и пролиферация клеток индуцируют HR в поджелудочной железе.

( A ) Репрезентативные изображения поджелудочной железы контрольных мышей ( верхний, ) и мышей, которые испытали комбинированную пролиферацию и воспаление ( нижнее ). Свежесобранные целые органы сжимали между покровными стеклами и отображали под эпифлуоресцентным микроскопом. Показаны характерные детали составных изображений, флуоресцентные фокусы видны in situ . В поджелудочной железе видно больше очагов из группы разрастания плюс воспаление.Яркость и контраст увеличены одинаково. ( B ) Количество флуоресцентных очагов выше у мышей, испытавших комбинированную пролиферацию и воспаление (n = 18), чем у контрольных мышей (n = 17). Символы представляют данные от отдельных мышей, горизонтальные полосы показывают медианы. **, P <0,01, (критерий Манна – Уитни U ). ( C ) Более высокая частота флуоресцентных клеток в поджелудочной железе мышей, которые испытали комбинированную пролиферацию и воспаление (n = 18), чем у контрольных мышей (n = 17).Поджелудочную железу разделяли на суспензии отдельных клеток и определяли частоту флуоресцентных клеток с помощью проточной цитометрии. Символы представляют данные от отдельных мышей, горизонтальные полосы показывают медианные значения. *, P <0,05 (критерий Манна – Уитни U ).

https://doi.org/10.1371/journal.pgen.1004901.g007

Воспаление потенцирует перестройки, вызванные модельным химиотерапевтическим средством от рака

Наблюдение, что перекрывающиеся приступы воспаления индуцируют HR, согласуется с моделью, в которой индуцированная воспалением пролиферация клеток сенсибилизирует ткань к HR, вызванному эндогенно продуцируемым повреждением ДНК.Затем мы спросили о возможности индуцированной воспалением пролиферации клеток вызвать повышенную чувствительность к HR, вызванную экзогенным агентом, повреждающим ДНК, в частности модельным химиотерапевтическим средством против рака MNU.

Эксперименты были разработаны с целью определения времени, когда вызванная воспалением пролиферация клеток высока, а затем подвергнуть животных воздействию MNU (рис. 8A). Для количественной оценки степени пролиферации, вызванной воспалением, ткань поджелудочной железы анализировали на наличие Ki-67-положительных клеток.Во время воздействия MNU наблюдается значительное увеличение пролиферации клеток (фиг. 8B). MNU сам по себе вызывает визуально видимое (рис. 8C) и статистически значимое увеличение частоты событий ЧСС у здоровых животных (рис. 8D) (обратите внимание, что данные с рис. 1E были перенесены для облегчения сравнения между когортами). Эффект MNU на ЧСС был дозозависимым: при 25 мг / кг наблюдалось статистически значимое увеличение количества флуоресцентных фокусов (фиг. 8D), тогда как значительного увеличения ЧСС после обработки 7 не наблюдалось.5 мг / кг МНЕ (S5 рис.). Мы также обнаружили, что одиночный приступ воспаления не вызывает ЧСС (рис. 8C, D), что согласуется с результатами, показанными выше (рис. 3). Важно отметить, что когда животные подвергались воздействию MNU в то время, когда пролиферация, вызванная воспалением, высока, наблюдалось резкое увеличение частоты HR (рис. 8C, D), показывая, что физиологические изменения, связанные с воспалением и воздействием экзогенной ДНК повреждающий агент действует синергетически, вызывая ЧСС. Эти результаты привлекают внимание к важности воспаления как модулятора перестройки последовательности, вызванной повреждением ДНК, вызванной воздействием алкилирующего агента, который служит моделью для агентов, повреждающих ДНК в окружающей среде и в клинических условиях.

Рисунок 8. Связанная с воспалением пролиферация клеток потенцирует эффект экзогенного повреждения ДНК на перестройки ДНК.

( А ) Схема лечения. Мышей подвергали однократному эпизоду острого церулеинового панкреатита или имитации лечения. На пике замещающей пролиферации мыши получали MNU (25 мг / кг внутрибрюшинно) или имитацию лечения. Через 3-4 недели после инъекции MNU мышей гуманно умерщвляли для анализа HR. ( B ) Замещающая пролиферация в поджелудочной железе указана по повышенной экспрессии Ki-67.Через пять дней после острого панкреатита или имитации лечения поджелудочную железу собирали и обрабатывали для иммуногистохимии Ki-67. Данные представляют собой среднее значение ± SEM для контрольных мышей (n = 7) и мышей с острым панкреатитом (n = 8). ** P <0,01, тест Стьюдента t -тест. ( C ) Типичные изображения поджелудочной железы после воспаления и / или экзогенного повреждения ДНК. Свежесобранные целые органы сжимали между покровными стеклами и отображали под эпифлуоресцентным микроскопом. Показаны характерные детали составных изображений, флуоресцентные фокусы видны in situ .Больше очагов видно после лечения MNU, и большое увеличение очевидно после лечения MNU во время регенеративной пролиферации (панель Inflamm + MNU). ( D ) Количественная оценка флуоресцентных очагов в поджелудочной железе после воспаления и / или экзогенного повреждения ДНК. Количество флуоресцентных очагов значительно выше у мышей, получавших MNU (n = 15), чем у контрольных мышей (n = 16), но нет статистически значимого увеличения после одного события острого воспаления (n = 18). Однако наблюдается значительное увеличение количества очагов после обработки MNU во время регенеративной пролиферации (Inflamm + MNU, n = 15).Символы представляют данные от отдельных мышей, горизонтальные полосы показывают средние значения в каждой группе. *, P <0,05; ***, P <0,001 (критерий Манна – Уитни U ).

https://doi.org/10.1371/journal.pgen.1004901.g008

Обсуждение

Рак поджелудочной железы — один из самых смертоносных видов рака, однако относительно немного исследований изучали факторы, определяющие предрасположенность к мутациям, вызывающим рак поджелудочной железы. Более того, хотя лучевая и химиотерапия могут быть эффективными на начальном этапе, рецидив практически неизбежен [72], а мутации являются ключевым фактором рецидива, поскольку они позволяют эволюционировать в устойчивые к лекарствам и более агрессивные фенотипы [12–15].Таким образом, существует потребность в более глубоком понимании механизмов индуцированных повреждением ДНК мутаций в поджелудочной железе. Более того, хотя хорошо известно, что панкреатит является ключевым фактором риска рака поджелудочной железы [11,16], ранее не проводились исследования, чтобы изучить, как физиологические изменения, связанные с воспалением, модулируют риск мутаций in vivo . Здесь мы показываем, что воспаление поджелудочной железы приводит к двухцепочечным разрывам ДНК и что панкреатит связан с гиперпролиферацией.Создавая условия, при которых имеет место перекрытие между приступами воспаления, мы показываем, что DSB и гиперпролиферация действуют синергетически, вызывая перестройки последовательности in vivo (фиг.9), что демонстрирует корреляцию между DSB и HR in vivo и дает понимание в основные механизмы, которые делают панкреатит фактором риска рака. Кроме того, мы показываем, что индуцированная воспалением пролиферация действует синергетически с агентом алкилирования ДНК, вызывая перестройки последовательности in vivo , обеспечивая новое понимание факторов, которые модулируют риск изменений последовательности, которые способствуют развитию рака.

Рисунок 9. Модель для усиления перестроек последовательностей, индуцированных эндогенным и экзогенным повреждением ДНК за счет связанной с воспалением пролиферации клеток.

Клеточная пролиферация, связанная с воспалением, может быть вызвана RONS, высвобожденным из воспалительных клеток. Регенерация после воспаления также включает пролиферацию клеток для восполнения потерь клеток из-за повреждения тканей, вызванного воспалением. Репликация ДНК увеличивается при пролиферации, и повреждение ДНК во время репликации может привести к разрушению вилки и образованию DSB.Эти DSB восстанавливаются с помощью HR, но HR может приводить к LOH, перестройкам последовательностей и точечным мутациям. Таким образом, пролиферация клеток усиливает пагубный эффект как эндогенного (индуцированного RONS), так и экзогенного (индуцированного воздействием) повреждения ДНК, потенциально способствуя инициации и рецидиву рака. Подробности см. В тексте.

https://doi.org/10.1371/journal.pgen.1004901.g009

На протяжении десятилетий было известно, что воспаление является фактором риска развития рака [11,16], и долгое время считалось, что это сочетание вызванного воспалением повреждения ДНК и вызванной воспалением пролиферации клеток, которая играет ключевую роль в продвижении мутагенеза [8–11].Тем не менее прямых доказательств в пользу этой модели не было. Здесь мы показываем, что неожиданно нескольких приступов острого воспаления самих по себе недостаточно для перестройки последовательности, и что разделение острой фазы воспаления (связанной с RONS и повреждением ДНК) и пролиферативной стадии воспаления создает барьер. к перестройкам последовательностей, вызванным повреждением ДНК. Следовательно, состояния, которые приводят к хроническому воспалению, могут с большей вероятностью усилить онкогенные мутации по сравнению с изолированными приступами воспаления, что согласуется с эпидемиологическими исследованиями [73,74].

Здесь мы наблюдали, что примерно у половины животных, подвергшихся перекрывающимся приступам воспаления, частота рекомбинантных клеток на ~ 100–200% выше, чем у необработанных контрольных животных. Учитывая, что частота мутаций может ограничивать скорость распространения опухоли [14], удвоение частоты мутаций потенциально может удвоить вероятность рецидива рака. Повышенный риск мутаций имеет отношение ко многим заболеваниям, связанным с хроническим воспалением [4].Воспалительные заболевания кишечника, такие как язвенный колит и болезнь Крона, связаны с хроническим воспалением толстой кишки, тогда как хронический эзофагит и панкреатит поражают верхние отделы желудочно-кишечного тракта и поджелудочную железу соответственно. Кроме того, хронические инфекции, вызванные бактериями, вирусами и паразитами, могут привести к хроническому воспалению на нескольких участках. Важно отметить, что хронические воспалительные состояния обычно длятся в течение длительного периода времени. Таким образом, ожидается, что относительно небольшое увеличение восприимчивости к мутациям у людей станет очень значительным с учетом накопления в течение многих лет.

RONS создают широкий спектр повреждений ДНК, который включает десятки различных типов повреждений оснований, а также базовые участки и разрывы цепей [75–77]. Из исследований in vitro накоплен большой объем информации о мутагенности повреждений ДНК, вызванных RONS [78,79]. Многие элегантные исследования выявили мутагенный потенциал специфических повреждений оснований, вызванных RONS, с использованием технологии сайт-специфических повреждений [80], а многие другие описали способность воспалительных химических веществ индуцировать мутации в клетках, подвергшихся воздействию RONS, in vitro [81,82] .Используя эти и другие подходы, мы теперь довольно много знаем о молекулярных и биохимических механизмах RONS-индуцированного мутагенеза. Напр., 8oxoG легко ошибочно спаривается с тимином, когда обходится полимеразами трансфузии [83,84], и эти клетки предотвращают управляемый TLS мутагенез, удаляя 8oxoG [85–87]. Клетки также имеют дополнительные стратегии для предотвращения мутаций, вызванных RONS, включая удаление поврежденных оснований из пула нуклеотидов (например, Mth2) [88,89] и удаление неправильно инкорпорированного основания напротив повреждения после репликации (e.g., удаление аденина напротив 8oxoG по Мутым) [89, 90]. В то время как литература, описывающая RONS-индуцированные повреждения основания in vitro обширна (мы отсылаем читателя к нескольким превосходным обзорам [78,79,81,82]), относительно немного исследований посвящено RONS-индуцированному мутагенезу in vivo . Эти исследования показали, что эксцизионная репарация оснований имеет решающее значение для подавления RONS-индуцированных мутаций in vivo [91–94], и что воспаление вызывает мутации в пораженных тканях [95–97].Интересно, что в одном из таких исследований было показано, что инфекция H. pylori связана с мутациями [98], однако частота мутаций снижалась, когда Ogg1 был нокаутирован, оставляя неясным механизм мутагенеза. В другом исследовании было обнаружено, что Ogg1 подавляет мутации, вызванные окислительным повреждением [99]. Самая прямая оценка взаимосвязи между воспалением, повреждением ДНК, мутагенезом и раком была проведена недавно в лаборатории Л. Самсона. Это исследование показало, что дефицит гликозилазы Aag связан с увеличением количества рака, вызванного воспалением, и что опухоли несут мутации, соответствующие предсказанным мутациям, которые могут возникнуть в результате дефицита Aag [6].

Здесь мы расширили исследований воспаления и мутагенеза in vivo, , чтобы конкретно исследовать взаимосвязи между воспалением, пролиферацией клеток, DSB и их последствиями (событиями гомологичной рекомбинации), используя инструменты, которые ранее не применялись для этого. проблема. Важно отметить, что это исследование сосредоточено на конкретном классе мутаций (реаранжировки последовательностей, управляемых HR), и что существуют другие классы мутаций, которые не обнаруживаются с помощью анализа FYDR, такие как точечные мутации, вызванные повреждением оснований (которые часто возникают во время TLS) и небольших вставок / удалений (которые иногда связаны с NHEJ).Тем не менее, ожидается, что события HR, вызванные воспалением, будут возникать одновременно с другими классами мутаций. В частности, как точечные мутации, так и события HR возникают в первую очередь как следствие повреждения ДНК, которое присутствует во время репликации ДНК. Таким образом, HR может служить индикатором более общего усиления мутагенеза. Действительно, связь между точечными мутациями и событиями ЧСС согласуется с наблюдениями, показывающими, что ЧСС, вызванная воздействием, является отличным предиктором канцерогенности, которая обычно возникает в результате множественных классов мутаций [100].

RONS-индуцированные DSB редко вызываются прямой реакцией с ДНК [18,19], а являются результатом ферментативного процессинга. В частности, эксцизионная репарация оснований в повреждениях, вызванных RONS, связана с промежутками, которые образуются в качестве промежуточных продуктов репарации [60]. Эти однонитевые разрывы могут стать DSB, когда участки репарации находятся близко друг к другу [60,101]. Кроме того, вилки репликации, которые сталкиваются с RONS-индуцированными разрывами одноцепочечных цепей, могут разрушаться [21], создавая двухнитевые разрывы. Мы наблюдали увеличение DSB как в условиях отдельных приступов воспаления, так и в условиях перекрывающихся приступов воспаления.Интересно, что в условиях, когда пролиферация от первого приступа воспаления перекрывается с острым воспалением от второго приступа воспаления, мы наблюдали, что DSB значительно увеличивались по сравнению с условиями без перекрытия. Это наблюдение согласуется с возможностью того, что DSB формируются зависимым от репликации образом в результате выхода из строя репликационной вилки.

В субстрате с прямым повтором FYDR полноразмерная последовательность Eyfp может быть восстановлена ​​с помощью нескольких механизмов HR.Например, если происходит событие разрушения вилки во время репликации ДНК, неправильная вставка двухцепочечного конца может восстановить полную длину Eyfp , что приведет к увеличению одной повторяющейся единицы (перестройка на субстрате FYDR, рис. 1A). Важно отметить, что субстрат FYDR подобен по размеру Alu повторам (~ 500 п.н. против ~ 300 п.н.), которые составляют почти 10% генома человека и часто являются сайтами образования реаранжировки, индуцированной HR [102]. HR между Alu повторами может приводить к делециям, дупликациям и транслокациям [102]. Alu -опосредованные перестройки, как было показано, активируют онкогены при раке [103] и инактивируют гены-супрессоры опухоли, такие как p53 [104]. Кроме того, было показано, что управляемые HR перестройки между повторами Alu управляют канцерогенезом при опухолях, связанных с воспалением [36, 105]. Таким образом, события HR, которые происходят у мышей FYDR после репарации репликационной вилки, связаны с генетическими изменениями, которые имеют отношение к канцерогенезу у людей.

Алкилирующие агенты в изобилии присутствуют в окружающей среде, эндогенно продуцируются в наших клетках и используются в высоких дозах в качестве противораковых средств.Таким образом, понимание факторов, которые модулируют мутации, вызванные алкилированием, важно как для этиологии рака, так и для рецидива рака. Мы показываем здесь, что индуцированная воспалением пролиферация клеток действует синергетически с повреждением алкилирования, вызывая перестройки последовательности (рис. 9). Таким образом, одним из потенциальных факторов при рассмотрении основных механизмов, посредством которых хроническое воспаление способствует развитию рака, является то, что воспалительная реакция делает ткани чувствительными к воздействию агентов, повреждающих ДНК, которые присутствуют в окружающей среде и в нашей пище.Более того, поскольку самой пролиферации достаточно для повышения восприимчивости к перестройкам последовательностей, вызванным повреждением ДНК [106], следует внимательно относиться к младенцам in utero и маленьким детям, у которых ожидается высокий уровень клеточной пролиферации, который значительно повысит чувствительность клеток к воздействию — индуцированные мутации. Таким образом, при скрининге на предмет потенциально канцерогенных воздействий важно учитывать важность физиологического состояния человека при оценке риска в отношении как хронических воспалительных состояний, так и стадии их развития.

Рецидив — это единственное самое большое препятствие в лечении рака, и мутации имеют решающее значение для выявления фенотипических изменений, которые инициируют новые вторичные раковые опухоли, способствуют развитию существующих раковых клеток и усиливают лекарственную устойчивость [1,12-15]. Недавно было продемонстрировано, что частота мутаций напрямую влияет на возникновение лекарственной устойчивости [14]. Хотя в некоторых случаях раковые клетки гипермутабельны [13], многие трансформированные клетки имеют нормальную скорость мутаций [12], что делает мутации, вызванные воздействием, очень актуальными.Опухоли обычно существуют в хронической провоспалительной среде. Ожидается, что ассоциированное увеличение пролиферации как опухолевых, так и стромальных клеток повысит восприимчивость к RONS-индуцированным и индуцированным химиотерапией событиям HR, которые могут способствовать метастазированию и рецидиву (рис. 9). В настоящее время разрабатываются новые подходы к лечению рака, включая поэтапное высвобождение лекарств из наночастиц, которые увеличивают гибель клеток химиотерапевтическими агентами [107]. Эти подходы могут помочь минимизировать вызванные лечением мутации и, таким образом, замедлить появление лекарственно-устойчивых или более агрессивных форм рака.

Наблюдение за синергизмом между состояниями, вызывающими гиперпролиферацию, и состояниями, вызывающими повреждение ДНК, актуально для миллионов людей, страдающих хроническим воспалением и, следовательно, подверженных повышенному риску мутаций, вызывающих рак. Кроме того, наблюдение, что воспаление повышает чувствительность ткани к ЧСС, индуцированной алкилированием, имеет отношение к другим воздействиям, которые создают повреждения ДНК, которые ингибируют репликацию, включая компоненты пищи, сигаретный дым и канцерогены окружающей среды ( e.г ., афлатоксин, BaP, PhIP). Важно отметить, что, хотя в центре внимания этой работы находится HR в интегрированном репортере, модель FYDR служит мощным инструментом для изучения более общих увеличений HR по всему геному с сопутствующим повышенным риском LOH, инсерций, делеций и точек мутации, все из которых вызывают рак (рис. 9). Благодаря этим исследованиям динамических физиологических изменений, связанных с воспалением, эта работа способствует нашему фундаментальному пониманию того, как воспаление вызывает генетические изменения, вызывающие рак, и привлекает внимание к новым направлениям профилактики и лечения заболеваний.

Материалы и методы

Заявление об этике

Все эксперименты на животных проводились в соответствии с Руководством по уходу и использованию лабораторных животных и были одобрены Комитетом по уходу за животными Массачусетского технологического института.

Химические вещества

Церулеин, метилнитрозомочевина (MNU), BrdU, ингибитор трипсина сои и коллагеназа были приобретены у Sigma-Aldrich.

Животные

Самок мышей C57Bl / 6 p и FYDR ([7], возраст от 5 до 7 недель) использовали для измерения ЧСС.Воспаление, пролиферацию и двухцепочечные разрывы измеряли на самках мышей C57Bl / 6 (Taconic) и C57Bl / 6 p un FYDR (возраст от 5 до 7 недель). Метапластические и пренеопластические поражения анализировали с использованием мышей-самцов дикого типа или мутантных мышей K-Ras (предоставлены T. Jacks, MIT) на фоне FVB (возраст на момент анализа — 8 месяцев). Мышей содержали в одобренном AAALAC, свободном от специфических патогенов помещении при 12-часовом цикле свет / темнота и кормили стандартной диетой для грызунов (LabDiet RMH 3000, Purina LabDiet) и автоклавированной водой ad libitum .Для измерения ЧСС пометы были разделены между экспериментальными группами.

Повторный острый панкреатит

Мыши подверглись 3 эпизодам острого панкреатита в экспериментальные дни 0, 4 и 9 или в дни 0, 14 и 28. Каждый эпизод вызывался 6-часовыми внутрибрюшинными инъекциями церулеина (растворенного в PBS, 50 мкг / кг для каждого впрыск). Контрольные животные не получали инъекции, поскольку серийные инъекции PBS не влияли на ЧСС (S6, фиг.). Для оценки воспаления, экспрессии Ki-67 и двухцепочечных разрывов мышей гуманно умерщвляли через 12 часов после первой инъекции церулеина, а поджелудочную железу собирали для гистологического анализа.Для оценки регенеративной пролиферации клеток по метке BrdU мышам вводили дозу BrdU (75 мг / кг) через пять дней после первого приступа острого панкреатита. Через четыре часа после инъекции BrdU мышей гуманно умерщвляли, а их поджелудочную железу собирали и обрабатывали для обнаружения BrdU с помощью проточной цитометрии. Для оценки гомологичной рекомбинации мышей гуманно умерщвляли через 10-15 дней после последнего эпизода панкреатита и собирали поджелудочную железу для анализа FYDR.

Хронический панкреатит

Хроническое воспаление поджелудочной железы вызывалось инъекциями церулеина (5 мкг растворенного в физиологическом растворе, однократная внутрибрюшинная инъекция, 5 дней в неделю) в течение 6 месяцев, как описано в [108].Контрольным мышам вводили физиологический раствор. В начале лечения мышам было 2 месяца. В возрасте 8 месяцев мышей гуманно умерщвляли и собирали поджелудочную железу для гистологического анализа.

Регенеративная пролиферация и экзогенное повреждение ДНК

Мыши получали 6-часовые внутрибрюшинные инъекции церулеина (растворенного в PBS, 50 мкг / кг для каждой инъекции) для индукции острого панкреатита. Контрольные мыши получали 6-часовые инъекции PBS. Чтобы оценить регенеративную пролиферацию по экспрессии Ki-67, мышей гуманно умерщвляли через пять дней после индукции острого панкреатита, а их поджелудочную железу собирали для гистологического анализа.Чтобы вызвать экзогенное повреждение ДНК во время регенеративной пролиферации, мышам вводили дозу метилнитрозомочевины (25 мг / кг, растворенного в PBS, pH 4) через пять дней после обработки церулеином. (Обратите внимание, что время в этом эксперименте отличается от времени в эксперименте с повторным воспалением, поскольку MNU вызывает повреждение ДНК напрямую и намного быстрее, чем воспаление, вызванное церулеином.) Контрольным мышам вводили дозу PBS, pH 4. Мышей гуманно усыпляли 3 до 4 недель после инъекции метилнитрозомочевины и поджелудочной железы собирали для анализа FYDR.

Маркировка БрДУ

Pancreata дезагрегировали механическим измельчением и расщеплением коллагеназой V при 37 ° C в течение 40 минут с последующим осторожным пипетированием. Клетки собирали центрифугированием и окрашивали с помощью набора для обнаружения пролиферации клеток APC (BD Pharmingen) в соответствии с инструкциями производителя. Образцы анализировали на проточном цитометре FACSCalibur (BD Biosciences) с использованием программного обеспечения CellQuest Pro. В среднем на образец анализировали 20 000 клеток.

Ki-67 иммуногистохимия

Pancreata фиксировали в 10% нейтральном забуференном формалине, заливали парафином и делали срезы по 4 мкм.После депарафинизации проводили извлечение антигена, индуцированное нагреванием, с использованием модифицированного цитратного буфера (Dako). Антитело Ki-67 (крысиное антимышиное Ki-67, Dako) использовали в разведении 1/100 при комнатной температуре в течение 1 часа. Вторичные антитела (биотинилированный кроличий анти-крысиный Ig, Dako) использовали в разведении 1/100 при комнатной температуре в течение 20 минут и детектировали с помощью пероксидазы, конъюгированной со стрептавидином, и DAB. Срезы контрастно окрашивали гематоксилином. В повторных экспериментах по воспалению процент Ki-67-положительных ядер определяли на 20 случайно выбранных изображениях (× 20) с использованием программного обеспечения для анализа изображений (Visiopharm, Hørsholm, Дания).В эксперименте «Острое воспаление + MNU» количество Ki-67-положительных ядер подсчитывали в 15 случайно выбранных полях изображения (× 20) слепым способом.

Иммунофлуоресценция γh3AX

Срезы (4 мкм) фиксированной формалином, залитой парафином ткани депарафинизировали и извлекали антиген с использованием модифицированного цитратного буфера (Dako). Срезы инкубировали с первичным антителом γh3AX (Millipore) в разведении 1/100 при 4 ° C в течение 3 часов. Вторичные антитела (Alexa Fluor 488 Goat Anti-Mouse IgG, Invitrogen) использовали в разведении 1/500 при комнатной температуре в течение 1 часа.Перед визуализацией срезы контрастировали с DAPI. Для каждого раздела были получены изображения 20 случайно выбранных полей изображения с увеличением × 40 с использованием программного обеспечения ImagePro Plus (Media Cybernetics). Ядра, окрашенные DAPI, подсчитывали с помощью ImagePro Plus, а ядра, содержащие более 5 фокусов γh3AX, подсчитывали вручную слепым методом.

Анализ гомологичной рекомбинации

In situ флуоресцентная визуализация . Поджелудочную железу погружали в ледяной раствор ингибитора трипсина сои (0.01% в PBS) сразу после сбора урожая. Поджелудочную железу зажали между покровными стеклами, разделенными разделителями 0,5 мм, и визуализировали на эпифлуоресцентном микроскопе Nikon 80 i (Nikon) с камерой CCD (CoolSNAP EZ, Photometrics) с использованием объектива × 1 при фиксированном времени экспозиции (2 с). EYFP был обнаружен в канале FITC. Многоточечные изображения, снятые с использованием автоматизированного стола (ProScan II, Prior Scientific) и программного обеспечения NIS Elements (Nikon), были автоматически или вручную сшиты в Adobe Photoshop (Adobe Systems).Яркость и контрастность были отрегулированы одинаково для всех изображений, а фокусы подсчитывались вручную слепым методом. Области поджелудочной железы определяли с помощью программного обеспечения ImageJ (NIH) путем ручного отслеживания контура поджелудочной железы.

Проточная цитометрия . После визуализации поджелудочную железу дезагрегировали на одноклеточные суспензии, как описано в [7], с небольшими изменениями. Вкратце, поджелудочную железу измельчали ​​лезвиями скальпеля с последующим перевариванием коллагеназой V (2 мг / мл в сбалансированном солевом растворе Хенкса) в течение 40 минут при 37 ° C.Полученную суспензию осторожно растирали для увеличения механического разделения и фильтровали через сетчатый фильтр для клеток 70 мкм (BD Falcon) в равный объем среды (DMEM F12 HAM с 20% FBS). Клетки собирали центрифугированием, ресуспендировали в 350 мкл OptiMEM (Invitrogen) и фильтровали через колпачки с фильтром 35 мкм в пробирки для проточной цитометрии (Beckton Dickinson). Образцы анализировали на цитометре FACScan (Beckton Dickinson) с использованием программного обеспечения CellQuest Pro (Beckton Dickinson). В среднем на одну пробу было проанализировано 1 800 000 клеток.

Патологический анализ

Pancreata фиксировали в 10% забуференном формалине, заливали парафином, делали срезы (4 мкм) и окрашивали гематоксилином и эозином. Затем опытный ветеринарный патолог осмотрел поджелудочную железу и оценил ее слепым методом по шкале от 0 до 4 по следующим индивидуальным признакам: воспаление, отек, кровотечение, дегенерация / некроз ацинаров, потеря / атрофия ацинаров, жировая инфильтрация, фиброз, ацинар. к протоковой метаплазии (ADM), ацинарной / протоковой гиперплазии, ацинарной дисплазии / неоплазии и протоковой дисплазии / гиперплазии.Для исследований острых заболеваний были проанализированы и оценены только несколько соответствующих подгрупп, тогда как для исследований хронических заболеваний оценивался полный набор критериев.

Статистика

Индексы

воспаления, пролиферации и двухцепочечного разрыва сравнивали с тестом Стьюдента t . Количество рекомбинантных очагов, частота рекомбинантных клеток и патологические баллы не соответствуют нормальному распределению и сравнивались с тестом Манна-Уитни U . Все статистические анализы были выполнены в GraphPad Prism, версия 5.02 (программное обеспечение GraphPad). Значение P менее 0,05 считалось статистически значимым.

Вспомогательная информация

S1 Рис. HR на субстрате рекомбинации FYDR определяется по флуоресценции после преобразования гена, обмена сестринскими хроматидами и репарации репликационной вилки.

В каждой экспрессионной кассете отсутствуют различные существенные кодирующие последовательности EYFP , так что ни одна из них не способна экспрессировать функциональный белок. Преобразование гена может привести к передаче информации о последовательности из одной кассеты в другую, восстановлению полноразмерной кодирующей последовательности EYFP и возникновению флуоресценции.Каждая кассета может быть донором или реципиентом в событии генной конверсии. Весь репортер HR копируется во время фазы S, что делает возможным кроссоверы между сестринскими хроматидами (преобразование генов с кроссовером) для восстановления полноразмерного EYFP . Обратите внимание, что событие конверсии гена с длинным трактом было бы неотличимо. HR-репарация сломанной репликационной вилки также может быть обнаружена с использованием субстрата FYDR. Показана разбивка репликационной вилки, движущейся слева направо. Повторная вставка сломанного конца Δ3 egfp в кассету Δ5 egfp может восстановить полную длину EYFP.Аналогичным образом EYFP может быть восстановлен путем ремонта вил, движущихся в обратном направлении (не показано). Одноцепочечный отжиг, инициированный DSB между повторяющимися кассетами, можно легко исправить, но эти события не будут восстанавливать полноразмерный EGFP, и, следовательно, SSA не может быть обнаружен.

https://doi.org/10.1371/journal.pgen.1004901.s001

(TIF)

S2 Рис. Хроническое лечение церулеином приводит к диспластическим и пренеопластическим изменениям у мышей K-Ras.

( A ) Поджелудочная железа от мутантно обработанных мутантных мышей K-Ras.Выявляются воспаление, ацинарная атрофия и интерстициальный фиброз (стрелка). Ацинарно-протоковая метаплазия редка. Окрашивание H&E. Оригинальное увеличение, × 100. Масштабная линейка = 160 мкм. ( B ) Поджелудочная железа мутантной мыши по K-Ras, обработанной хроническим церулеином. Мелкоочаговое разрастание ацинарных канальцев (толстая стрелка) с архитектурной и цитологической атипией (дисплазией низкой степени), окруженной воспалением. Также присутствует немного ацинусов со слизистыми метапластическими изменениями (тонкая стрелка). Оригинальное увеличение, × 400.Масштабная линейка = 40 мкм. ( C ) Гистологические оценки метаплазии ацинар-протоков у фиктивных и хронически обработанных церулеином мутантных мышей K-Ras. Подробные критерии оценки описаны в методах . Каждый символ обозначает данные от одной мыши. ***, P <0,001, критерий Манна – Уитни U . ( D ) Гистологические оценки дисплазии / неоплазии у мышей с ложным и хроническим лечением церулеином мутантных K-Ras мышей. Подробные критерии оценки описаны в методах .Каждый символ обозначает данные от одной мыши. **, P <0,01 (критерий Манна – Уитни U ).

https://doi.org/10.1371/journal.pgen.1004901.s002

(TIF)

S3 Рис. Независимые и перекрывающиеся приступы воспаления поджелудочной железы.

( A ) Для независимых приступов воспаления три события острого церулеинового панкреатита были вызваны с интервалом в две недели, и воспаление и пролиферация оценивались во втором (время анализа A) и третьем (время анализа C) приступе воспаления.ЧСС определялась через 10-15 дней после последнего события панкреатита. ( B ) Для перекрывающихся приступов воспаления три события острого церулеинового панкреатита были вызваны в дни 1, 4 и 9. Воспаление и пролиферацию оценивали во втором (время анализа B) и третьем (время анализа D) приступе воспаления. ЧСС определялась через 10-15 дней после последнего события панкреатита. ( C ) Срез поджелудочной железы контрольной мыши показывает здоровую ткань. ( D, E ) Лечение церулеином (как независимое, так и перекрывающееся) приводит к отеку и воспалительному инфильтрату, главным образом нейтрофилов, что указывает на острое воспаление.( F ) Иммуногистохимический анализ Ki-67 показывает низкие уровни базовой пролиферации в контрольной поджелудочной железе. ( G ) В поджелудочной железе во время острого воспаления пролиферация клеток остается низкой. ( H ) Во время регенерации от острого воспаления появляются Ki-67-положительные ядра, что указывает на регенеративную пролиферацию. ( I ) Иммуногистохимическое определение фосфорилирования γh3AX в срезах поджелудочной железы показывает низкие уровни DSB в здоровой поджелудочной железе. ( J ) Во время независимых приступов воспаления становятся очевидными ядра с очагами γh3AX (стрелка).( K ) Во время перекрывающихся приступов воспаления видны γh3AX-положительные ядра. ( C E ) Исходное увеличение, × 10. Масштабная линейка = 200 мкм. ( F H ) Исходное увеличение, × 20. Масштабная линейка = 100 мкм. ( I K ) Исходное увеличение, × 40.

https://doi.org/10.1371/journal.pgen.1004901.s003

(TIF)

S4 Рис. Воспаление, пролиферация и DSB в независимых и перекрывающихся приступах воспаления.

Воспаление, пролиферация клеток и образование очагов γh3AX количественно оценивали в срезах поджелудочной железы мышей, получавших независимые приступы воспаления (синие столбцы) и с перекрывающимися приступами воспаления (фиолетовые столбцы). ( A, B ) Церулеин вызывает воспаление как при независимом (n = 7), так и при перекрывающемся (n = 8) режимах лечения. Тяжесть воспаления у контрольных мышей и мышей, получавших церулеин, количественно оценивал обученный патолог. ( C, D ) Количественная оценка ядер, положительных по маркеру пролиферации Ki-67, показывает отсутствие увеличения независимых приступов воспаления (n = 7) и значительное увеличение числа перекрывающихся приступов воспаления (n = 8).( E, F ) Количественная оценка ядер, положительных по маркеру DSB γh3AX (ядра с> 5 очагами), показывает умеренное увеличение числа независимых приступов воспаления (n = 3) и отсутствие значительного увеличения числа перекрывающихся приступов воспаления (n = 3). Данные представляют собой среднее значение ± стандартная ошибка среднего. См. Методы для подробных патологических критериев оценки. Статистическое тестирование не могло быть выполнено в группах, содержащих только нулевые значения. * P <0,05; ** P <0,01, *** P <0.001 (Студенческий т -тест).

https://doi.org/10.1371/journal.pgen.1004901.s004

(TIF)

S5 Рис. Лечение низкими дозами MNU не вызывает ЧСС.

Животные получали MNU (7,5 мг / кг) в виде однократной внутрибрюшинной инъекции, и HR оценивали через 3-5 недель. Нет существенной разницы между количеством флуоресцентных фокусов у контрольных (n = 15) и получавших MNU (n = 14) мышей. Символы представляют данные от отдельных мышей, горизонтальные полосы показывают медианы.нс, статистически не значимо (критерий Манна – Уитни U ).

https://doi.org/10.1371/journal.pgen.1004901.s005

(TIFF)

S6 Рис. Повторные внутрибрюшинные инъекции PBS не влияют на ЧСС в поджелудочной железе.

Мыши получали однократные ( слева, , n = 85) или множественные ( справа, , n = 22) внутрибрюшинные инъекции PBS, и количество флуоресцентных очагов в их поджелудочной железе определяли после визуализации in situ , как описано в Методы .Символы представляют данные от отдельных мышей, горизонтальные полосы показывают медианы. нс, статистически не значимо (критерий Манна – Уитни U ).

https://doi.org/10.1371/journal.pgen.1004901.s006

(TIF)

Благодарности

Мы благодарим Chakib Boussahmain, Yvette Miller и Megan Roytman за техническую помощь, а Patrick Verdier — за поддержку в визуализации. Мы признательны Центру наук об окружающей среде Массачусетского технологического института и Центру проточной цитометрии Института Коха Массачусетского технологического института.

Вклад авторов

Задумал и спроектировал эксперименты: ОК, BPE. Проведены эксперименты: OK GG WO. Проанализированы данные: OK WO SM BPE. Написал бумагу: ОК, BPE.

Ссылки

  1. 1. Friedberg EC, Walker GC, Siede W, Wood RD, Schultz R и Ellenberger T. (2006). Ремонт ДНК и мутагенез. ASM Press, Вашингтон, округ Колумбия, США.
  2. 2. Coussens LM, Werb Z. (2002) Воспаление и рак. Природа 420: 860–7. pmid: 124
  3. 3.Колотта Ф, Аллавена П., Сика А., Гарланда С., Мантовани А. (2009) Воспаление, связанное с раком, седьмой признак рака: связь с генетической нестабильностью. Канцерогенез 30: 1073–81. pmid: 19468060
  4. 4. Хуссейн С.П., Хофсет Л.Дж., Харрис СС. (2003) Радикальные причины рака. Nat Rev Рак. 3: 276–85. pmid: 12671666
  5. 5. Гривенников С.И., Гретен Ф.Р., Карин М. (2010) Иммунитет, воспаление и рак. Клетка. 140: 883–99. pmid: 20303878
  6. 6.Meira LB, Moroski-Erkul CA, Green SL, Calvo JA, Bronson RT и др. (2009) Aag-инициированная эксцизионная репарация оснований вызывает у мышей индуцированную алкилированием дегенерацию сетчатки. Proc Natl Acad Sci U S. A. 106: 888–93. pmid: 1
  7. 00
  8. 7. Виктор-Браун Д.М., Хендрикс Калифорния, Олипитц В., Энгелвард Б.П. (2006) Зависимое от возраста накопление рекомбинантных клеток в поджелудочной железе мышей, выявленное с помощью флуоресцентной визуализации in situ. Proc Natl Acad Sci U S A 103: 11862–7. pmid: 16882718
  9. 8.Эймс Б.Н., Сигенага М.К., Gold LS. (1993) Повреждения ДНК, индуцируемая репарация ДНК и деление клеток: три ключевых фактора мутагенеза и канцерогенеза. Перспектива здоровья окружающей среды. 101 Дополнение 5: 35–44. pmid: 8013423
  10. 9. Серил Д.Н., Ляо Дж., Ян Г.Ю., Ян К.С. (2003) Окислительный стресс и канцерогенез, связанный с язвенным колитом: исследования на моделях людей и животных. Канцерогенез 24: 353–62. pmid: 12663492
  11. 10. Фарази П.А., ДеПиньо РА. (2006) Патогенез гепатоцеллюлярной карциномы: от генов к окружающей среде.Nat Rev Cancer 6: 674–87. pmid: 16929323
  12. 11. Фэрроу Б., Эверс Б.М. (2002) Воспаление и развитие рака поджелудочной железы. Surg Oncol. 10: 153–69. pmid: 12020670
  13. 12. Loeb LA. (2011) Раковые опухоли человека выражают мутаторные фенотипы: происхождение, последствия и адресность. Nat Rev Cancer 11: 450–7. pmid: 21593786
  14. 13. Фокс EJ, Prindle MJ, Loeb LA. (2013) Подпитывают ли мутаторные мутации канцерогенез? Метастазы рака Rev. 32: 353–61.pmid: 235
  15. 14. Xie K, Doles J, Hemann MT, Walker GC. (2010) Склонный к ошибкам синтез трансфузии опосредует приобретенную химиорезистентность. Proc Natl Acad Sci U S A 107: 20792–7. pmid: 21068378
  16. 15. Boland CR, Goel A. (2010) Нестабильность микросателлитов при колоректальном раке. Гастроэнтерология 138: 2073–2087.e3. pmid: 20420947
  17. 16. Maisonneuve P, Lowenfels AB. (2002) Хронический панкреатит и рак поджелудочной железы. Dig Dis. 20: 32–7.pmid: 12145418
  18. 17. Де Ла Круз М.С., Янг А.П., Раффин М.С. (2014) Диагностика и лечение рака поджелудочной железы. Am Fam Physician 89: 626–32. pmid: 24784121
  19. 18. Лонкар П., Дедон ПК. (2011) Реактивные виды и повреждение ДНК при хроническом воспалении: согласование химических механизмов и биологических судеб. Int J Cancer 128: 1999–2009. pmid: 21387284
  20. 19. Marnett LJ. (2002) Оксирадикалы, перекисное окисление липидов и повреждение ДНК. Токсикология.181–182: 219–22. pmid: 12505314
  21. 20. Hoeijmakers JH. (2009) Повреждение ДНК, старение и рак. N Engl J Med. 361: 1475–85. pmid: 19812404
  22. 21. Хелледей Т., Ло Дж., Ван Гент, округ Колумбия, Энгелвард Б.П. (2007) Восстановление двухцепочечных разрывов ДНК: от понимания механизмов до лечения рака. Ремонт ДНК (Amst) 6: 923–35. pmid: 17363343
  23. 22. Mimitou EP, Symington LS (2008) Sae2, Exo1 и Sgs1 сотрудничают в процессинге двухцепочечных разрывов ДНК.Природа 455: 770–774. pmid: 18806779
  24. 23. Zhu Z, Chung WH, Shim EY, Lee SE, Ira G (2008) Геликаза Sgs1 и две нуклеазы Dna2 и Exo1 резектируют концы двухцепочечных разрывов ДНК. Cell 134: 981–994. pmid: 18805091
  25. 24. Николетт М.Л., Ли К., Го З., Рани М., Чоу Дж. М. и др. (2010) Mre11-Rad50-Xrs2 и Sae2 способствуют резекции 5’-цепи двухцепочечных разрывов ДНК. Nat Struct Mol Biol. 17: 1478–85. pmid: 21102445
  26. 25. Гарсия В., Фелпс С.Е., Грей С., Нил М.Дж.(2011) Двунаправленная резекция двухцепочечных разрывов ДНК с помощью Mre11 и Exo1. Природа 479: 241–4. pmid: 22002605
  27. 26. Sung P, Robberson DL (1995) Обмен нити ДНК, опосредованный филаментом нуклеопротеина RAD51-ssDNA с полярностью, противоположной полярности RecA. Ячейка 82: 453–461. pmid: 7634335
  28. 27. Benson FE, Stasiak A, West SC (1994) Очистка и характеристика человеческого белка Rad51, аналога E. coli RecA. Embo J 13: 5764–5771. pmid: 7988572
  29. 28.Wong JM, Ionescu D, Ingles CJ (2003) Взаимодействие между BRCA2 и репликационным белком A нарушено предрасполагающей к раку мутацией в BRCA2. Онкоген 22: 28–33. pmid: 12527904
  30. 29. Davies AA, Masson JY, McIlwraith MJ, Stasiak AZ, Stasiak A, et al. (2001) Роль BRCA2 в контроле рекомбинации RAD51 и белка репарации ДНК. Mol Cell 7: 273–282. pmid: 11239456
  31. 30. Thorslund T, West SC (2007) BRCA2: универсальный регулятор рекомбиназы.Онкоген 26: 7720–7730. pmid: 18066084
  32. 31. Икбал Дж., Рагон А., Любински Дж., Линч Х. Т., Моллер П. и др. (2012) Заболеваемость раком поджелудочной железы у носителей мутаций BRCA1 и BRCA2. Br J Cancer 107: 2005–9. pmid: 23099806
  33. 32. Скулидис Ф., Кэссиди Л.Д., Писупати В., Джонассон Дж. Г., Бьярнасон Х. и др. (2010) Гетерозиготность Brca2 зародышевой линии способствует канцерогенезу, обусловленному Kras (G12D), на мышиной модели семейного рака поджелудочной железы. Cancer Cell 18: 499–509.pmid: 21056012
  34. 33. Епископ AJ, Schiestl RH. (2000) Гомологичная рекомбинация как механизм перестройки генома: экологические и генетические эффекты. Hum Mol Genet. 9: 2427–334. pmid: 11005798
  35. 34. Гу В, Чжан Ф, Лупски-младший. (2008) Механизмы геномных перестроек человека. Патогенетика 1: 4. pmid: 1
  36. 68
  37. 35. Костантино Л., Сотириу С.К., Рантала Дж. К., Магин С., Младенов Е. и др. (2014) Вызванная разрывом репликационная репарация поврежденных вилок вызывает геномные дупликации в клетках человека.Science 343: 88–91. pmid: 24310611
  38. 36. Пал Дж., Берто Р., Буон Л., Кази А., Батчу Р. Б. и др. (2011) Геномная эволюция в клетках аденокарциномы Барретта: критическая роль повышенного hsRAD51, гомологичной рекомбинации и последовательностей Alu в геноме. Онкоген 30: 3585–98. pmid: 21423218
  39. 37. Strout MP, Marcucci G, Bloomfield CD, Калиджури, Массачусетс. (1998) Частичная тандемная дупликация ALL1 (MLL) последовательно генерируется Alu-опосредованной гомологичной рекомбинацией при остром миелоидном лейкозе.Proc Natl Acad Sci U S A 95: 2390–5. pmid: 9482895
  40. 38. Morley AA, Grist SA, Turner DR, Kutlaca A, Bennett G. (1990) Молекулярная природа мутаций in vivo в человеческих клетках в аутосомном локусе HLA-A. Cancer Res. 50: 4584–7. pmid: 2369733
  41. 39. Гупта П.К., Сахота А., Бояджиев С.А., Бай С., Шао С. и др. (1997) Высокая частота потери гетерозиготности in vivo в первую очередь является следствием митотической рекомбинации. Cancer Res. 57: 1188–93. pmid: 91
  42. 40.Шао С., Дэн Л., Хенегариу О, Лян Л., Райквар Н. и др. (1999) Митотическая рекомбинация дает большинство вариантов рецессивных фибробластов у гетерозиготных мышей. Proc Natl Acad Sci U S A 96: 9230–5 pmid: 10430925
  43. 41. Джеймс С.Д., Карлбом Э., Норденшельд М., Коллинз В.П., Кавени В.К. (1989) Митотическая рекомбинация хромосомы 17 в астроцитомах. Proc Natl Acad Sci U S A 86: 2858–62. pmid: 2565039
  44. 42. Hagstrom SA, Dryja TP. (1999) Карта митотической рекомбинации 13cen-13q14, полученная в результате исследования потери гетерозиготности в ретинобластомах.Proc Natl Acad Sci U S A 96: 2952–7. pmid: 10077618
  45. 43. Хикс В.М., Ким М., Хабер Дж. Э. (2010) Усиленный мутагенез и уникальная сигнатура мутации, связанная с конверсией митотического гена. Наука 329: 82–5. pmid: 20595613
  46. 44. Себеста М., Буркович П., Юхас С., Чжан С., Сабо Дж. Э. и др. (2013) Роль полимераз PCNA и TLS в удлинении D-петли во время гомологичной рекомбинации у людей. Ремонт ДНК (Amst) 12: 691–8. pmid: 23731732
  47. 45.Кавамото Т., Араки К., Сонода Э., Ямасита Ю.М., Харада К. и др. (2005) Двойная роль ДНК-полимеразы eta в гомологичной рекомбинации ДНК и транслезионном синтезе ДНК. Mol Cell 20: 793–9. pmid: 16337602
  48. 46. Holbeck SL, Strathern JN. (1997) Роль REV3 в мутагенезе во время репарации двухцепочечных разрывов у Saccharomyces cerevisiae. Генетика 147: 1017–24. pmid: 9383049
  49. 47. Буиссон Р., Нирадж Дж., Поути Дж., Мэйти Р., Чжао В. и др. (2014) Белки рака молочной железы PALB2 и BRCA2 стимулируют полимеразу η в связанном с рекомбинацией синтезе ДНК в блокированных репликационных вилках.Cell Rep. 6: 553–64. pmid: 24485656
  50. 48. Sharma S, Hicks JK, Chute CL, Brennan JR, Ahn JY и др. (2012) REV1 и полимераза ζ способствуют восстановлению гомологичной рекомбинации. Nucleic Acids Res. 40: 682–91. pmid: 21
  51. 0
  52. 49. Hendricks CA, Almeida KH, Stitt MS, Jonnalagadda VS, Rugo RE и др. (2003) Спонтанная митотическая гомологичная рекомбинация на прямом повторе кДНК усиленного желтого флуоресцентного белка (EYFP) у трансгенных мышей. Proc Natl Acad Sci U S A 100: 6325–30.pmid: 12750464
  53. 50. Джонналагадда В.С., Мацугути Т., Энгелвард Б.П. (2005) Гомологичная рекомбинация, индуцированная межнитевым сшиванием, несет повышенный риск делеций и вставок. Ремонт ДНК (Amst) 4: 594–605. pmid: 15811631
  54. 51. Виктор-Браун Д.М., Квон Х.С., Нам Ю.С., Со ПТ, Энгелвард Б.П. (2008) Интегрированная платформа одно- и двухфотонной визуализации показывает, что клональная экспансия является основным фактором нагрузки мутаций. Proc Natl Acad Sci U S A 105: 10314–9. pmid: 18647827
  55. 52.Hecht SS. (1997) Подходы к профилактике рака, основанные на понимании канцерогенеза N-нитрозаминов. Proc Soc Exp Biol Med. 216: 181–91. pmid: 9349687
  56. 53. Kuhnle GG, Bingham SA. (2007) Диетическое мясо, эндогенное нитрозирование и колоректальный рак. Biochem Soc Trans. 35: 1355–7 pmid: 17956350
  57. 54. Stettler PM, Sengstag C. (2001) Канцероген печени афлатоксин B1 как индуктор митотической рекомбинации в линии клеток человека. Mol Carcinog.31: 125–38. pmid: 11479921
  58. 55. Fu D, Calvo JA, Samson LD. (2012) Баланс восстановления и толерантности к повреждению ДНК, вызванному алкилирующими агентами. Nat Rev Cancer 12: 104–20. pmid: 22237395
  59. 56. Нидерау С, Феррелл Л.Д., Гренделл Дж. Х. (1985) Острый некротический панкреатит, индуцированный церулеином, у мышей: защитные эффекты проглумида, бензотрипта и секретина. Гастроэнтерология 88: 1192–204. pmid: 2984080
  60. 57. Салуджа А.К., Лерх М.М., Филлипс П.А., Дудея В.(2007) Почему чрезмерная стимуляция поджелудочной железы вызывает панкреатит? Annu Rev Physiol. 69: 249–69. pmid: 17059357
  61. 58. Дедон ПК, Танненбаум СР. (2004) Активные формы азота в химической биологии воспаления. Arch Biochem Biophys. 423: 12–22. pmid: 14989259
  62. 59. Бурни С., Тамир С., Гал А., Танненбаум С.Р. (1997) Механистический анализ клеточной токсичности, вызванной оксидом азота. Оксид азота 1: 130–44. pmid: 9701052
  63. 60. Кизилтепе Т., Ян А., Донг М., Джонналагадда В.С., Дедон ПК и др.(2005) Определение химических путей, лежащих в основе индуцированной оксидом азота гомологичной рекомбинации в клетках млекопитающих. Chem Biol 12: 357–69. pmid: 15797220
  64. 61. Паулл Т.Т., Рогаку Е.П., Ямазаки В., Кирхгесснер К.Ю., Геллерт М. и др. (2000) Критическая роль гистона h3AX в рекрутировании факторов репарации в ядерные очаги после повреждения ДНК. Curr Biol. 10: 886–95. pmid: 10959836
  65. 62. Sweetser DB, Hough H, Whelden JF, Arbuckle M, Nickoloff JA. (1994) Картирование с высоким разрешением участков генной конверсии, вызванных спонтанным и двухцепочечным разрывом у Saccharomyces cerevisiae, выявляет полярность обратимой митотической конверсии.Mol Cell Biol. 14: 3863–75. pmid: 8196629
  66. 63. Rouet P, Smih F, Jasin M. (1994) Введение двухцепочечных разрывов в геном мышиных клеток путем экспрессии эндонуклеазы с редкими разрезами. Mol Cell Biol. 14: 8096–106. pmid: 7969147
  67. 64. Wiktor-Brown DM, Hendricks CA, Olipitz W, Rogers AB, Engelward BP (2006) Применение флуоресценции для обнаружения редких перестроек последовательностей in vivo. Клеточный цикл 5: 2715–9. pmid: 17172860
  68. 65.Виктор-Браун Д.М., Сукуп-Джексон М.Р., Фахралдин С.А., Хендрикс Калифорния, Энгелвард Б.П. (2011) мыши с нулевым флуоресцентным желтым прямым повтором (FYDR) p53 имеют нормальные уровни гомологичной рекомбинации. Ремонт ДНК (Amst) 10: 1294–9. pmid: 21993421
  69. 66. Mientjes EJ, Luiten-Schuite A, van der Wolf E, Borsboom Y, Bergmans A, et al. (1998) ДНК-аддукты, частоты мутантов и спектры мутаций в различных органах мышей лямбда-lacZ, подвергнутых воздействию этилирующих агентов. Environ Mol Mutagen.31: 18–31. pmid: 9464312
  70. 67. Карр Г.Дж., Горелик, штат Нью-Джерси. (1995) Статистический дизайн и анализ исследований мутаций у трансгенных мышей. Environ Mol Mutagen. 25: 246–55. pmid: 7737142
  71. 68. Пигорш В.В., Локхарт А.С., Карр Г.Дж., Марголин Б.Х., Брукс Т. и др. (1997) Источники изменчивости данных анализа мутации трансгенных мышей с положительным отбором lacZ: межлабораторное исследование. Mutat Res. 388: 249–89. pmid:

    87

  72. 69. Фунг К.Ю., Дуглас Г.Р., Кревски Д.(1998) Статистический анализ данных о частоте мутантов lacZ из анализов мутагенности MutaMouse. Мутагенез 13: 249–55. pmid: 9643583
  73. 70. Бидербик А., Эльзэссер Х. (1998) Суточный характер репликации ацинарных клеток поджелудочной железы крысы. Cell Tissue Res. 291: 277–83. pmid: 9426314
  74. 71. Scholzen T, Gerdes J. (2000) Белок Ki-67: из известного и неизвестного. J. Cell Physiol. 182: 311–22. pmid: 10653597
  75. 72. Винсент А., Герман Дж., Шулик Р., Хрубан Р. Х., Гоггинс М.(2011) Рак поджелудочной железы. Ланцет 378: 607–20. pmid: 21620466
  76. 73. Weiss FU. (2014) Риск рака поджелудочной железы при наследственном панкреатите. Front Physiol. 5: 70. pmid: 24600409
  77. 74. Андерсен Н.Н., Джесс Т. (2013) Снизился ли риск развития колоректального рака при воспалительном заболевании кишечника? Мир Дж. Гастроэнтерол. 19: 7561–8. pmid: 24282346
  78. 75. Диздароглу М. (2012) Окислительное повреждение ДНК: механизмы, репарация и болезнь. Cancer Lett.327: 26–47. pmid: 22293091
  79. 76. Уоллес СС. (2002) Биологические последствия поврежденных свободными радикалами оснований ДНК. Free Radic Biol Med. 33: 1–14. pmid: 12086677
  80. 77. Дедон ПК, Танненбаум СР. (2004) Активные формы азота в химической биологии воспаления. Arch Biochem Biophys. 423: 12–22. pmid: 14989259
  81. 78. Cooke MS, Evans MD, Dizdaroglu M, Lunec J. (2003) Окислительное повреждение ДНК: механизмы, мутации и болезни. FASEB J.17: 1195–214. pmid: 12832285
  82. 79. Накабеппу Ю., Сакуми К., Сакамото К., Цучимото Д., Цузуки Т. и др. (2006) Мутагенез и канцерогенез, вызванные окислением нуклеиновых кислот. Biol Chem. 387: 373–9. pmid: 16606334
  83. 80. Ван Д., Крейцер Д.А., Эссигманн Дж. М.. (1998) Мутагенность и восстановление окислительного повреждения ДНК: выводы из исследований с использованием определенных повреждений. Mutat Res. 400: 99–115. pmid: 9685598
  84. 81. Бьелланд С., Сиберг Э.(2003) Мутагенность, токсичность и восстановление повреждений оснований ДНК, вызванных окислением. Mutat Res. 531: 37–80. pmid: 14637246
  85. 82. Секигучи М., Цузуки Т. (2002) Окислительное повреждение нуклеотидов: последствия и профилактика. Онкоген. 21: 8895–904. pmid: 12483507
  86. 83. Haracska L, Prakash L, Prakash S. (2002) Роль каппа-полимеразы ДНК человека как расширителя в синтезе транслезии. Proc Natl Acad Sci U S A. 99: 16000–5. pmid: 12444249
  87. 84. Маккаллох С.Д., Кокоска Р.Дж., Гарг П., Бургерс П.М., Кункель Т.А.(2009) Эффективность и надежность обхода 8-оксогуанина с помощью ДНК-полимераз дельта и эта. Nucleic Acids Res. 37: 2830–40. pmid: 19282446
  88. 85. Фортини П., Паскуччи Б., Парланти Э., Д’Эррико М., Симонелли В. и др. (2003) Повреждение ДНК 8-оксогуанина: на перекрестке альтернативных путей репарации. Mutat Res. 531: 127–39. pmid: 14637250
  89. 86. Доу Х, Митра С, Хазра Т.К. (2003) Ремонт окисленных оснований в пузырьковых структурах ДНК человеческими ДНК-гликозилазами NEIL1 и NEIL2.J Biol Chem. 278: 49679–84. pmid: 14522990
  90. 87. Лю М., Бандару В., Бонд Дж. П., Яруга П., Чжао Х и др. (2010) Мышиный ортолог NEIL3 представляет собой функциональную ДНК-гликозилазу in vitro и in vivo. Proc Natl Acad Sci U S. 107: 4925–30. pmid: 20185759
  91. 88. Maki H, Sekiguchi M. (1992) Белок MutT специфически гидролизует мощный мутагенный субстрат для синтеза ДНК. Природа. 355: 273–5.i pmid: 1309939
  92. 89. Тадзири Т., Маки Х., Секигучи М.(1995) Функциональное сотрудничество белков MutT, MutM и MutY в предотвращении мутаций, вызванных спонтанным окислением гуанинового нуклеотида в Escherichia coli. Mutat Res. 336: 257–67. pmid: 7739614
  93. 90. Нгием И, Кабрера М, Купплс К.Г., Миллер Дж. Х. (1988) Ген mutY: мутаторный локус в Escherichia coli, который генерирует трансверсии G.C —- T.A. Proc Natl Acad Sci U S. 85: 2709–13. pmid: 3128795
  94. 91. Руссо М.Т., Де Лука Дж., Казорелли I, Деган П., Молаторе С. и др.(2009) Роль MUTYH и MSh3 в контроле окислительного повреждения ДНК, генетической нестабильности и туморогенеза. Cancer Res. 69: 4372–9. pmid: 19435918
  95. 92. Кабелоф Д.К., Го З., Раффул Дж.Дж., Соболь Р.В., Уилсон С.Х. и др. (2003) Дефицит эксцизионной репарации оснований, вызванный гаплонедостаточностью полимеразы бета: ускоренное повреждение ДНК и усиление мутационной реакции на канцерогены. Cancer Res. 63: 5799–807. pmid: 14522902
  96. 93. Ларсен Э., Рейте К., Нессе Г., Гран С, Сиберг Э. и др.(2006) Ремонт и мутагенез окисленных повреждений ДНК в развивающемся мозге мышей дикого типа и мышей Ogg1 — / -. Онкоген. 25: 2425–32. pmid: 16369492
  97. 94. Клунгланд А., Розуэлл И., Холленбах С., Ларсен Э., Дали Г. и др. (1999) Накопление премутагенных повреждений ДНК у мышей, дефектных в удалении повреждений окислительного основания. Proc Natl Acad Sci U S. A. 96: 13300–5. pmid: 10557315
  98. 95. Сато Ю., Такахаши С., Киноути Ю., Шираки М., Эндо К. и др. (2006) Дефицит IL-10 приводит к соматическим мутациям в модели IBD.Канцерогенез. 27: 1068–73. pmid: 16407368
  99. 96. Sheh A, Lee CW, Masumura K, Rickman BH, Nohmi T, Wogan GN, Fox JG, Schauer DB. (2010) Мутагенная активность Helicobacter pylori в слизистой оболочке желудка мышей определяется полом и продолжительностью инфекции. Proc Natl Acad Sci U S. A. 107 (34): 15217–22. pmid: 20699385
  100. 97. Моторна О.О., Мартин Х., Джентиле Дж. Дж., Джентиле Дж. М.. (2001) Анализ мутаций lacI у трансгенных мышей Big Blue, подвергшихся паразитно-индуцированному воспалению.Mutat Res.484: 69–76. pmid: 11733073
  101. 98. Туати Э., Мишель В., Тиберж Дж. М., Вушер Н., Уэрре М. и др. (2003) Хронические инфекции Helicobacter pylori вызывают мутации желудка у мышей. Гастроэнтерология. 124: 1408–19. pmid: 12730880
  102. 99. Араи Т., Келли В.П., Коморо К., Минова О., Нода Т. и др. (2003) Клеточная пролиферация в печени мышей с дефицитом Mmh / Ogg1 увеличивает частоту мутаций из-за присутствия 8-гидроксигуанина в ДНК. Cancer Res. 63: 4287–92.pmid: 12874039
  103. 100. Schiestl RH. (1989) Немутагенные канцерогены вызывают внутрихромосомную рекомбинацию у дрожжей. Природа. 337: 285–8. pmid: 2643057
  104. 101. Сазерленд Б.М., Беннетт П.В., Георгакилас А.Г., Сазерленд Дж.С. (2003) Оценка анализа среднечисленной длины при количественной оценке двухцепочечных разрывов в геномной ДНК. Биохимия 42: 3375–84. pmid: 12641470
  105. 102. Коломиц Э., Мейн М.С., Пандита А., Сквайр Дж. (2002) Роль кластеров Alu-повторов как медиаторов повторяющихся хромосомных аберраций в опухолях.Гены Хромосомы Рак. 35: 97–112. pmid: 12203773
  106. 103. Фредерик Л., Эли Дж., Ван XY, Джеймс С.Д. (2000) Анализ геномных перестроек, связанных с экспрессией EGRFvIII, предполагает участие повторяющихся элементов Alu. Neuro Oncol. 2: 159–63. pmid: 11302336
  107. 104. Слебос Р.Дж., Резник М.А., Тейлор Дж.А. (1998) Инактивация гена-супрессора опухоли p53 посредством новой реаранжировки Alu. Cancer Res. 58: 5333–6. pmid: 9850060
  108. 105. Се С.Ю., Чен В.Й., Йе Т.С., Шин И.С., Хуанг С.Ф.(2005) Высокочастотная Alu-опосредованная геномная рекомбинация / делеция в гене ДНКазы, активируемой каспазой, в гепатоме человека. Онкоген. 24: 6584–9. pmid: 16007181
  109. 106. Кирали О, Гонг Дж., Ройтман М.Д., Ямада Ю., Самсон Л.Д., Энгелвард Б.П. (2014) Активность ДНК-гликозилазы и пролиферация клеток являются ключевыми факторами в модуляции гомологичной рекомбинации in vivo. Канцерогенез. 35: 2495–2502. pmid: 25155011
  110. 107. Morton SW, Lee MJ, Deng ZJ, Dreaden EC, Siouve E, et al.(2014) Система доставки комбинированной химиотерапии на основе наночастиц для усиленного уничтожения опухолей за счет динамической перестройки сигнальных путей. Sci Signal. 7: ra44. pmid: 24825919
  111. 108. Герра С., Шухмахер А.Дж., Каньямеро М., Гриппо П.Дж., Вердагер Л. и др. (2007) Хронический панкреатит необходим для индукции аденокарциномы протока поджелудочной железы онкогенами K-Ras у взрослых мышей. Раковая клетка 11: 291–302. pmid: 17349585

Постоянно активированные, аутореактивные В-клетки пролиферативной памяти способствуют воспалению при ревматоидном артрите

В-клетки плохо себя ведут

Антитела к антицитруллинированному белку (АСРА) присутствуют у многих людей с воспалительным заболеванием суставов ревматоидным артритом (РА).Здесь Kristyanto et al. исследовали роль ACPA-положительных В-клеток в патогенезе РА. ACPA-положительные В-клетки имели активированный фенотип у людей с РА, а также присутствовали у людей с болью в суставах с риском развития РА. ACPA-положительные B-клетки подавляли ингибирующий рецептор CD32 и продуцировали воспалительные цитокины, рекрутирующие нейтрофилы, включая интерлейкин 8. Результаты показывают функциональную роль аутореактивных B-клеток в патогенезе RA.

Abstract

Аутореактивные В-клетки опосредуют аутоиммунную патологию, но как именно, остается неизвестным.Отличительной чертой ревматоидного артрита (РА), распространенного аутоиммунного заболевания, является наличие специфических для данного заболевания антител к антицитруллинированному белку (ACPA). Здесь мы показали, что ACPA-положительные В-клетки у пациентов с РА сильно экспрессируют Т-клеточно-стимулирующие лиганды, продуцируют большое количество провоспалительных цитокинов и пролиферируют, избегая подавляющих сигналов. Это активированное состояние было обнаружено в разной степени на разных стадиях заболевания: наивысшее у пациентов с недавно начавшимся РА, умеренное у пациентов с установленным РА и гораздо менее выраженное у ACPA-положительных лиц «из группы риска» развития заболевания.Активированный аутореактивный B-клеточный ответ сохранялся у пациентов, достигших клинической ремиссии при традиционном лечении. ACPA-положительные В-клетки в крови и синовиальной жидкости секретируют повышенное количество хемоаттрактанта интерлейкина-8, который привлекает нейтрофилы, наиболее распространенные иммунные клетки в суставах, пораженных артритом. В-клетки, специфичные для столбнячного анатоксина, от тех же пациентов проявляли свойства В-клеток памяти без фенотипа активации и пролиферации, но эти клетки временно приобрели аналогичный пролиферативный фенотип после повторной вакцинации.В совокупности эти данные показали, что непрерывный антигенный запуск аутореактивных В-клеток происходит при аутоиммунных заболеваниях человека, и поддерживают новую концепцию иммунологической активности, которая сохраняется при лечении даже в клинической ремиссии, что может пересмотреть нашу текущую концепцию целей лечения для будущих терапевтических вмешательств. Кроме того, наши данные указывают на патогенную роль ACPA-положительных В-клеток в воспалительном процессе заболевания, лежащем в основе РА, и отдают предпочтение подходам, направленным на их антиген-специфическую инактивацию или истощение.

  • Copyright © 2020 Авторы, некоторые права защищены; эксклюзивный лицензиат Американской ассоциации содействия развитию науки. Отсутствие претензий к оригинальным работам правительства США

Четыре этапа заживления ран

Редакция WoundSource

Этапы заживления ран проходят организованно и следуют четырем процессам: гемостаз, воспаление, разрастание и созревание. Хотя стадии заживления ран являются линейными, раны могут прогрессировать вперед или назад в зависимости от внутренних и внешних условий пациента.Четыре стадии заживления ран:

Фаза гемостаза

Гемостаз — это процесс закрытия раны путем свертывания. Гемостаз начинается при утечке крови из организма. Первым этапом гемостаза является сужение кровеносных сосудов для ограничения кровотока. Затем тромбоциты слипаются, чтобы закрыть разрыв в стенке кровеносного сосуда. Наконец, происходит коагуляция, которая укрепляет пробку тромбоцитов нитями фибрина, которые подобны молекулярному связывающему агенту.Стадия гемостаза заживления раны происходит очень быстро. Тромбоциты прикрепляются к поверхности субэндотелия в течение нескольких секунд после разрыва эпителиальной стенки кровеносного сосуда. После этого первые нити фибрина начинают слипаться примерно через шестьдесят секунд. Когда начинается фибриновая сетка, кровь превращается из жидкости в гель за счет прокоагулянтов и высвобождения протромбина. Образование тромба или сгустка удерживает тромбоциты и клетки крови в области раны. Тромб обычно важен на этапах заживления ран, но становится проблемой, если он отделяется от стенки сосуда и проходит через систему кровообращения, что может вызвать инсульт, тромбоэмболию легочной артерии или сердечный приступ.

Воспалительная фаза

Воспаление — это вторая стадия заживления ран, которая начинается сразу после травмы, когда из поврежденных кровеносных сосудов выходит транссудат (состоящий из воды, соли и белка), вызывая локальный отек. Воспаление контролирует кровотечение и предотвращает инфицирование. Накопление жидкости позволяет заживающим и восстанавливающим клеткам перемещаться к месту раны. Во время воспалительной фазы поврежденные клетки, патогены и бактерии удаляются из области раны. Эти лейкоциты, факторы роста, питательные вещества и ферменты вызывают отек, жар, боль и покраснение, обычно наблюдаемые на этой стадии заживления ран.Воспаление — естественная часть процесса заживления раны, и проблема только в том случае, если она продолжительна или чрезмерна.

Пролиферативная фаза

Пролиферативная фаза заживления раны — это когда рана восстанавливается новой тканью, состоящей из коллагена и внеклеточного матрикса. В фазе пролиферации рана сокращается по мере образования новых тканей. Кроме того, необходимо построить новую сеть кровеносных сосудов, чтобы грануляционная ткань могла быть здоровой и получать достаточно кислорода и питательных веществ.Миофибробласты заставляют рану сокращаться, захватывая края раны и стягивая их вместе, используя механизм, аналогичный механизму гладкомышечных клеток. На здоровых стадиях заживления ран грануляционная ткань имеет розовый или красный цвет и неровную текстуру. Кроме того, здоровая грануляционная ткань не кровоточит. Темная грануляционная ткань может быть признаком инфекции, ишемии или плохой перфузии. В заключительной фазе пролиферативной стадии заживления раны эпителиальные клетки повторно покрывают рану. Важно помнить, что эпителизация происходит быстрее, если раны остаются влажными и увлажненными.Как правило, при наложении окклюзионных или полуокклюзионных повязок в течение 48 часов после травмы они будут поддерживать правильную влажность тканей для оптимизации эпителизации.

Фаза созревания

Также называемая стадией ремоделирования заживления ран, фаза созревания — это когда коллаген ремоделируется с типа III на тип I, и рана полностью закрывается. Клетки, которые использовались для восстановления раны, но которые больше не нужны, удаляются апоптозом или запрограммированной гибелью клеток. Когда коллаген откладывается во время фазы пролиферации, он дезорганизован и рана становится толстой.Во время фазы созревания коллаген выравнивается по линиям натяжения, а вода реабсорбируется, поэтому волокна коллагена могут располагаться ближе друг к другу и сшиваться. Поперечное сшивание коллагена уменьшает толщину рубца, а также делает кожу более прочной. Как правило, реконструкция начинается примерно через 21 день после травмы и может продолжаться в течение года или более. Даже при сшивании зажившие участки раны остаются более слабыми, чем неповрежденная кожа, обычно имея только 80% прочности на разрыв неповрежденной кожи.

Этапы заживления ран — сложный и хрупкий процесс. Отсутствие прогресса в стадиях заживления ран может привести к хроническим ранам. Факторами, ведущими к хроническим ранам, являются заболевания вен, инфекции, диабет и нарушение обмена веществ у пожилых людей. Тщательный уход за раной может ускорить этапы заживления ран, сохраняя их влажными, чистыми и защищенными от повторных травм и инфекции.

Воспалительные, пролиферативные и неопластические поражения на месте металлических идентификационных ушных бирок у крыс Wistar [Crl: (WI) BR]

Аннотация

Во время 2-летнего исследования канцерогенеза с помощью CdCl 2 у самцов крыс Wistar [Crl: (WI) BR] еженедельные клинические наблюдения в течение последних 6 месяцев исследования выявили много случаев стойких опухолевидных масс на участке. металлических идентификационных меток в ушах животных.Всего у 168 крыс было диагностировано 14 опухолей (в основном сложные остеосаркомы). Гистологически почти у 90% крыс в этом исследовании (далее именуемом «Исследование I») были обнаружены некоторые значительные повреждения на участке метки, включая различные степени хронического воспаления, хондрозную гиперплазию и костную метаплазию перистальтического хряща. В отличие от этого, только две опухоли были обнаружены у 193 животных во втором исследовании (исследование II) на той же линии крыс, и только у 56% крыс были поражения на участке метки.Высокая частота (> 25%) клинически тяжелого воспаления на участке метки наблюдалась в начале исследования I и сохранялась в течение первых 6 месяцев исследования, тогда как частота таких реакций в исследовании II никогда не превышала 1%. Элементный анализ меток не дал объяснения различий между двумя исследованиями, поскольку метки, использованные в обоих исследованиях, были одного и того же состава, преимущественно из никеля и меди. Металлические внутренние протезы вызывают местные злокачественные новообразования у людей и животных, и настоящие наблюдения предоставляют дополнительные доказательства опасности, создаваемой такими устройствами в месте длительного контакта с тканями.Эти данные свидетельствуют о том, что стойкая тканевая реакция может быть важным фактором развития опухоли.

Сноски

  • 1 Кому следует направлять запросы на перепечатку, в Лаборатории сравнительного канцерогенеза, Национальный институт рака, Центр исследования рака Фредерика, здание 538, комната 205E, Фредерик, Мэриленд 21701.

  • Получено 23 сентября 1986 г.
  • Исправление получено 22 января 1987 г.
  • Принято 29 января 1987 г.
  • © 1987 Американская ассоциация исследований рака.

Потеря эпителиального RelA приводит к нарушению регуляции кишечного пролиферативного / апоптотического гомеостаза и предрасположенности к воспалению

Реферат

NF-κB играет центральную провоспалительную роль в хроническом воспалении кишечника, однако недавняя работа предполагает преимущественно защитную функцию этой группы факторов транскрипции в некоторых типах клеток кишечника. В настоящем документе мы описываем условную делецию гена NF-κB RelA в эпителии кишечника мышей и определяем его функцию в гомеостатическом контроле пролиферации / апоптоза энтероцитов и восприимчивости к воспалению толстой кишки.Мыши, лишенные RelA в энтероцитах подвздошной и толстой кишки, родились с ожидаемым менделевским соотношением, и RelA-нулевой эпителий дифференцировался нормально. Спонтанное кишечное заболевание и смерть произошли с низкой пенетрантностью у новорожденных без эпителиального RelA. IκBα и IκBβ были значительно уменьшены в RelA-нулевом эпителии, а провокация эндотоксином выявила повышенную активность связывания ДНК p50 и c-Rel по сравнению с контролем. Делеция RelA привела к снижению экспрессии антимикробных (связанный с дефенсином криптдин 4, связанный с дефенсином криптдин 5, RegIIIγ) и антиапоптотических генов прореституции (Bcl-x L , RegIV, IL-11, IL-18) и базальных скорость апоптоза и пролиферации эпителия была повышена.Мыши, лишенные RelA толстой кишки, были чувствительны к колиту, вызванному декстрансульфатом натрия. Хотя экспериментальный колит усиливал пролиферацию клеток, лишенных RelA, устойчивый апоптоз эпителиальных клеток препятствовал заживлению слизистой оболочки и уменьшал выживаемость животных. Мы пришли к выводу, что активация RelA необходима для гомеостатической регуляции гибели и деления клеток в кишечном эпителии, а также для защиты от развития тяжелого острого воспаления кишечника.

Контроль экспрессии генов с помощью NF-κB необходим для соответствующих клеточных ответов на широкий спектр стимулов и часто, по-видимому, играет противоречивую роль в инициировании и разрешении воспалительного заболевания (1, 2, 3).NF-κB функционирует как димерный фактор транскрипции, субъединицами которого являются RelA, RelB, c-Rel, p50 / NF-κB1 и p52 / NF-κB2. Гетеродимеры RelA / p50 являются первичными медиаторами экспрессии гена-мишени NF-κB, хотя функциональная избыточность может быть возможна за счет вклада c-Rel или RelB (4, 5). В нестимулированном состоянии NF-κB изолируется в цитоплазме за счет ассоциации с ингибиторами κB (IκBα, IκBβ, IκBε, NF-κB1 и NF-κB2). После сигнально-зависимого фосфорилирования и протеолиза белки IκB высвобождают димер NF-κB для накопления в ядре и связывания ДНК.Считается, что достаточные стабильные уровни и своевременный ресинтез IκB имеют решающее значение для надлежащего временного контроля экспрессии генов, опосредованной NF-κB (6, 7). Активация NF-κB, например, индуцированная TNF-α, в значительной степени зависит от активности белков киназы IκB (IKK) 3 (2). Комплекс IKK обычно состоит из IKKα и IKKβ, которые обладают ферментативной активностью, и IKKγ / NEMO, который необходим для образования комплекса и стабильности. Эти белки охватывают большую часть, но не всю активность киназы IκB клетки (2).Сложная взаимосвязь между активностью IKK и регуляцией NF-κB особенно актуальна для воспалительного заболевания, при котором могут быть индуцированы множественные пути активации NF-κB, как опосредованные IKK, так и независимые от IKK (8).

Накапливающиеся данные показывают, что у генетически предрасположенных людей исходными событиями хронического рецидивирующего воспаления кишечника может быть патологический синергизм между дефектными врожденными иммунными ответами и неконтролируемой мононуклеарной lamina propria и активацией Т-клеток (9).Монослой кишечных эпителиальных клеток (IEC) необходим для врожденного иммунитета слизистой оболочки благодаря его роли в барьерной функции, продукции антимикробных пептидов и регуляции иммунных ответов слизистой оболочки как на комменсальную, так и на патогенную микрофлору (10, 11). В этом контексте NF-κB и сигнальные пути, которые регулируют его транскрипционную активность, имеют центральное значение как для врожденного эпителиального иммунитета, так и для взаимодействия между иммунной системой слизистой оболочки и слоем эпителиальных клеток (12, 13, 14, 15).Важнейшими для этого являются рецепторы распознавания образов (PRR), такие как CARD15 / NOD2 и TLR, которые экспрессируются в кишечном эпителии и иммунных клетках слизистых оболочек и активируются бактериальными продуктами (16, 17). Исследования PRR-нулевых мышей, а также животных, у которых отсутствует экспрессия субъединиц IKK в IEC, предполагают, что эпителиальный NF-κB имеет решающее значение не только для правильного ответа на люминальную микрофлору, но и для поддержания тканевого гомеостаза в кишечнике (14, 15, 16). , 17, 18, 19).

Становится все более очевидным, что барьерная функция монослоя IEC, коммуникация энтероцитов / иммунных клеток и миграция эпителиальных клеток после повреждения требуют полностью функциональной активности NF-κB (20, 21).Мыши, лишенные IKKβ или IKKγ / NEMO в IEC, восприимчивы к химически индуцированному колиту или развивают спонтанное воспаление кишечника, соответственно. Признаки того, что димеры NF-κB, содержащие субъединицу p50, могут быть важны для пролиферативного ответа IEC, необходимого для заживления повреждения слизистой оболочки, можно увидеть в исследованиях мышей с нулевым p50, которые имеют умеренно повышенные уровни пролиферации IEC (22). Важно отметить, что мыши, лишенные субъединицы p50 NF-κB и одного аллеля RelA (p50 — / — / RelA +/- ), восприимчивы к воспалению кишечника, вызванному патогенами, и неспособны вылечить кишечную инфекцию (23, 24).Подчеркивая необходимость жесткого контроля над темпоральной и специфичной для клеточного типа активностью NF-κB, мыши-гнотобиоты, которые были связаны с комменсальной микрофлорой, показали, что эпителиальный NF-κB был высокоактивирован в первые моменты времени после колонизации и уменьшался после этого (25). Примечательно, что это, вероятно, очень похоже на эффекты на активность NF-κB, наблюдаемые в недавно колонизированном неонатальном кишечнике мышей, выращенных обычным способом (26). Эти исследования в совокупности предполагают, что активность NF-κB (RelA / p50) в эпителии кишечника может иметь решающее значение для реакции слизистой оболочки на начальную бактериальную колонизацию кишечника, а также на повреждение и инфекцию.К сожалению, обычное нацеливание гена RelA вызывает эмбриональную летальность, которая должна быть устранена удалением передачи сигналов TNF-α, и это препятствует работе над специфической функцией in vivo RelA-опосредованной активности NF-κB в эпителии кишечника (27, 28).

Для дальнейшего определения роли эпителиального RelA в здоровом кишечнике, а также во время острого воспаления толстой кишки, мы создали мышей, у которых RelA можно удалить из определенных типов клеток in vivo с помощью рекомбинации на основе Cre / loxP .Мыши, лишенные RelA в IEC дистального отдела тонкой кишки и толстой кишки (далее называемые IEC-RelA — / — ), демонстрируют неонатальную смерть от спонтанной кишечной недостаточности перед отъемом, хотя и с низкой пенетрантностью. Выжившие взрослые животные изменили пролиферацию IEC и апоптоз и восприимчивы к колиту, вызванному декстрансульфатом натрия (DSS). Мы предполагаем, что субъединица RelA NF-κB необходима для базального гомеостаза монослоя кишечных эпителиальных клеток в нормальных физиологических условиях, а также для защиты и восстановления слизистой оболочки при воспалении кишечника.

Материалы и методы

Поколение мышей RelA

F / F и IEC-RelA — / —

Геномные последовательности из гена RelA мыши (MGI: 103290), фланкированные сайтами рестрикции на основе праймеров, амплифицировали с помощью ПЦР из ДНК 129Sv / Ev с использованием высокоточной полимеразы (LA Taq ; TaKaRa). Первоначально фрагмент, охватывающий от -1185 до +2091 (сайт начала транскрипции, обозначенный +1), клонировали в вектор, содержащий один сайт loxP , смежный с frt -фланкированными кассетами устойчивости к неомицину и экспрессии тимидинкиназы.Затем был амплифицирован дополнительный сегмент гена RelA со вторым сайтом loxP , и этот фрагмент был клонирован в конструкцию таким образом, чтобы после Cre-опосредованной рекомбинации удалялись п.н. +2092– +4889. Эта область содержит экзоны 5-8 из RelA и кодирует большую часть домена гомологии Rel. Конструкция была завершена добавлением гомологичных последовательностей от +4889 до +7497 п.н. Затем эта нацеленная конструкция была полностью секвенирована для обеспечения интактных кодирующих последовательностей RelA , а также правильной ориентации и размещения сайтов loxP .Электропорация этой конструкции в ES-клетки, полученные из 129, размножение гомологически нацеленных клонов с использованием положительной и отрицательной селекции антибиотиков и опосредованное FLPe удаление кассеты неомицина выполняли в Animal Models Core в Университете Северной Каролины. После идентификации с помощью ПЦР и саузерн-блоттинга клонов ES-клеток с правильно нацеленными RelA , бластоцисты C57BL / 6J инъецировали отобранные клоны, и мышей, гетерозиготных по loxP -фланкированному аллелю RelA (RelA F / F ) были выведены от химерных основателей.Удаление RelA из эпителия кишечника было достигнуто путем скрещивания мышей RelA F / F с трансгенными животными villin -Cre (29). Все мыши, использованные в этих исследованиях, были повторно генотипированы в отношении RelA и Cre после вскрытия трупа. Все исследования были выполнены на мышах из однопометного помета RelA F / F и RelA + / F , обозначенных как контрольные мыши дикого типа, и на мышах RelA F / F ; villin -Cre животные, обозначенные как IEC-RelA — / — . Животных содержали в определенных условиях, свободных от патогенов, и давали пищу в автоклаве и фильтровали воздух и воду.В ходе этих исследований стандартная практика оценки сторожевых животных, содержащихся в совместном содержании, не подтвердила, что в этой колонии не было неожиданных инфекционных агентов. Эта работа была выполнена в соответствии с требованиями комитетов по уходу за животными и их использованию Университета Северной Каролины и Медицинского центра детской больницы Цинциннати.

Выделение первичных эпителиальных клеток кишечника

Терминал подвздошной кишки (~ 5 см проксимальнее слепой кишки) и толстая кишка были удалены у контрольных мышей и мышей IEC-RelA — / — , промыты ледяным PBS и разрезаны в продольном направлении.IEC были выделены с использованием низкотемпературного протокола, модифицированного Weiser и Flint et al. (30, 31). Вкратце, ткань помещали в хелатирующий раствор (5,0 мМ Na 2 HPO 4 , 96 мМ NaCl, 8 мМ KH 2 PO 4 , 1,5 мМ KCl, 0,5 мМ DTT, 55 мМ D-сорбит, 44 мМ сахароза, 6,0 мМ EDTA, 5,0 мМ EGTA, pH 7,3) в течение 30 мин при 4 ° C, а затем эпителиальные клетки диссоциировали повторным энергичным встряхиванием. Тканевые остатки удаляли, и IEC собирали центрифугированием при 150 × g в течение 10 минут при 4 ° C.Клетки промывали холодным PBS и обрабатывали на белок или РНК. Жизнеспособность первичных эпителиальных клеток была подтверждена с помощью окрашивания трипановым синим и обычно составляла> 90%.

ОТ-ПЦР в реальном времени, иммуноблоттинг и анализ связывания с белками аффинности ДНК (DAPA)

RT-PCR в реальном времени, иммуноблоттинг и DAPA были выполнены, как описано ранее, за исключением следующих изменений (32). Для анализа экспрессии генов использовали детекцию на основе SYBR Green I (QuantiTect SYBR Green Master Mix, Qiagen) и аппарат для ПЦР Stratagene Mx3000P.Последовательности праймеров: регенерирующий белок островкового происхождения (REG) III вперед, 5′-TTCCTGTCCTCCATGATCAAAA-3 ‘, RegIIIγ в обратном направлении, 5′-CATCCACCTCTGTTGGGTTCA-3′, RegIV вперед, 5’-ATCAGAGAAACCTGCCTGTGTGIVGA-3 ‘, 5′-ATCAGAGAAACCTGCCTGTGTGIVGA-3’ -AAGTGGGAAGAGTTTGTGCAAGGC-3 ‘, дефенсин-родственный криптдин (Defcr) 4 вперед, 5′-GCTGTGTCTATCTCCTTTGGAGGC-3′, Defcr4 обратный, 5’-CGTATTCCACAAGTATCCCACGAAC-3GCCR вперед-3 ‘, DefcACR-3GCCA, DefcACr5 ‘-TGAAGAGCAGACCCTTCTTGGC-3′, IL-6 вперед, 5’-CAAAGCCAGAGTCCTTCAGAGAGATAC-3 ‘, IL-6 обратный, 5′-ATTGGATGGTCTTGGTCCTTAGC-3′, IL-11 вперед, 5’-GCATGTACAATCGGCT ‘, 5′-GCATGTACAATCGGCT’ , 5′-CAAGAGCTGTAAACGGCGG-3 ‘, IL-18 прямой, 5′-CAGGCCTGACATCTTCTGCAA-3′, IL-18 обратный, 5’-TCTGACATGGCAGCCATTGT-3 ‘, CXCL1 вперед, 5′-CCCAAACCGAAGTCATAGCC, 5’-CCCAAACCGAAGTCATAGCC ‘-TTGTCAGAAGCCAGCGTTCACCAG-3′, CXCL5 вперед, 5’-AGCTGCGTTGTGTTTTGCTTAACCG-3 ‘, CXCL5 обратный, 5′-TTGAACACTGGCCGTTCTTTCCAC-3′, CXTATCL10 вперед, 5′-GCCTCCAT, 5′-GCCTCCAT 3 ′, TNF-α вперед, 5′-AGGCAGGTTCTGTCCCTTTCAC-3 ′, TNF-α обратный, 5′-AGATAGCAAATCGGCTGACGG-3 ′, RANTES обратный, 5′-AGCAAGCAATGACAGGGAAGC-3 ′, RANTES вперед, 5′-CAAGGTCAG , APRIL вперед, 5′-GTGATGTGGCAACCAGCTCTT-3 ′, APRIL обратный, 5′-CCCTTGGTGTAAATGGAAGAC-3 ′, тимусный стромальный лимфопоэтин (TSLP) вперед, 5′-AGGAGCCTCTTCTACTACTACTGCAAGTAGTGCC, 5 ′ NOD2 вперед, 5’-TGAAGTTGTAGCCGACCACCAGAA-3 ‘, NOD2 назад, 5′-TCCCTGGAGCTCAGTGTTTGGATT-3′, TLR2 вперед, 5’-AAGAGGAAGCCCAAGAAAGC-3 ‘, TLR2 назад, 5′-CGATG, 5’-CGATG ACCTGGCTGGTTTACACGTC-3 ‘, обратный TLR4, 5′-CTGCCAGAGACATTGCAGAA-3′, прямой TLR5, 5’-TCAGAGCACCTACGCTTGGAACAT-3 ‘, обратный TLR5, 5′-AGTGGAAATGATGATGTG ACTGCAAC9, TLRGATGATGTG ACTGCAAC9, TLG-3 TLGTGTG ACTGCAAC9, TLG-3TAGC9 обратный, 5’-AGATTAGTCAGCGGCAGGAA-3 ‘, Bcl-x L вперед, 5′-TAAACTGGGGTCGCATCGTG-3′, Bcl-x L обратный, 5′-GTGGTTCTCCTGGTAGCAAT’GGIP-3 ‘, c- TGAGTCGTTAGGTAGCCAGTTGG-3 ′, c -FLIP обратный, 5’-TGTTCCACGCATACACTTTGTCC-3 ‘, BIRC3 вперед, 5′-TGGCCTGATGCTAGACAACTGGAA-3′, BIRC3 обратный, 5’-TAGGGACTTGTGCTCAAAGCAGGA-3 ‘.Иммуноблоттинг выполнялся с использованием следующих Abs: RelA SC-372, p50 SC-114, c-Rel SC-70, IκBα SC-371, IκBβ SC-945, COX-2 SD-1747 (Santa Cruz Biotechnology) и расщепленной каспазой. 3 шт. 9661 (Технология передачи сигналов сотовой связи). В некоторых исследованиях белковые экстракты выделяли через 90 минут после внутрибрюшинной инъекции мышам. с ЛПС (2,5 мкг / г Escherichia coli O55: B5, Sigma-Aldrich). Для DAPA 50 мкг ядерного экстракта из подвздошной или толстой кишки инкубировали с 1,0 мкМ биотинилированным дуплексом ДНК, содержащим консенсусный сайт κB (5′-ACTGGCTTGGAAATTCCCCGCGCCTGACC-3 ‘) промотора IκBα мыши.Анализы связывания ДНК на клетках с нокдауном RelA siRNA проводили с 20 мкг ядерных экстрактов. Инкубацию проводили в буфере для связывания ДНК EMSA (50 мМ NaCl, 10 мМ Трис (pH 7,6), 10% глицерин, 1 мМ DTT, 0,5 мМ ЭДТА), содержащем ингибиторы протеиназы и фосфатазы (Sigma-Aldrich), а также 0,1 мкг / мл. поли (dI-dC) при 4 ° C в течение ночи. Предварительная инкубация экстрактов с избытком небиотинилированных дуплексов κB подтвердила специфичность. Дуплекс-белковые комплексы очищали с использованием 100-мкл стрептавидиновых магнезиальных парамагнитных шариков (Promega) и магнитной колонки и трижды промывали ДНК-связывающим буфером.Выделенные белки фракционировали на 4–12% гелях NuPAGE (Invitrogen) и подвергали иммуноблоттингу на p50, c-Rel или RelA.

Колит DSS

Воспаление кишечника было вызвано предоставлением трансгенным или контрольным мышам из однопометников 3% воды DSS (вес 36 000–50 000; MP Biomedicals) либо в течение 7 дней для исследований острых состояний, либо в течение 5 дней с последующими 5 днями воды для исследований фазы заживления. Самок мышей использовали для краткосрочных экспериментов, а самцов — для исследований разрешения.Как сообщалось, самцы мышей, независимо от генотипа, были значительно более восприимчивы к DSS-колиту (33). Вес животных и количество баллов стула (0 — нормальный; 1 — мягкий; 2 — диарея / минимальное аноректальное кровотечение; 3 — диарея / сильное аноректальное кровотечение) регистрировали ежедневно. Хотя повреждение DSS происходит по всей толстой и слепой кишке на разных уровнях, дистальный отдел толстой кишки является основным местом повреждения (33). Поэтому мышей умерщвляли, слепую кишку и толстую кишку удаляли и промывали ледяным PBS, а дистальную часть толстой кишки разрезали на три равных сегмента и фиксировали в 10% формалине.Слепая кишка была заморожена для последующего анализа. Для каждого образца дистального отдела ободочной кишки продольные срезы ткани, в которых три дистальных среза ободочной кишки имели четко видимый просвет кишечника, использовали в гистологической оценке, при этом наблюдатель не знал генотипа. Параметры оценки были изменены из Cooper et al. и Hogan et al. и включал количественное определение пораженной области дистального отдела толстой кишки, отека, эрозии / изъязвления эпителиального монослоя, потери / повреждения крипт и инфильтрации иммунных клеток в слизистую оболочку (34, 35).Степень тяжести оценивалась по шкале, которая для пораженной области (эрозия / изъязвление и потеря крипты) определялась как 0 (нормальная), 1 (0–10%), 2 (10–25%), 3 (25–50%). %) и 4 (> 50%). Отек и инфильтрацию иммунных клеток оценивали как: 0 — отсутствует; 1 — слабый; 2 — умеренный; и 3 — тяжелая. Общий балл заболевания выражали как среднее значение всех комбинированных баллов по генотипу.

Иммуногистохимия

Иммуногистохимия была выполнена, как описано ранее, со следующими изменениями (36).Количественное определение окрашивания расщепленной каспазой-3 в эпителиальных клетках дистального отдела толстой кишки проводили слепым методом путем подсчета положительных клеток в нескольких случайных полях микроскопа (100 ×) на срез ткани (цифровой микроскоп Fisher Micromaster и программное обеспечение для визуализации Micron; Fisher Scientific). Окрашивание BrdU проводили в соответствии с рекомендациями производителя (набор для окрашивания BrdU; Invitrogen). Мышам вводили 50 мкг BrdU / г массы тела за 1,5 ч до умерщвления и обрабатывали для иммуногистохимии, как указано выше.Правильно ориентированные крипты, определяемые как крипты с колонкой прозрачных клеток, выстилающей обе стороны открытой просветной области, были сфотографированы, и количество BrdU-положительных клеток на крипту, а также клеток на одной стороне крипты, было подсчитано наблюдателем, который был не знает генотипа образца. Микрофотографии гистологически окрашенных срезов получали на микроскопе Axioplan 2 (Carl Zeiss MicroImaging).

РНК-интерференция

Нокдаун мышиного RelA проводили в клетках m-IC cl2 , нетрансформированной линии кишечных клеток мыши (37).Клетки m-IC cl2 выращивали в среде DMEM / Ham’s F12, 60 нМ селената натрия, 5 мкг / мл трансферрина, 2 мМ глутамина, 50 нМ дексаметазона, 1 нМ трийодтиронина, 5 мкг / мл инсулина, 20 мМ D-глюкозы, 10 нМ эпидермального фактора роста, 2% FCS и 20 мМ HEPES (pH 7,4). Липофектамин 2000 (Invitrogen) использовали для трансфекции RelA-специфичного si GENOME ON-TARGET SMART пула (L-040776-0, Dharmacon) в клетки m-IC cl2 в концентрации 100 нМ. Контрольные клетки получали неспецифическую миРНК.Пилотные исследования показали, что при трансфекции клеток в суспензии во время пассирования эффективный нокдаун RelA может быть получен через 72 часа. Обработка TNF-α (20 нг / мл, Peprotech) и экстракты ядер выделяли, как описано ранее (32). В некоторых исследованиях репортер люциферазы NF-κB, мутантный репортер. и плазмиды из IκBα-серина 32/36 в мутантный аланин (IκBα-SR) котрансфицировали siRNA.

Органная культура и PGE

2 ELISA

Культуры органов толстой кишки получали путем сбора дистальных отделов толстой кишки у контрольных мышей и мышей IEC-RelA — / — , которым давали воду или DSS в течение 7 дней.Ткань промывали холодным PBS и удаляли брыжейку. Односантиметровые срезы толстой кишки взвешивали и помещали в 24-луночные планшеты, содержащие DMEM, 0,5% FBS, пенициллин (100 Ед / мл), стрептомицин (100 мкг / мл), фунгизон (0,25 мкг / мл) (Invitrogen) и Примоцин (50 мкг / мл) (InvivoGen). После сбора всей исследуемой ткани среду заменяли и эксплантаты инкубировали в течение ночи при 37 ° C. Супернатанты собирали, очищали центрифугированием и измеряли уровни PGE 2 с помощью ELISA (Cayman Chemical).

Статистика

Все значения представлены как среднее ± стандартная ошибка. Все сравнения проводились между контрольными мышами и мышами IEC-RelA — / — с использованием непарного теста Student t . Различия считались статистически значимыми при p <0,05.

Результаты

Новорожденные мыши, у которых отсутствует экспрессия IEC RelA, имеют нормальную дифференцировку эпителиальных клеток, но подвержены спонтанной кишечной недостаточности

Определение физиологической роли RelA в полностью развитой ткани было трудным из-за TNF-α-зависимого апоптоза гепатоцитов и эмбриональной летальности, которая происходит у мышей, лишенных этой субъединицы NF-κB (27, 28).Поэтому, чтобы исследовать роль RelA тканеспецифическим образом, мы нацелены на мышиный локус RelA с помощью условного аллеля на основе loxP , который позволит удалить основную часть геномной кодирующей последовательности RelA при экспрессии Cre рекомбиназа. Был разработан вектор нацеливания, в котором экзоны 5-8 фланкированы последовательностями loxP (рис. 1⇓ A ). Эта часть гена RelA была выбрана для удаления, поскольку эти экзоны кодируют большую часть домена гомологии Rel, который важен для активности связывания ДНК, а также для димеризации RelA с другими факторами транскрипции.Кроме того, после опосредованного Cre-рекомбиназой удаления экзонов 5-8 возможный сплайсинг из теперь соседних экзонов 4 и 9 приводит к транскрипту вне рамки считывания с множественными и немедленными стоп-кодонами, тем самым снижая вероятность образования усеченного белка RelA. с потенциально гипоморфными или доминирующими отрицательными свойствами. Гомозиготные мыши с этим условным, loxP-фланкированным или «флоксовым» геном RelA (RelA F / F ) рождаются в ожидаемых менделевских соотношениях и неотличимы от мышей дикого типа.

РИСУНОК 1.

Делеция RelA, специфичная для эпителиальных клеток кишечника, и гистологический анализ контрольных мышей и мышей из однопометного помета IEC-RelA — / — в возрасте 10–12 дней. A , Стратегия нацеливания для Cre / loxP-опосредованного удаления экзонов RelA показана с сайтами праймеров ПЦР, которые использовали для подтверждения кишечно-специфической рекомбинации у мышей IEC-RelA — / — . B , Рекомбинация аллеля RelA в подвздошной кишке мышей IEC-RelA — / — , но не в печени (Liv), селезенке (Spl) или почках (Kid). C , Полноразмерный блот показывает полную потерю белка RelA в экстрактах из первичного эпителия кишечно-специфичных RelA-нулевых мышей и указывает на то, что укороченные формы RelA не продуцируются. D , Иммуногистохимия с RelA-специфическими Abs идентифицирует RelA в ядрах эпителия глубоких крипт (стрелки, левая панель ). RelA теряется из эпителиальных клеток ( средняя панель, ; звездочки в просвете крипт), но это очевидно в окружающих клетках собственной пластинки и стромы (стрелки).Отрицательный контроль проводили без первичных Ab (, правая панель, ). Активность щелочной фосфатазы ( E ), иммуногистохимический анализ лизоцима ( F ) и хромагранина A ( G ) и окрашивание альциановым синим ( H и I ) и гематоксилином и эозином ( K ) предполагают отсутствие явных изменений в дифференциации IEC с потерей RelA ( левая панель, — управление, а правая панель, — IEC-RelA — / — для E K ). L и M , подгруппа мышей IEC-RelA — / — с явным кишечным расстройством. Окрашивание гематоксилином и эозином показывает потерю морфологии крипта-ворсинка подвздошной кишки (сравните M с K ).

С целью изучения роли RelA в физиологическом поддержании слоя эпителиальных клеток кишечника, а также его реакции на воспаление, мышей RelA F / F скрещивали с трансгенными животными, которые экспрессируют рекомбиназу Cre под контролем ворсин . регуляторных последовательностей гена.Трансген villin -Cre нацелен на все клоны эпителиальных клеток дистального отдела тонкой кишки, слепой и толстой кишки, а экспрессия происходит в стволовых клетках крипт кишечника, начиная с рождения (29). Мыши IEC-RelA — / — были созданы и выжили при развитии в ожидаемых генетических соотношениях. ПЦР-анализ показал, как и ожидалось, что перестройка аллеля RelA не происходила в печени, селезенке, почках, легких и коже, но присутствовала в кишечнике (рис. 1⇑ B и данные не показаны).

Хотя некоторые мыши IEC-RelA — / — имеют желудочно-кишечные заболевания до отъема (см. Результаты ниже), большинство мышей, лишенных RelA в эпителии подвздошной и толстой кишки, доживают до взрослого возраста. Мы подтвердили полную потерю белка RelA в монослое IEC с помощью вестерн-блоттинга экстрактов целых клеток из изолированных эпителиальных клеток толстой кишки взрослых мышей (рис. 1⇑ C ). Случайные следовые количества RelA, которые остаются, вероятно, связаны с ранее охарактеризованными низкими уровнями мозаичной экспрессии фермента Cre, управляемого промотором villin , или с неизбежными небольшими количествами загрязняющих неэпителиальных клеток, присущими изоляции IEC.Ни в одном случае мы не отметили появление видов с меньшей молекулярной массой при использовании нескольких RelA Abs в IEC от мышей IEC-RelA — / — , предполагая, что Cre-опосредованная рекомбинация условного аллеля приводит к полной потере продукции белка RelA ( Рис. 1⇑ C и неопубликованные данные). Как сообщают другие авторы (22), иммуногистохимический анализ кишечника показал, что белок RelA экспрессируется диффузным образом в эпителии толстой кишки и локализуется в ядре клеток в основании и нижней трети крипты (рис.1⇑ D ). Окрашивание на RelA у мышей IEC-RelA — / — показало, что, как и ожидалось, Cre-опосредованная делеция специфична для слоя эпителиальных клеток.

Из-за хорошо описанной роли NF-κB в дифференцировке различных типов клеток (38) мы первоначально оценили спецификацию типа клеток IEC в контроле и IEC-RelA — / — подвздошной и толстой кишки практически здоровых 10–12 суточные мыши. Активность щелочной фосфатазы присутствовала в дифференцированном эпителии ворсинок как в контрольном однопометнике, так и в подвздошной кишке IEC-RelA — / — (рис.1⇑ E ). Иммуногистохимический анализ лизоцима показал окрашивание крипт тонкой кишки и отсутствие дефектов в количестве клеток Панета у мышей дикого типа и мышей IEC-RelA — / — (рис. 1– F ). Кроме того, окрашивание хромогранином А и альциановым синим также показало отсутствие существенных основанных на генотипе различий в количестве энтероэндокринных клеток в подвздошной кишке (рис. 1– G ) или бокаловидных клеток в тонкой или толстой кишке (рис. H и I ).Окрашивание гематоксилином и эозином подвздошной и толстой кишки также не показало серьезных аномалий морфологии кишечника у новорожденных мышей (рис. 1, J и K ). Несмотря на кажущееся нормальным развитие слоя эпителиальных клеток у детенышей IEC-RelA — / — , мы наблюдали, что у ~ 10–15% мышей IEC-RelA — / — наблюдали обесцвечивание живота и диарею, которые начинались в течение 2–20 лет. 3 дня после рождения. Это привело к плохой прибавке в весе (10–12-дневные животные дикого типа, 6,6 ± 0,15 г; IEC-RelA — / — , 6.1 ± 0,09 г; работает IEC-RelA — / — , 3,5 ± 1,1 г; n = 3–6 на генотип). Эти мыши умерли до 25 дня. При более близком рассмотрении была очевидна тяжелая патология желудочно-кишечного тракта, типичной для которой являлись тонкостенные бледные тонкая кишка и толстая кишка, которые часто были растянуты воздухом (рис. 1⇑ L ) или заполнены темным материалом, что наводит на мысль. кишечного кровотечения. Гистологический анализ подвздошной кишки серьезно пораженных животных показал почти полную потерю структуры крипто-ворсинки (рис.1⇑ M ; сравните с рис. 1 K ).

Хотя полный анализ этого фенотипа продолжается, мы первоначально исследовали уровни экспрессии NF-κB-зависимых генов в изолированных подвздошных IEC от 12–14-дневных контрольных детенышей и детенышей IEC-RelA — / — . Важно отметить, что IEC были очищены, когда не было видимой патологии, с целью определения статуса генов-мишеней NF-κB до начала заболевания, поскольку мы полагали, что это может служить указанием на основу этого спорадического неонатального фенотипа.Анализ RT-PCR в реальном времени подтвердил низкую экспрессию IκBα, архетипического RelA-зависимого гена (рис. 2⇓). Кроме того, несколько антиапоптотических генов, таких как RegIV и Bcl-x L , были уменьшены. Другие антиапоптотические гены-мишени NF-κB, такие как сурвивин и X-связанный ингибитор апоптоза (XIAP), не были затронуты (фиг. 2 и данные не показаны). Эти результаты предполагают, что отсутствие RelA в слое эпителиальных клеток может придавать чувствительность к гибели клеток, вызванной стрессом (39, 40). Гены, регулируемые присутствием люминальной микрофлоры, такие как Reg3γ, Defcr4 и Defcr5, также экспрессируются на низких уровнях в эпителии подвздошной кишки IEC-RelA — / — детенышей по сравнению с контрольными потомками (16, 41).В совокупности эти данные предполагают, что, хотя дифференцировка эпителиальных клеток происходит нормально, потеря RelA-опосредованной экспрессии генов может привести к предрасположенности к кишечной недостаточности новорожденных.

РИСУНОК 2.

Снижение уровней антимикробных и антиапоптотических RelA / NF-κB-зависимых генов у мышей IEC-RelA — / — . ОТ-ПЦР в реальном времени выполняли на мРНК из изолированного энтероцита практически здоровых 12–14-дневных контрольных детенышей и детенышей IEC-RelA — / — относительно контрольных однопометников.Surv., Сурвивин ( n = 4–7 мышей на группу; *, p <0,05).

Делеция эпителиального RelA приводит к повышению активности c-Rel и p50

Предыдущие исследования показывают, что общая клеточная транскрипционная активность NF-κB очень чувствительна к потере отдельных субъединиц и что базальная активность уравновешивается посредством скоординированных изменений уровней белка и ДНК-связывающей активности оставшихся комплексов IκB / NF-κB (4, 6) .Поскольку потенциально компенсаторная активность NF-κB имеет решающее значение для понимания эффектов потери RelA в эпителиальных клетках кишечника, мы исследовали белки IκB, а также субъединицы p50 и c-Rel NF-κB в изолированных первичных клетках, лишенных RelA. Как и ожидалось (27, 42), делеция RelA в эпителии толстой кишки не влияла на общие клеточные уровни p50 или c-Rel, но действительно приводила к резкому снижению уровней IκBα и IκBβ (рис. 3⇓ A ). Затем мы выделили ядерные экстракты из колоноцитов необработанных или инъецированных LPS контрольных мышей и мышей IEC-RelA — / — и исследовали ядерную транслокацию и активность связывания ДНК соответствующих субъединиц NF-κB.Хотя ожидаемое ядерное накопление p50, c-Rel и RelA было очевидным у контрольных мышей, получавших эндотоксин, IECs, лишенные RelA, имели повышенную транслокацию c-Rel и p50 (рис. 3⇓ B ). Примечательно, что потенциал связывания ДНК c-Rel субъединицы NF-κB в кишечном эпителии считается в нормальных условиях низким или отсутствует (22, 32). Однако, как показывают анализы снижения аффинности ДНК, потеря RelA приводит к сдвигу в составе связанных димеров NF-κB со значительным связыванием c-Rel и p50 в эпителии как подвздошной кишки (данные не показаны), так и толстой кишки (рис. .3⇓, C и D ). Это предполагает, что c-Rel / p50 может контролировать экспрессию подмножества NF-κB-зависимых генов в RelA-нулевом кишечнике. Чтобы подтвердить наличие потенциально компенсаторной активности NF-κB в IEC, лишенных RelA, мы использовали более легко контролируемую систему in vitro, в которой РНК-интерференция использовалась для значительного снижения уровней белка RelA. Нокдаун RelA в нетрансформированной линии кишечных клеток мыши m-IC cl2 приводил к согласованному снижению стабильности белков IκBα и IκBβ в нестимулированных клетках (рис.3⇓ E ). Точно так же отсутствие значительных уровней ядерного RelA после обработки TNF-α приводило к повышенной активности связывания ДНК c-Rel (рис. 3 E , нижняя панель ) и предполагало, что эта система была действующей моделью in vivo. условия. Анализы репортерной люциферазы NF-κB показали, что, хотя снижение белка RelA значительно снижает продукцию люциферазы, сохраняется как базальная, так и TNF-α-индуцированная активность NF-κB (рис. 3⇓ F ). Коэкспрессия стабилизированного мутанта IκBα (IκBα-SR) привела к полной потере активности люциферазы, опосредованной NF-κB, и подтверждает, что оставшаяся экспрессия репортерного гена была зависимой от NF-κB и, вероятно, c-Rel / p50 (рис.3⇓ F ). Определив, что потеря RelA приводит к сдвигу в составе и активности преобладающих субъединиц NF-κB в кишечном эпителии, мы затем определили влияние, которое это оказывает на выживаемость клеток и деление RelA-нулевых IECs.

РИСУНОК 3.

Повышенная активность NF-κB (c-Rel / p50) в эпителии кишечника без RelA. A , Иммуноблоттинг экстрактов из изолированных первичных колоноцитов трех контрольных и трех мышей IEC-RelA — / — показывает потерю RelA и снижение уровней IκBα и IκBβ.Уровни p50 и c-Rel в целых клетках не изменились. Мышам B , Control и IEC-RelA — / — вводили LPS (2,5 мкг / г), а ядерные экстракты IEC из толстой кишки выделяли через 90 минут и проводили иммуноблоттинг. C , анализ сродства к ДНК на ядерных экстрактах из изолированных эпителиальных клеток толстой кишки контрольных мышей, которым инъецировали LPS, и мышей IEC-RelA — / — . Конкуренция с избытком небиотинилированных дуплексов ДНК сайта NF-κB показывает специфичность ( D ). E , Иммуноблоттинг экстрактов целых клеток из клеток m-IC cl2 , трансфицированных миРНК RelA.Нокдаун RelA (RelA-KD) совпал со снижением IκBα и IκBβ (, верхняя панель, ). Анализ аффинности ДНК в контрольных клетках и клетках RelA-KD показал связывание RelA и c-Rel после стимуляции TNF-α (20 нг / мл) в течение 60 мин ( нижняя панель, ). F , анализ репортера люциферазы NF-κB в контрольных и RelA-дефицитных клетках. Люциферазный репортерный анализ с использованием плазмид, содержащих промотор NF-κB-чувствительного (Luc) или мутантного NF-κB (Mut), а также стабилизированный мутантный IκBα (IκB-SR).

RelA необходим для пролиферативного и апоптотического гомеостаза полностью зрелого монослоя кишечных эпителиальных клеток

Специфические дефекты экспрессии генов, выявленные в кишечнике новорожденных, наряду с предыдущими исследованиями на мышах p50 и IEC-IKKγ / NEMO-null (14, 22), подтверждают возможность того, что дерегуляция базальной пролиферации и апоптоза может присутствовать у выживших взрослых IEC. -RelA — / — мыши.Таким образом, мы определили скорость оборота IEC у взрослых контрольных и IEC-RelA — / — кишечника. Пролиферацию измеряли путем определения среднего количества BrdU-меченых клеток на хорошо ориентированную крипту в дистальном отделе толстой кишки мышей IEC-RelA — / — и мышей из однопометного помета дикого типа. Потеря RelA в толстой кишке приводит к усилению пролиферации, при этом мыши IEC-RelA — / — имеют почти в два раза больше митотических клеток по сравнению с контрольными животными (фиг. 4⇓ A ). Несмотря на это значительное увеличение количества делящихся клеток в RelA-нулевых криптах, было обнаружено только умеренное увеличение количества IEC на крипту (рис.4⇓ B ). Это привело нас к исследованию, сопровождалась ли повышенная пролиферация в этом клеточном слое повышенным апоптозом. Иммуногистохимическое окрашивание расщепленной каспазы-3 проводили на срезах тканей мышей IEC-RelA — / — и контрольных мышей и количественно определяли путем подсчета положительных эпителиальных клеток в случайных полях микроскопа с большим увеличением. RelA-нулевой эпителиальный монослой имел повышенное количество апоптотических клеток, которые были преимущественно эпителием крипт, что указывает на защитную роль RelA в кишечных стволовых или прогениторных клетках, которую нельзя компенсировать повышенной активностью c-Rel (рис.4⇓ C ). Большие кластеры апоптотических эпителиальных клеток были обнаружены у мышей IEC-RelA — / — , и большинство крипт имело многочисленные клетки с активированной каспазой-3 (рис. 4⇓ D ).

РИСУНОК 4.

Измененный пролиферативный и апоптотический гомеостаз в кишечнике IEC-RelA — / — . A , Пролиферация эпителиальных клеток кишечника у зрелых мышей IEC-RelA — / — повышена по сравнению с контролем, как определено путем подсчета BrdU-положительных клеток на правильно ориентированную крипту дистальной кишки ( n = 5 мышей и ≥143 крипты подсчитываются на группу). B , Количество клеток на одной стороне дистальных крипт толстой кишки от основания до поверхности было увеличено у мышей IEC-RelA — / — по сравнению с контрольными мышами ( n = 5 мышей и ≥120 крипт на группу). C , Апоптоз эпителия измеряли в дистальном отделе толстой кишки путем подсчета расщепленных каспазо-3-положительных клеток на 100-кратное поле высокого увеличения (HPF), и было обнаружено, что он увеличивается у мышей IEC-RelA — / — ( n = 5 мышей на группу с девятью полями на каждую мышь). D , Иммуногистохимия расщепленной каспазы-3 показывает низкие уровни гибели клеток у мышей дикого типа ( левая панель ), но легко увидеть области многочисленных апоптотических IEC, которые обычно обнаруживаются в эпителии крипт IEC-RelA — / — мыши дистальный отдел ободочной кишки ( средняя и правая панели ).Анализ экспрессии генов в изолированных колоноцитах ( E ) или всей слепой кишке ( F ) выявляет избирательную потерю генов-мишеней NF-κB ( n = 6–8 на группу) (*, p <0,05).

Затем мы исследовали экспрессию регулируемого NF-κB гена у мышей IEC-RelA — / — с использованием ОТ-ПЦР в реальном времени для определения возможных причин измененной пролиферации эпителия и апоптоза. Антиапоптотическая экспрессия Bcl-x L была значительно снижена в изолированных RelA-нулевых колоноцитах (рис.4⇑ E ). Другие гены-мишени NF-κB, такие как XIAP, клеточный ингибитор апоптоза 2, Casp8 и FADD-подобный регулятор апоптоза (CFLAR, также называемый cFLIP) и сурвивин, не были затронуты. Мы также обнаружили заметное снижение экспрессии IL-11 и IL-18 в изолированных колоноцитах мышей IEC-RelA — / — . Эти интерлейкины, которые паракринно нацелены на IEC, являются антиапоптотическими и необходимы как для восстановления эпителия, так и для устойчивости к острому воспалению кишечника (43, 44, 45).Поскольку активация NF-κB рецепторами распознавания образов критически важна для взаимодействий эпителиальных клеток с микрофлорой просвета, мы измерили экспрессию нескольких белков TLR, которые, как известно, экспрессируются в колоноцитах, но не обнаружили различий между генотипами (рис. 4– E ).

IEC-RelA — / — мыши, достигшие зрелости, не обнаруживают явных признаков кишечного заболевания, и все же повышенный апоптоз эпителиальных клеток может приводить к низкому уровню воспаления. Соответственно, мы обратились к этой возможности, измерив экспрессию цитокинов во всей слепой кишке контрольных однопометных мышей 12-недельного возраста и мышей IEC-RelA — / — .Не было обнаружено никаких указаний на изменение уровней провоспалительных генов, таких как MCP-1 / CCL2, IL-6 или RANTES / CCL5 (рис. 4– F ). Кроме того, мы не обнаружили изменений в экспрессии суперсемейства TSLP или TNF (лиганд), члена 13 (также называемого лигандом, индуцирующим пролиферацию, или APRIL) (данные не показаны). Эти цитокины необходимы для IEC-направленного созревания дендритных клеток и рекомбинации с переключением класса на IgA в B-клетках слизистой оболочки, соответственно (15, 46). Следует отметить, что значительное повышение экспрессии NOD2 было обнаружено в слепой кишке мышей IEC-RelA — / — , а уровни TLR4 и TLR9 имели тенденцию к повышению ( p = 0.07). Дополнительная работа будет необходима для определения возможности присутствия аберрантных иммунных клеток в слизистой оболочке мышей IEC-RelA — / — .

Активность RelA защищает эпителий кишечника во время воспаления

Мы предположили, что нарушение регуляции деления клеток и усиление апоптоза в кишечнике мышей IEC-RelA — / — может привести к повышенной восприимчивости к повреждению монослоя, воздействию на подслизистую оболочку содержимого просвета и тяжелому воспалению.Чтобы исследовать эту возможность, мы использовали установленную модель химически индуцированного колита (введение DSS в питьевую воду), которая позволила бы нам точно регулировать начало заболевания. Первоначально контрольным мышам и мышам IEC-RelA — / — давали 3% DSS в течение 2 дней, а затем анализировали для определения чувствительности монослоя IEC на начальных стадиях повреждения. Мы не наблюдали гибели клеток у мышей IEC-RelA — / — , обработанных DSS, которая была значительно больше, чем у необработанных мышей IEC-RelA — / — (данные не показаны).Два дня на DSS вызвали повышенную активность связывания ДНК c-Rel в изолированных RelA-нулевых IEC по сравнению с контролем (данные не показаны).

Затем мы определили ответ мышей IEC-RelA — / — на более длительное лечение DSS, которое приводит к значительному увеличению продукции цитокинов слизистой оболочки и острому колиту. В этих исследованиях мы предоставили контрольным мышам и мышам IEC-RelA — / — 3% питьевую воду DSS в течение 7 дней. У всех мышей был ожидаемый мягкий стул и диарея, но к 5-6 дням у мышей IEC-RelA — / — было отмечено сильное ректальное кровотечение (рис.5⇓ А ). Мыши IEC-RelA — / — потеряли значительное количество веса по сравнению с контрольными животными к 7 дню исследования (фиг. 5 B ). Затем мы измерили степень повреждения кишечника и воспаления у мышей IEC-RelA — / — с помощью гистологического исследования дистального отдела толстой кишки. Объединение нескольких индивидуальных параметров оценки показало, что тяжесть заболевания была повышена в кишечнике мышей, лишенных эпителиального RelA (фиг. 5⇓ C ). Мыши IEC-RelA — / — показали повышенное повреждение слизистой оболочки и инфильтрацию иммунных клеток, а также существенное специфическое повреждение слоя эпителиальных клеток, что измерялось по изъязвлению монослоя и потере крипт (рис.5⇓ D ). Мы также оценили воспаление у мышей IEC-RelA — / — -null путем определения уровней экспрессии провоспалительных цитокинов и хемокинов в слепой кишке. Хотя мыши, лишенные RelA в кишечном эпителии, имели более высокие уровни IL-6 и MCP-1 после 7 дней приема DSS по сравнению с контрольными мышами из однопометного помета, некоторые цитокины, такие как CXCL1 и TNF-α, оказались сходными (рис. 5–). E ). PGE 2 играет важную роль в реакции слизистой оболочки на повреждение, а мыши, лишенные ЦОГ-2, очень восприимчивы к колиту DSS (47, 48, 49).Поэтому затем мы оценили уровни белка COX-2 в дистальном отделе толстой кишки контрольных мышей и мышей IEC-RelA — / — , получавших DSS в течение 7 дней. В то время как COX-2 был умеренно повышен у контрольных мышей, мы также обнаружили повышенные уровни у RelA-нулевых животных (рис. 5– F ). Затем мы измерили продукцию простагландинов в среде для культивирования клеток эксплантатов толстой кишки от воды и мышей, обработанных DSS. Продукция PGE 2 была повышена в ткани IEC-RelA — / — по сравнению с образцами от контрольных мышей с колитами (рис.5⇓ G ). Как видно на примере мышей, лишенных энтероцитов IKKβ, эти данные предполагают, что эпителий не является преобладающим участком опосредованной NF-κB экспрессии COX-2 и продукции PGE 2 (40). Повышенные уровни PGE 2 , продуцируемые колитической тканью мышей IEC-RelA — / — , могут иметь важные последствия в отношении уровней апоптоза и пролиферации энтероцитов (49, 50).

РИСУНОК 5.

Мыши, лишенные кишечного RelA, очень восприимчивы к повреждению слизистой оболочки. Мышам IEC-RelA — / — и контрольным однопометным мышам давали 3% DSS в течение 7 дней, а затем анализировали. A и B , колит DSS привел к более тяжелой оценке стула и потере веса у мышей без IEC RelA ( n ≥ 10 мышей на генотип). C . Заболевание было количественно выше у мышей IEC-RelA — / — при гистологической оценке. D , Изъязвление эпителиального монослоя, потеря крипт и степень инфильтрации иммунных клеток были выше у мышей IEC-RelA — / — ( n ≥ 10 мышей на генотип). E , Экспрессия провоспалительного гена была повышена в слепой кишке мышей IEC-RelA — / — по сравнению с контролем ( n ≥ 3 мыши на генотип). F , уровни белка COX-2 анализировали с помощью иммуноблоттинга в дистальном отделе толстой кишки мышей дикого типа и мышей IEC-RelA — / — на воде или DSS. G , Дистальные сегменты толстой кишки мышей, обработанных водой или DSS, культивировали в течение 24 часов, и уровни PGE 2 в среде для культивирования тканей измеряли с помощью ELISA ( n = 4 мыши с водой и 6 DSS на генотип; два сегментов, измеренных на мышь).

Производство цитокинов в результате лечения DSS может дополнительно усугубить воспаление за счет разрушения слоя эпителиальных клеток у мышей IEC-RelA — / — .Поэтому мы определили уровни апоптоза в оставшихся эпителиальных клетках IEC-RelA — / — и контрольных животных. Хотя количество расщепленных каспазо-3-позитивных клеток более чем в три раза выше в RelA-нулевом эпителии (рис. 6⇓ A ), это, вероятно, недооценка из-за значительной потери кишечного эпителия у этих мышей. Мы обычно отмечали меньшее количество эпителиев на поле у ​​мышей IEC-RelA — / — по сравнению с контролем, но все же наблюдали повышенное количество апоптозных колоноцитов.Непрерывные области расщепленных каспазо-3-положительных эпителиальных клеток обычно обнаруживались у мышей IEC-RelA — / — , и это соответствовало тяжелым изъязвлениям и потере крипт, обычно наблюдаемым у этих животных (рис. 6⇓ B ). . Основываясь на повышенных уровнях апоптоза, наблюдаемых в RelA-нулевых IEC, мы затем исследовали пролиферативный ответ контрольных и RelA-нулевых слоев эпителиальных клеток на DSS-индуцированное воспаление. Мы обнаружили, что значительно больше клеток, меченных BrdU, было обнаружено у мышей IEC-RelA — / — (рис.6⇓ C ). Количественное определение митотических клеток в хорошо ориентированных криптах показало, что мыши IEC-RelA — / — имеют примерно в три раза больше делящихся клеток на крипту по сравнению с контрольными животными на DSS (фиг. 6⇓ D ). Эти данные в совокупности подразумевают важную роль RelA-опосредованной активности NF-κB в антиапоптотической защите монослоя кишечных эпителиальных клеток и в скоординированных пролиферативных ответах на повреждение.

РИСУНОК 6. Активность

RelA регулирует апоптоз и пролиферацию эпителиальных клеток кишечника во время острого воспаления. A , апоптоз энтероцитов был измерен (расщепленные каспазой-3-положительные клетки на поле высокого увеличения (HPF)) и был сильно повышен у DSS-обработанных мышей IEC-RelA — / — ( n = 6 мышей на генотип и девять полей на мышь). B , Апоптоз присутствует в воспаленной ткани мышей дикого типа ( левая панель ), но в IEC-RelA — / — целые слои эпителия дистальной кишки в областях с высоким числом иммунных клеток были расщеплены каспазой-3. положительный ( правая панель ). C . Хотя пролиферация у мышей дикого типа была умеренно повышенной, значительное увеличение количества BrdU-меченых клеток было очевидным у мышей IEC-RelA — / — , обработанных DSS, по данным иммуногистохимии. D , Количественное определение BrdU-меченых клеток подтверждает, что отсутствие RelA в воспаленной ткани приводит к значительному увеличению количества пролиферирующих эпителиальных клеток ( n = 6 мышей и ≥152 крипт в расчете на один генотип) (∗, p < 0,05, если не указано иное).

RelA требуется для восстановления монослоя эпителиальных клеток после острого воспаления

Активность

NF-κB облегчает миграцию эпителиальных клеток и может опосредовать эффективные реакции заживления ран (20, 21). Таким образом, мы предположили, что потеря RelA в кишечнике приведет к прогрессирующему заболеванию и повреждению тканей из-за неспособности эпителиального монослоя восстанавливаться и ограничивать распространение воспаления. Мы поместили мышей на 3% DSS на 5 дней, а затем предоставили им воду для дополнительного 5-дневного периода восстановления.Гистологическая характеристика подтвердила, что мыши IEC-RelA — / — имели тяжелую травму (рис. 7⇓ A ). Потеря RelA приводила к большим изъязвлениям и широко распространенной потере крипт, тогда как эпителий контрольных мышей из однопометника обнаруживал значительное расширение крипт и имел меньше крупных изъязвлений (рис. 7– B ). С помощью иммуногистохимии мы обнаружили, что спорадические области возобновления роста эпителия у мышей IEC-RelA — / — не экспрессировали RelA (данные не показаны), что указывает на то, что он не является абсолютно необходимым для размножения эпителиальных стволовых клеток.Кульминационные эффекты значительного и раннего повреждения слизистой оболочки в сочетании с плохой реституцией эпителиального монослоя после удаления DSS были замечены в повышенной смертности мышей IEC-RelA — / — по сравнению с контролем (рис. 7– C ). Более внимательное изучение показало, что эпителий мышей IEC-RelA — / — продолжал подвергаться повышенным уровням апоптоза (фиг. 7⇓, D и E ). Примечательно, что количественная оценка тяжести заболевания и уровней апоптоза у мышей IEC-RelA — / — по сравнению с контрольными животными может быть значительно занижена из-за снижения выживаемости мышей, лишенных IEC RelA.В совокупности эти данные предполагают, что RelA требуется для защиты эпителиального монослоя на начальных стадиях повреждения слизистой оболочки, а также во время восстановления слоя эпителиальных клеток. Однако обратите внимание, что низкая выживаемость мышей IEC-RelA — / — может быть результатом как более обширного начального DSS-опосредованного повреждения, так и продолжающейся потери эпителиальных клеток в результате апоптоза, факторов, которые не могут быть преодолены повышенной пролиферацией IEC. .

РИСУНОК 7.

Плохое восстановление RelA-нулевого эпителия приводит к тяжелому повреждению слизистой оболочки и смерти.Мышам давали 3% DSS в течение 5 дней, а затем воду в течение дополнительных 5 дней, а затем анализировали. A , Значительные признаки возобновления роста эпителия были отмечены у мышей дикого типа ( левая панель ), но у животных IEC-RelA — / — наблюдались тяжелые изъязвления и потеря крипт с лишь спорадическими признаками восстановления IEC в сильно воспаленных областях ( правая панель ). B , Тяжесть заболевания у мышей, которым вводили DSS и давали возможность восстановиться, предполагает продолжающуюся потерю эпителиальных клеток у мышей IEC-RelA — / — ( n = 7 на генотип; *, p <0.05). C , Тяжелое начальное повреждение слизистой оболочки и плохое восстановление приводят к снижению выживаемости у мышей IEC-RelA — / — ( n ≥ 18 мышей на генотип). D , Число апоптотических (расщепленных каспазо-3-позитивных) эпителиальных клеток повышено у животных IEC-RelA — / — ( n = 3 мыши на генотип с шестью полями, подсчитанными на мышь). E , Апоптоз присутствует у контрольных мышей из однопометника ( левая панель, ), но серьезное истощение слоя эпителиальных клеток происходит из-за повышенной гибели клеток у мышей IEC-RelA — / — ( правая панель ).

Обсуждение

Сигнальная система NF-κB / IKK представляет собой привлекательную терапевтическую мишень, основанную на ее критической роли в воспалительных заболеваниях кишечника. Однако недавняя работа предполагает, что блокирование активности IKK может иметь самые разные результаты в разных типах клеток, с его потерей в активированных иммунных клетках, подавляющих воспаление за счет снижения продукции цитокинов, и эпителиально-специфической абляции, вызывающей нарушение барьера, вызванное апоптозом, и инициирование воспаления слизистой оболочки ( 14, 40, 51).Кроме того, по мере роста количества субстратов IKK становится ясно, что субъединицы IKK обладают как про-, так и противовоспалительными функциями, а также являются независимыми от NF-κB мишенями (3, 52, 53, 54, 55). Более того, определение наилучшего подхода к терапевтическому манипулированию этим сигнальным путем при кишечном заболевании затруднено из-за отсутствия тканеспецифичного генетического удаления субъединиц NF-κB в кишечнике. Используя мышей, лишенных RelA в эпителиальных клетках кишечника, мы представляем данные, указывающие на то, что RelA-опосредованная активность NF-κB важна для контроля пролиферативного и апоптотического гомеостаза в кишечнике.Мы также показываем, что, несмотря на наличие активности c-Rel / p50, экспрессия ряда генов-мишеней NF-κB, участвующих в врожденном иммунитете, у животных IEC-RelA — / — теряется. Доказательства чувствительности этих животных к кишечной патологии можно увидеть в повышенных уровнях перинатальной болезни и гибели мышей IEC-RelA — / — , а также в чувствительности взрослых животных к химически индуцированному колиту. Эти данные подтверждают защитную роль эпителиальной активности RelA / NF-κB во время острого кишечного воспаления, но также имеют значение для его пригодности в качестве мишени для лекарственного средства из-за его функциональной важности для поддержания нормальной физиологии покоящегося, здорового кишечника.

Важной механистической основой катастрофического кишечного фенотипа, наблюдаемого у некоторых новорожденных мышей IEC-RelA — / — , может быть потеря скоординированной регуляции обратной связи IκB / NF-κB. Мы демонстрируем низкие уровни белков IκBαβ в IEC, лишенных RelA, а также повышенную ядерную локализацию и ДНК-связывающую активность c-Rel / p50. Основная роль IκBα и IκBβ заключается в блокировании ДНК-связывающего потенциала NF-κB, и очевидно, что эти белки необходимы для скоординированной активации и дезактивации генов (6, 7, 56).Например, потеря IκBα приводит к устойчивой активности NF-κB in vitro, а также к широко распространенному воспалительному заболеванию у мышей (4, 6, 57). Поддержание достаточного уровня активности IκB может быть особенно важно в кишечном эпителии, где толерантность к лигандам PRR посредством должным образом контролируемой активности NF-κB, вероятно, опосредуется стабилизацией IκB (17, 58, 59). В развивающемся эпителии мышей и недоношенных детей низкие уровни белка IκBα / β являются предполагаемой движущей силой дерегуляции активности NF-κB, повышенной продукции цитокинов и неконтролируемого воспаления при некротическом энтероколите (12, 60).Хотя наши данные согласуются с повышенной экспрессией c-Rel / p50-опосредованного провоспалительного гена, вызывающего заболевание кишечника у мышей IEC-RelA — / — , существуют и другие возможности. Например, обычно безобидный неонатальный стресс, наряду с потерей RelA-опосредованной экспрессии антимикробных и антиапоптотических генов в созревающем кишечнике, может привести к усиленному апоптозу слоя эпителиальных клеток. Последующая потеря барьерной функции может привести к увеличению воздействия на иммунные клетки слизистой оболочки содержимого просвета и неконтролируемому воспалению кишечника, аналогичному тому, которое наблюдается у мышей, у которых отсутствует экспрессия IEC IKKγ / NEMO (14).Основное различие между описанными здесь мышами IEC-RelA — / — и недавно опубликованными животными IEC-IKKγ / NEMO — / — в отношении частоты спонтанного воспаления может заключаться в наличии компенсаторных c-Rel-опосредованных экспрессия антиапоптотического гена, которая в отсутствие стохастического события, инициирующего заболевание в раннем возрасте, делает возможным относительно незатронутый IEC-RelA — / — рост животных (22). Дополнительная работа будет необходима для определения последствий делеции RelA в неонатальных энтероцитах во время начальной координации врожденных и адаптивных иммунных ответов слизистой оболочки.Понимание функции эпителиального RelA, а также других субъединиц NF-κB в развивающемся кишечнике может иметь прямое отношение к патогенезу некротического энтероколита.

Наши данные ясно демонстрируют, что у взрослых животных IEC RelA / NF-κB играет защитную роль во время воспаления кишечника, и это, вероятно, происходит посредством регуляции экспрессии антиапоптотических генов и заживления ран. Снижение продукции двух защитных интерлейкинов, которые экспрессируются в IEC, IL-18 и IL-11, может иметь сильные эффекты на антиапоптоз и реституцию слизистой у мышей IEC-RelA — / — .Животные, лишенные IL-18, восприимчивы к DSS-индуцированному колиту из-за плохого восстановления слизистой оболочки и неспособны повышать уровень IL-11, установленного гена-мишени для передачи сигналов IL-18 (44, 61). IL-11, в свою очередь, сильно увеличивается во время экспериментального колита, а экспрессия рецептора IL-11 в кишечнике в основном обнаруживается в IEC. Активация передачи сигналов Akt с помощью IL-11 в эпителии толстой кишки обладает мощной антиапоптотической активностью (45, 61). Кроме того, потеря экспрессии Bcl-x L в IEC новорожденных и взрослых мышей IEC-RelA — / — согласуется с повышенными базальными уровнями апоптоза, которые мы наблюдали у этих животных.Возможно, что c-Rel компенсирует потерю RelA при базовой экспрессии некоторых антиапоптотических генов-мишеней NF-κB, таких как cFLIP, XIAP и сурвивин. Необходима дальнейшая работа, чтобы определить, превзойдена ли в условиях значительного стресса повышенной продукции цитокинов и повреждения ДНК, связанного с экспериментальным мышиным колитом (62, 63), способность c-Rel обеспечивать некоторую степень экспрессии антиапоптотических генов, что приводит к широкому распространению гибель эпителиальных клеток.

IEC-RelA — / — у мышей, получавших DSS, наблюдается значительный апоптоз IEC, что приводит к плохому разрешению повреждения слизистой оболочки кишечника, что часто приводит к гибели животных.Эти данные очень похожи на данные, наблюдаемые при специфическом для кишечника удалении субъединиц IKK. Мыши, лишенные IKKβ в кишечном эпителии, имеют более тяжелое воспаление и изъязвление в ответ на стимуляцию DSS, что коррелирует с усилением апоптоза и потерей экспрессии Bcl-x L (40). Мы сообщаем здесь о большом увеличении пролиферации слоя эпителиальных клеток RelA-null в ответ на воспаление. Кажется вероятным, что, как было показано ранее на гепатоцитарно-нулевых мышах IKKβ, пролиферативный ответ у животных IEC-RelA — / — может быть вторичным по отношению к повышенному JNK-индуцированному апоптозу (64).Хотя он присутствует на гораздо более низких уровнях, умеренно повышенный апоптоз IEC, наблюдаемый у необработанных мышей IEC-RelA — / — , напоминает тот, который, как считается, инициирует колит у мышей с подавленной эпителиальной экспрессией IKKγ / NEMO. Однако существенное различие между мышами, лишенными IKKβ или IKKγ / NEMO в IEC, и описанными здесь мышами IEC-RelA — / — заключается в продолжающемся присутствии не сниженной активности комплекса IKK, снижении белков IκB и измененном c-Rel / p50 NF. -κB транскрипционный потенциал.Это может быть особенно актуально в свете хорошо изученной роли c-Rel в пролиферации и онкогенезе (65). Соответственно, повышенный пролиферативный ответ и неконтролируемое воспаление, наблюдаемые у мышей IEC-RelA — / — , предполагают, что RelA может играть важную роль в инициации опухоли в кишечнике и может иметь решающее значение в контексте колоректального рака, связанного с колитом.

Становится все более очевидным, что сигнальный путь IKK / NF-κB является важным медиатором гомеостаза слизистой оболочки.Снижение эпителиальной активности IKK и, как мы показали, делеция RelA / NF-κB приводит к нарушению экспрессии антимикробных и антиапоптотических генов, повышенной пролиферации и гибели клеток эпителия и восприимчивости к воспалению кишечника. В совокупности очевидно, что активность IKK / NF-κB в кишечном эпителии необходима для подавления воспаления, вызванного микрофлорой, в раннем возрасте, а также для эффективных иммунных ответов слизистой оболочки на инфекцию и травму у взрослых животных. Хотя ингибирование NF-κB и его вышестоящих сигнальных киназ может быть высокоэффективным средством уменьшения тяжести активного хронического воспаления, потеря экспрессии NF-κB-опосредованного гена в эпителиальных клетках может иметь пагубные последствия для инициации, а также возможное разрешение воспалительного заболевания.

Благодарности

Мы благодарим д-ра Даниэлу Бассерес за техническую помощь и полезные обсуждения, д-ра Дэна Вигинтона и Мэри Дузинг за реактивы и д-р. Митчеллу Коэну, Ли Денсону и Кристиану Джобину за комментарии к рукописи.

Раскрытие информации

У авторов нет финансового конфликта интересов.

Footnotes

  • Затраты на публикацию этой статьи были частично покрыты за счет оплаты страницы.Таким образом, данная статья должна быть помечена как реклама в соответствии с 18 U.S.C. Раздел 1734 исключительно для указания этого факта.

  • ↵1 Эта работа была частично поддержана грантами Американского онкологического общества, Американского фонда Крона и колита и Пилотного гранта P30 DK34987 (для KAS), Центра биологии желудочно-кишечного тракта и болезней Университета Северной Каролины, и грантами Национальных институтов здравоохранения R01 AI35098, R01 CA73756 и R01 CA75080 (А.С.Б.). A.S.B. является исследователем Фонда исследования рака Сэмюэля Ваксмана.

  • ↵2 Адрес для переписки и перепечатки запросов на перепечатку д-ру Альберту С. Болдуину, Комплексный онкологический центр Линебергера, Медицинский факультет Университета Северной Каролины, Чапел-Хилл, Северная Каролина, 27599. Адрес электронной почты: abaldwin {at} med.unc .edu или д-р Крис А. Стейнбрехер, Медицинский центр детской больницы Цинциннати, Университет Цинциннати, Цинциннати, Огайо 45229. Адрес электронной почты: Kris.Steinbrecher {at} cchmc.org

  • №3 Сокращения, использованные в этой статье: IKK, IκB kinase; DAPA, анализ связывания белков сродства ДНК; Defcr, криптдин, связанный с дефенсином; DSS, декстрансульфат натрия; IEC, эпителиальная клетка кишечника; PRR, рецептор распознавания образов; Reg, регенерирующий белок островкового происхождения; TSLP, лимфопоэтин стромы тимуса; XIAP, X-связанный ингибитор апоптоза.

  • Получено 7 августа 2007 г.
  • Принято 1 декабря 2007 г.
  • Авторское право © 2008 Американская ассоциация иммунологов

Ссылки

  1. Перкинс, Н.Д., Т. Д. Гилмор. 2006. Хороший полицейский, плохой полицейский: разные лица NF-κB. Смерть клетки отличается. 13: 759-772.

  2. Hayden, M. S., S. Ghosh. 2004. Сигнализация к NF-κB. Genes Dev. 18: 2195-2224.

  3. Лоуренс Т., М. Бебьен, Г. Ю. Лю, В. Низет, М. Карин. 2005. IKKα ограничивает активацию макрофагов NF-κB и способствует разрешению воспаления. Природа 434: 1138-1143.

  4. Hoffmann, A., T. H. Leung, D. Baltimore. 2003. Генетический анализ факторов транскрипции NF-κB / Rel определяет функциональные особенности. EMBO J. 22: 5530-5539.

  5. Санджаби, С., К. Дж. Уильямс, С. Саккани, Л. Чжоу, А. Хоффманн, Г. Гош, С. Герондакис, Г. Натоли, С. Т. Смейл. 2005. Субдомен c-Rel, ответственный за повышенную аффинность связывания ДНК и селективную активацию генов.Genes Dev. 19: 2138-2151.

  6. Хоффманн, А., А. Левченко, М. Л. Скотт, Д. Балтимор. 2002. Модуль передачи сигналов IκB-NF-κB: временной контроль и селективная активация генов. Наука 298: 1241-1245.

  7. Тергаонкар В., Р. Г. Корреа, М. Икава, И. М. Верма. 2005. Определенные роли белков IκB в регуляции конститутивной активности NF-κB. Nat. Клетка. Биол. 7: 921-923.

  8. Карин, М., Т. Лоуренс, В. Низет. 2006. Врожденный иммунитет пошел наперекосяк: связь микробных инфекций с хроническим воспалением и раком. Ячейка 124: 823-835.

  9. Стробер, В., И. Фусс, П. Маннон. 2007. Фундаментальные основы воспалительного заболевания кишечника. J. Clin. Вкладывать деньги. 117: 514-521.

  10. Понда, П. П., Л. Майер. 2005. Эпителий слизистой в здоровье и болезни. Curr. Мол. Med. 5: 549-556.

  11. Karrasch, T., C. Jobin. 2007. NF-κB и кишечник: друг или враг ?. Воспаление. Кишечник. 14: 114-124.

  12. Claud, E. C., L. Lu, P. M. Anton, T. Savidge, W. A. ​​Walker, B.J. Cherayil. 2004. Регулируемая в процессе развития экспрессия IκB в кишечном эпителии и восприимчивость к воспалению, индуцированному флагеллином. Proc. Natl. Акад. Sci. США 101: 7404-7408.

  13. Fichtner-Feigl, S., I. J. Fuss, J. C. Preiss, W. Strober, A. Kitani. 2005. Лечение мышиного Th2- и Th3-опосредованного воспалительного заболевания кишечника с помощью олигонуклеотидов-ловушек NF-κB. J. Clin. Вкладывать деньги. 115: 3057-3071.

  14. Nenci, A., C. Becker, A. Wullaert, R. Gareus, G. van Loo, S. Danese, M. Huth, A. Nikolaev, C. Neufert, B. Madison, et al. 2007. Эпителиальный NEMO связывает врожденный иммунитет с хроническим воспалением кишечника. Nature 446: 557-561.

  15. Zaph, C., AE Troy, BC Taylor, LD Berman-Booty, KJ Guild, Y. Du, EA Yost, AD Gruber, MJ May, FR Greten, et al. 2007. IKK-β, присущий эпителиальным клеткам. экспрессия регулирует иммунный гомеостаз кишечника. Nature 446: 552-556.

  16. Кобаяси, К. С., М. Шамайяр, Ю. Огура, О. Хенегариу, Н. Инохара, Г. Нуньес, Р. А. Флавелл. 2005 г.Nod2-зависимая регуляция врожденного и адаптивного иммунитета в кишечном тракте. Наука 307: 731-734.

  17. Ли, Дж., Дж. Х. Мо, К. Катакура, И. Алкалай, А. Н. Рукер, Ю. Т. Лю, Х. К. Ли, К. Шен, Г. Кожокару, С. Шенуда и др. 2006. Поддержание гомеостаза толстой кишки с помощью отличительных апикальная передача сигналов TLR9 в эпителиальных клетках кишечника. Nat. Клетка. Биол. 8: 1327-1336.

  18. Фуката, М., KS Michelsen, R. Eri, LS Thomas, B. Hu, K. Lukasek, CC Nast, J. Lechago, R. Xu, Y. Naiki, et al 2005. Толл-подобный рецептор-4 необходим для кишечной реакции к повреждению эпителия и ограничению бактериальной транслокации на мышиной модели острого колита. Являюсь. J. Physiol. 288: G1055-G1065.

  19. Ракофф-Нахум, С., Дж. Паглино, Ф. Эслами-Варзане, С. Эдберг, Р. Меджитов. 2004. Распознавание комменсальной микрофлоры толл-подобными рецепторами необходимо для гомеостаза кишечника.Ячейка 118: 229-241.

  20. Egan, L.J., A. de Lecea, E. D. Lehrman, G.M Myhre, L. Eckmann, M. F. Kagnoff. 2003. Активация ядерного фактора-κB способствует восстановлению поврежденных монослоев кишечного эпителия. Являюсь. J. Physiol. 285: C1028-C1035.

  21. Karrasch, T., K. A. Steinbrecher, B. Allard, A. S. Baldwin, C. Jobin. 2006. Индуцированное раной p38MAPK-зависимое фосфорилирование гистона h4 коррелирует с повышенной экспрессией СОХ-2 в энтероцитах.J. Cell. Physiol. 207: 809-815.

  22. Инан, М. С., Толмачева В., К. С. Ван, Д. В. Розенберг, К. Джардина. 2000. Фактор транскрипции NF-κB участвует в регуляции обновления эпителиальных клеток в толстой кишке. Являюсь. J. Physiol. 279: G1282-G1291.

  23. Tomczak, M. F., S. E. Erdman, T. Poutahidis, A. B. Rogers, H. Holcombe, B. Plank, J. G. Fox, B.H. Horwitz. 2003 г.NF-κB необходим в системе врожденного иммунитета для подавления вызванного микрофлорой колита и экспрессии IL-12 p40. J. Immunol. 171: 1484-1492.

  24. Tomczak, M. F., M. Gadjeva, Y. Y. Wang, K. Brown, I. Maroulakou, P. N. Tsichlis, S.E. Erdman, J. G. Fox, B.H. Horwitz. 2006. Дефектная активация ERK в макрофагах, лишенных субъединицы p50 / p105 NF-κB, ответственна за повышенную экспрессию IL-12 p40, наблюдаемую после заражения Helicobacter hepaticus .J. Immunol. 176: 1244-1251.

  25. Karrasch, T., J. S. Kim, M. Muhlbauer, S. T. Magness, C. Jobin. 2007. Гнотобиотический IL-10 — / — ; NF-κB Мыши EGFP выявили критическую роль передачи сигналов TLR / NF-κB в колите, индуцированном комменсальными бактериями. J. Immunol. 178: 6522-6532.

  26. Lotz, M., D. Gutle, S. Walther, S. Menard, C. Bogdan, M. W. Hornef. 2006. Постнатальное приобретение толерантности к эндотоксинам в кишечных эпителиальных клетках.J. Exp. Med. 203: 973-984.

  27. Бег, А. А., В. К. Ша, Р. Т. Бронсон, С. Гош, Д. Балтимор. 1995. Эмбриональная летальность и дегенерация печени у мышей, лишенных компонента RelA NF-κB. Nature 376: 167-170.

  28. Алкамо, Э., Н. Хакоэн, Л. К. Шульте, П. Д. Реннерт, Р. О. Хайнс, Д. Балтимор. 2002. Потребность в члене семейства NF-κB RelA в развитии вторичных лимфоидных органов.J. Exp. Med. 195: 233-244.

  29. Мэдисон, Б. Б., Л. Данбар, X. Т. Цяо, К. Браунштейн, Э. Браунштейн, Д. Л. Гумусио. 2002. Цис-элементы гена виллина контролируют экспрессию в ограниченных доменах вертикальной (крипта) и горизонтальной (двенадцатиперстная кишка, слепая кишка) осей кишечника. J. Biol. Chem. 277: 33275-33283.

  30. Weiser, M. M .. 1973. Синтез гликопротеина мембраны поверхностной мембраны кишечных эпителиальных клеток: I.Индикатор клеточной дифференциации. J. Biol. Chem. 248: 2536-2541.

  31. Флинт, Н., Ф. Л. Коув, Г. С. Эванс. 1991. Низкотемпературный метод выделения эпителия тонкой кишки по оси крипта-ворсинка. Биохим. J. 280: 331-334.

  32. Steinbrecher, K. A., W. Wilson, III, P. C. Cogswell, A. S. Baldwin. 2005. Киназа гликоген-синтазы 3β функционирует, чтобы специфицировать ген-специфичную, NF-κB-зависимую транскрипцию.Мол. Клетка. Биол. 25: 8444-8455.

  33. Mahler, M., I.J.Bristol, E.H. Leiter, A.E. Workman, E.H.Birkenmeier, C.O. Elson, J.P.Sundberg. 1998. Дифференциальная восприимчивость инбредных линий мышей к колиту, индуцированному декстрансульфатом натрия. Являюсь. J. Physiol. 274: G544-G551.

  34. Купер, Х. С., С. Н. Мурти, Р. С. Шах, Д. Дж. Седергран. 1993. Клинико-патологическое исследование экспериментального мышиного колита декстрансульфата натрия.Лаборатория. Вкладывать деньги. 69: 238-249.

  35. Hogan, SP, L. Seidu, C. Blanchard, K. Groschwitz, A. Mishra, ML Karow, R. Ahrens, D. Artis, AJ Murphy, DM Valenzuela, et al. 2006. Резистин-подобная молекула β регулирует врожденная функция толстой кишки: целостность барьера и восприимчивость к воспалениям. J. Allergy Clin. Иммунол. 118: 257-268.

  36. Штайнбрехер, К. А., С. А.Ваук, Дж. А. Рудольф, Д. П. Витте, М. Б. Коэн. 2002. Нацеленная инактивация гена гуанилина мыши приводит к измененной динамике пролиферации эпителия толстой кишки. Являюсь. J. Pathol. 161: 2169-2178.

  37. Бенс, М., А. Богданова, Ф. Клюзо, Л. Микероль, С. Кернейс, Дж. П. Краехенбуль, А. Кан, Э. Принго, А. Вандевалле. 1996. Трансиммортализованные кишечные клетки мыши (m-ICc12), которые поддерживают фенотип крипт. Являюсь. J. Physiol.270: C1666-C1674.

  38. Hayden, M. S., A. P. West, S. Ghosh. 2006. NF-κB и иммунный ответ. Онкоген 25: 6758-6780.

  39. Бишнупури, К. С., К. Луо, Н. Мурму, К. В. Хоучен, С. Анант, Б. К. Дикграфе. 2006. Reg IV активирует сигнальный путь рецептора эпидермального фактора роста / Akt / AP-1 в аденокарциномах толстой кишки. Гастроэнтерология 130: 137-149.

  40. Гретен, Ф.Р., Л. Экманн, Т. Ф. Гретен, Дж. М. Парк, З. В. Ли, Л. Дж. Иган, М. Ф. Кагнофф, М. Карин. 2004. IKKβ связывает воспаление и онкогенез на мышиной модели рака, ассоциированного с колитом. Ячейка 118: 285-296.

  41. Кэш, Х. Л., К. В. Уизэм, К. Л. Берендт, Л. В. Хупер. 2006. Симбиотические бактерии — прямая экспрессия кишечного бактерицидного лектина. Наука 313: 1126-1130.

  42. Хертлейн, Э., Дж. Ван, К. Дж. Ладнер, Н. Баккар, Д. К. Гаттридж. 2005. Регулирование IκBβ с помощью RelA / p65. Мол. Клетка. Биол. 25: 4956-4968.

  43. Писарро, Т. Т., Ф. Коминелли. 2007. Цитокиновая терапия болезни Крона: достижения в трансляционных исследованиях. Анну. Rev. Med. 58: 433-444.

  44. Такаги, Х., Т. Канаи, А. Окадзава, Ю. Киши, Т. Сато, Х. Такаиши, Н. Иноуэ, Х. Огата, Ю. Ивао, К.Hoshino, et al. 2003. Противопоставление IL-12 и IL-18 развитию декстран-натрийсульфатного колита у мышей. Сканд. J. Gastroenterol. 38: 837-844.

  45. Кисслинг, С., Г. Мюллер-Ньюен, С.Н. Лееб, М. Хаусманн, Х.К. Рат, Дж. Стратер, Т. Споттл, К. Шлоттманн, Дж. Гроссманн, Ф.А. Монтеро-Джулиан и др. 2004. Функциональный экспрессия α-цепи рецептора интерлейкина-11 и доказательства антиапоптотических эффектов в эпителиальных клетках толстой кишки человека.J. Biol. Chem. 279: 10304-10315.

  46. He, B., W. Xu, PA Santini, AD Polydorides, A. Chiu, J. Estrella, M. Shan, A. Chadburn, V. Villanacci, A. Plebani, et al. 2007. Кишечные бактерии вызывают T клеточно-независимый иммуноглобулин A 2 переключение класса путем индукции секреции цитокина APRIL эпителиальными клетками. Иммунитет 26: 812-826.

  47. Морто, О., С. Г. Морхэм, Р. Селлон, Л. А. Дилеман, Р. Лангенбах, О. Смитис, Р. Б. Сартор. 2000. Нарушение защиты слизистой оболочки от острого повреждения толстой кишки у мышей, лишенных циклооксигеназы-1 или циклооксигеназы-2. J. Clin. Вкладывать деньги. 105: 469-478.

  48. Браун, С. Л., Т. Э. Риль, М. Р. Уокер, М. Дж. Геске, Дж. М. Доэрти, В. Ф. Стенсон, Т. С. Стаппенбек. 2007. Myd88-зависимое расположение Ptgs2-экспрессирующих стромальных клеток поддерживает пролиферацию эпителия толстой кишки во время повреждения.J. Clin. Вкладывать деньги. 117: 258-269.

  49. М. Фуката, А. Чен, А. Клеппер, С. Кришнаредди, А. С. Вамадеван, Л. С. Томас, Р. Сюй, Х. Иноуэ, М. Ардити, А. Дж. Данненберг, М. Т. Абреу. 2006. Cox-2 регулируется Toll-подобным рецептором-4 (TLR4): роль в пролиферации и апоптозе в кишечнике. Гастроэнтерология 131: 862-877.

  50. Тесснер, Т. Г., С. М. Кон, С.Schloemann, W. F. Stenson. 1998. Простагландины предотвращают снижение пролиферации эпителиальных клеток, связанное с повреждением декстран-сульфатом натрия у мышей. Гастроэнтерология 115: 874-882.

  51. Шибата В., С. Маэда, Ю. Хикиба, А. Янаи, Т. Омаэ, К. Сакамото, Х. Накагава, К. Огура, М. Омата. 2007. Передовые технологии: ингибитор киназы IκB (IKK), пептид NEMO-связывающего домена, блокирует воспалительное повреждение при колите у мышей. J. Immunol.179: 2681-2685.

  52. Тудхоуп, С. Дж., М. К. Кэтли, П. С. Фенвик, Р. Э. Рассел, В. Л. Рамси, Р. Ньютон, П. Дж. Барнс, Л. Е. Доннелли. 2007. Роль IκB киназы 2, но не активации NF-κB, в высвобождении лигандов CXCR3 из IFN-γ-стимулированных эпителиальных клеток бронхов человека. J. Immunol. 179: 6237-6245.

  53. Wegener, E., A. Oeckinghaus, N. Papadopoulou, L.Lavitas, M. Schmidt-Supprian, U. Ferch, T. W. Mak, J. Ruland, V. Heissmeyer, D. Krappmann. 2006. Важная роль IκB киназы β в ремоделировании комплексов Carma1-Bcl10-Malt1 при активации Т-клеток. Мол. Клетка. 23: 13-23.

  54. Hu, MC, DF Lee, W. Xia, LS Golfman, F. Ou-Yang, JY Yang, Y. Zou, S. Bao, N. Hanada, H. Saso, et al. 2004. Киназа IκB способствует онкогенезу через ингибирование вилочной головки FOXO3a. Ячейка 117: 225-237.

  55. Lee, S., C. Andrieu, F. Saltel, O. Destaing, J. Auclair, V. Pouchkine, J. Michelon, B. Salaun, R. Kobayashi, P. Jurdic, et al. 2004. Киназа IκB β-фосфорилирует серины Dok1 в ответ на TNF, IL-1 или γ-излучение. Proc. Natl. Акад. Sci. США 101: 17416-17421.

  56. Aguilera, C., R. Hoya-Arias, G. Haegeman, L. Espinosa, A. Bigas. 2004. Рекрутирование IκBα на промотор hes1 связано с репрессией транскрипции.Proc. Natl. Акад. Sci. США 101: 16537-16542.

  57. Клемент, Дж. Ф., Н. Р. Райс, Б. Д. Кар, С. Дж. Аббонданцо, Г. Д. Пауэрс, П. Х. Бхатт, К. Х. Чен, К. А. Розен, К. Л. Стюарт. 1996. Дефицит IκBα приводит к устойчивому ответу NF-κB и тяжелому широко распространенному дерматиту у мышей. Мол. Клетка. Биол. 16: 2341-2349.

  58. Нейш, А.С., А.Т. Гевирц, Х. Зенг, А.Н. Янг, М.Э. Хоберт, В. Кармали, А. С. Рао, Дж. Л. Мадара. 2000. Прокариотическая регуляция эпителиальных ответов путем ингибирования убиквитинирования IκB-α. Наука 289: 1560-1563.

  59. Wu, G.D., N. Huang, X. Wen, S.A. Keilbaugh, H. Yang. 1999. Высокий уровень экспрессии I каппа B-бета в поверхностном эпителии толстой кишки: доказательства иммуномодулирующей роли in vitro. J. Leukocyte Biol. 66: 1049-1056.

  60. Нантакумар, Н.Н., Р. Д. Фусунян, И. Сандерсон, В. А. Уокер. 2000. Воспаление в развивающемся кишечнике человека: возможный патофизиологический вклад в некротический энтероколит. Proc. Natl. Акад. Sci. США 97: 6043-6048.

  61. Рейтер, Б. К., Т. Т. Писарро. 2004. Комментарий: роль системы IL-18 и других членов суперсемейства IL-1R / TLR в врожденном иммунитете слизистой оболочки и патогенезе воспалительного заболевания кишечника: друг или враг ?.Евро. J. Immunol. 34: 2347-2355.

  62. Tardieu, D., J. P. Jaeg, J. Cadet, E. Embvani, D. E. Corpet, C. Petit. 1998. Декстрансульфат увеличивает уровень биомаркера окислительного повреждения ДНК, 8-оксо-7,8-дигидро-2′-дезоксигуанозина, в слизистой оболочке толстой кишки крысы. Cancer Lett. 134: 1-5.

  63. te Velde, A. A., F. de Kort, E. Sterrenburg, I. Pronk, F. J. Ten Kate, D. W. Hommes, S.Дж. Ван Девентер.

Написать ответ

Ваш адрес email не будет опубликован. Обязательные поля помечены *